导读:本文包含了菌毛抗体论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:鼠伤寒沙门氏菌,菌毛,FimA,适配体
菌毛抗体论文文献综述
周佳琪[1]（2019）在《鼠伤寒沙门氏菌菌毛蛋白FimA特异性适配体及多克隆抗体的制备研究》一文中研究指出鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)是一种人畜共患病肠道致病细菌,可引起肠胃炎、伤寒、痢疾等疾病。由鼠伤寒沙门氏菌引起的病例全球可见,分布广泛,特别是在贫困地区,由其感染造成的发病率和死亡率更是高居不下,给人类生活健康造成极大威胁,而形成细菌菌膜是其感染难以根除的主要原因之一。菌毛是细菌表面的一些丝状附属物,其在病原菌感染机体形成菌膜的初始黏附,菌膜发展甚至细菌间的信号传递等过程中均有重要作用。适配体是能与靶标特异性结合的寡核酸片段,其在靶向给药治疗细菌或细菌菌膜感染等方面有极大应用前景,因此,本文以鼠伤寒沙门氏菌菌毛蛋白为靶标,筛选其特异性适配体,为靶向治疗细菌或细菌菌膜感染奠定基础。此外,为进一步探究菌毛影响菌膜发展的分子机制,以菌毛蛋白为抗原,制备其多克隆抗体。具体工作如下:(1)FimA蛋白是鼠伤寒沙门氏菌Ⅰ型菌毛的主要结构单位,对实现其菌毛的功能有重要意义。本实验通过构建pET-28a-fimA重组质粒,将重组质粒导入表达细菌,并成功诱导表达。经纯化浓缩,得到纯度较高的重组蛋白FimA,用Bradford法测得其浓度为1.594 mg/mL,达到后续实验要求。(2)适配体(Aptamer)是经指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选得到的,与靶标具有高亲和力与特异性结合能力的寡核酸片段。本部分以鼠伤寒沙门氏菌菌毛蛋白FimA为靶标,筛选得到其特异性适配体。经验证分析,筛选得到的适配体对靶标菌具有较强的亲和力,达到29.8±7.88 nM,且具有较好的特异性。(3)本部分以纯化的鼠伤寒沙门氏菌菌毛蛋白FimA为抗原,免疫3只小鼠,得到其多克隆抗体。经间接酶联免疫吸附(ELISA)实验测其抗血清效价,其中两只小鼠抗血清效价达到1:64000,另一只小鼠抗血清效价达到1:32000。此外,用Western blot检验其特异性,结果表明,多克隆抗体特异性较好。(本文来源于《湖南师范大学》期刊2019-06-01）
王雪吟,布日额,陈金龙,王金良,吴金花[2]（2019）在《牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿AP_1-AP_2-BP基因亚单位抗体的制备》一文中研究指出目的构建牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a亚单位重组抗原AP_1-AP_2-BP,并制备其多亚单位抗体,为后期研制新型免疫疫苗和检测试剂提供实验基础。方法利用延伸PCR技术构建了AP_1-AP_2-BP叁联基因,并将该串联基因进行转化,诱导,表达,纯化,并将纯化蛋白制作为抗原,对家兔免疫,制备多亚单位抗体,并通过亲和层析的方式从免疫后的血清中获得纯化的IgG,完成多亚单位抗体的制备。结果 AP_1-AP_2-BP叁基因串联重组工程菌株通过诱导、表达,对产物亲和层析等方法获得的纯化蛋白,其相对分子质量为65 kDa,其含量达到3.3 mg/mL,并具有较好的免疫原性。经间接ELISA可知,经过4周的免疫抗体的滴度已达到1∶5 600的水平。通过Protein A280测量数据表明,纯化后的IgG的含量高达9.1 mg/mL。结论牛乳腺炎无乳链球菌的菌毛岛屿AP_1-AP_2-BP叁基因串联重组工程菌经诱导、表达后获得的纯化蛋白AP_1-AP_2-BP多亚单位抗原有较好的免疫原性,为制备相应多亚单位抗体的制备提供了良好的多价抗原,同时为将研制新型工程疫苗及检测试剂提供了科学研究基础。(本文来源于《中国人兽共患病学报》期刊2019年03期）
杨溢,杨玮枫,张东,孟霞,潘夏雨[3]（2018）在《抗沙门菌PEG菌毛单克隆抗体的制备及初步临床应用》一文中研究指出为制备抗沙门菌PEG菌毛单克隆抗体(MAb),本研究从鸡白痢沙门菌(CVCC526)基因组中扩增菌毛蛋白基因peg A,将其克隆至原核表达载体pET-22b(+)中构建重组质粒pET-peg A,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白rPegA。应用该蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经间接ELISA筛选后获得1株稳定分泌MAb的杂交瘤细胞株,命名为3D12,抗体亚类鉴定其属于IgG1亚类,腹水效价为1∶64 000。通过western blot和玻板凝集试验检测结果显示,该MAb与肠炎沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌呈阳性反应,而与鼠伤寒沙门菌、大肠杆菌CE2、CE7、CE53、DH5α均不发生反应。以PEG菌毛MAb建立玻板凝集方法,检测本实验室临床分离保存的72份禽源沙门菌,同时以商品化沙门菌诊断血清作为平行对照,结果两种方法符合率达97.2%。本研究研制的MAb可用于沙门菌PEG菌毛基础研究和快速检测。(本文来源于《中国预防兽医学报》期刊2018年05期）
张海霞[4]（2018）在《抗人神经菌毛素1b结构域单克隆抗体的制备及其抑制血管生成作用初探》一文中研究指出神经菌毛素1(Neuropilin1,NRP1)作为一种跨膜糖蛋白在轴突导向,血管生成和肿瘤免疫等多种反应过程中发挥着重要的作用。研究发现,NRP1是血管内皮生长因子(VEGF)的非酪氨酸激酶受体,促进VEGF与其受体(VEGFR)的结合,对血管生成具有极大的促进作用,其中b1b2结构域是其与VEGF165的主要结合位点。研究发现,NRP1高表达于多种肿瘤细胞表面,尤其是上皮细胞肿瘤。阻断NRP1不仅能直接对肿瘤细胞的迁移及肿瘤的发生发展产生抑制作用,而且能够阻断其与VEGF165的结合,间接抑制肿瘤局部血管的生成与发展,继而影响肿瘤的生长发展。因此,NRP1有望成为抗肿瘤治疗的新突破点。本研究首先通过PCR技术得到人NRP1 b结构域(HuNRP1b)的编码序列,并将其克隆入原核表达载体,经表达、纯化后,获得重组HuNRP1b蛋白;将重组HuNRP1b蛋白免疫小鼠,制备出抗HuNRP1b单克隆抗体(McAb)。随后,采用体内、体外实验分析McAbs结合肿瘤细胞的能力及抑制血管生成的活性,为其后续的抗肿瘤研究提供基础。一.重组HuNRP1 b结构域蛋白的获得利用PCR方法得到HuNRP1b的编码基因,构建重组质粒pET30a-HuNRP1b,经双酶切和测序验证后将质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,构建重组表达菌BL21(pET30a-HuNRP1b)。经0.6 mM/L IPTG进行低温诱导,SDS-PAGE分析融合蛋白His-HuNRP1b的表达。经变性、复性、纯化等步骤制备可溶的重组蛋白。经SDS-PAGE分析,融合蛋白His-HuNRP1b成功获得表达、纯化,浓度约为3.0mg/ml。二.制备抗HuNRP1 b结构域单克隆抗体并分析其生物学特性选取8wkBalb/c鼠,将上述获得的纯化蛋白His-HuNRP1b进行小鼠腹部皮下免疫,100μg/只,免疫3次,间隔2wk。第一次免疫,将纯化His-HuNRP1b与等体积完全弗氏佐剂混合,充分乳化后在小鼠腹部皮下进行多点注射。再次免疫,佐剂更换为不完全弗氏佐剂,抗原、剂量、免疫途径均同上。1wk后,取小鼠眼眶下静脉丛血,检测其血清效价,取效价高者进行加强免疫。加强免疫时,采用尾静脉直接注射不加任何佐剂的His-HuNRP1b。3 d后取免疫鼠脾脏,制备单细胞悬液,与sp2/0-Ag-14骨髓瘤细胞融合,ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株。将阳性杂交瘤细胞株经过2-3次亚克隆后得到稳定的单克隆细胞株,小鼠腹腔注射法制备腹水McAbs。采用Western-Blot、间接免疫荧光法(IFA)、细胞免疫化学(ICC)、免疫组织化学法(IHC)研究McAbs的生物学特性。本研究共获得4株腹水McAbs,分别为1H4、2G7、3H4、8G9,它们的ELISA效价依次为 1:256 000、1:64 000、1:256 000、1:128 000,亚类分别为:IgG2b、IgG1、IgG2b、IgG2b。Western-Blot鉴定结果显示,McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)只与融合蛋白HuNRP1b结合而不与空载体表达菌结合,在36 kDa的位置出现特异性条带;且该McAbs可以与高表达天然HuNRP1的乳腺癌细胞株(MCF-7、BT474、SK-BR-3、MDA-MB-231)结合,在大小约120 kDa的位置有特异性条带。表明本研究所获得的McAbs不仅可以识别重组HuNRP1 b结构域蛋白而且可以识别全长的HuNRP1。IFA结果表明,McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)可以与人脐静脉内皮细胞(HUVEC),人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231、MCF-7)及人白血病细胞株(k562)结合,观察到亮绿色荧光,表明所获得的McAbs均能够特异性识别天然的HuNRP1。ICC结果显示,McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)作用于HUVEC细胞及MDA-MB-231细胞时,在胞膜及胞浆内可见棕褐色信号,其中McAbs:2G7、3H4、8G9结合能力较强。4株McAbs采用IHC实验分析临床样本的结果表明,在9例乳腺癌样本中McAbs分析发现有6例呈HuNRP1阳性;7例肺癌样本中有3例呈阳性;3例食管癌及3例肾癌均呈阳性,这与商品化的抗用HuNRP1抗体检测结果一致。表明获得的McAbs可以特异性识别肿瘤细胞及肿瘤组织中的HuNRP1。叁.抗HuNRP1 b结构域单克隆抗体抑制血管生成活性的研究运用Transwell小室迁移实验,分析McAbs对HUVEC细胞的迁移的影响。在小室的下室加入10ng/ml VEGF165,上室分别加入终浓度为50 ng/孔的McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9)阻止细胞向下迁移,每组设叁个复孔,同时设PBS组作为对照。实验结果显示,McAbs(1H4、2G7、8G9)相对于PBS组细胞迁移抑制率约为15%,3H4组未表现出抑制作用。运用Matrigel体外成管实验分析McAbs对HUVEC细胞体外成管的影响,细胞接种后,每孔加入10 ng/ml VEGF165刺激细胞成管,实验孔加入McAbs(1H4、2G7、8G9),50ng/孔,设PBS孔作对照,继续培养6h,镜下观察细胞成管情况,发现PBS组的HUVEC细胞可以形成明显管状结构,而McAbs组大部分细胞仍附于Matrigel表面生长,抑制率约为10%,体外实验表明McAbs(1H4、2G7、8G9)对于局部血管生成具有一定的抑制作用。利用鸡胚尿囊膜血管生成实验,进一步分析McAbs对新生血管发生发展的影响。以硅胶环作为载体在健康发育的鸡胚内血管生长相对不丰富位置分别放入McAbs(1H4、2G7、3H4、8G9),保持终浓度为100 ng/枚,同时设终浓度为100 μg/枚的地塞米松组作为阳性对照,设PBS100μL/枚作为阴性对照。结果显示,McAbs(1H4、8G9)组及地塞米松组鸡胚绒毛尿囊膜血管的生长受到了明显的抑制,但McAbs(2G7、3H4)组抑制效果较不明显。最后,采用SCID小鼠体内种植Matrigel小体实验研究McAb对动物体内血管的生成的抑制作用。将100μgMcAb1H4、5×106MCF-7细胞与500μ1Matrigel混匀,于SCID小鼠腹部皮下注射。6天后取出小鼠体内种植的Matrigel小体,观察小体内血管的发育情况,并对其进行包埋、制成切片,通过苏木素-伊红(HE)染色及IHC方法进一步分析Matrigel小体内血管的发育。HE染色和IHC实验发现McAb 1H4可以干扰Matrigel小体内MCF-7细胞对小体内血管生成的吸引作用。综上所述,本研究成功制备出4株抗HuNRP1bMcAb,且具有识别天然HuNRP1的能力。其中,McAbs 1H4、2G7、8G9具有一定的体外抑制HUVEC迁移及成管能力,其中McAb 1H4具有体内抑制肿瘤血管生成的能力。该特异性McAb的获得为研究靶向抑制肿瘤部位血管生成及肿瘤的发生、发展提供了生物材料。(本文来源于《扬州大学》期刊2018-04-05）
戴华,戴长松,张海霞,沈颖[5]（2018）在《人神经菌毛素1 b结构域单克隆抗体的制备及其抑制血管生成作用》一文中研究指出目的:制备抗人神经菌毛素1(human neuropilin 1,Hu NRP1)b结构域单克隆抗体(monoclonal antibodies,m Ab),为靶向抑制肿瘤血管生成提供生物材料。方法:运用杂交瘤技术,将Hu NRP 1 b结构域重组蛋白(TF-Hu NRP1b)免疫BALB/c鼠,共免疫3次,取免疫鼠的脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合,采用间接免疫荧光法(immunofluorescent assay,IFA)筛选稳定分泌抗Hu NRP1bm A,以Western blot、IFA、流式细胞术分析m Ab的特异性。以MTT法及小室迁移实验分析m Ab抑制血管生成的能力。结果:获得1株稳定分泌抗Hu NRP1bm Ab的细胞株4F11。Western blot结果表明,本研究所获得的m Ab 4F11只与重组Hu NRP1b发生反应,与对照蛋白不发生反应;IFA及流式细胞分析结果表明,所获得的m Ab能够识别肿瘤细胞MDA-MB-231、Hep G2以及人脐静脉内皮细胞表达的天然Hu NRP1蛋白;MTT法及小室迁移实验表明,所获得的m Ab 4F11具有抑制人脐静脉内皮细胞增殖、迁移的能力。结论:成功制备出抗Hu NRP1b的m Ab,该m Ab的获得将为进一步研究Hu NRP1的功能及靶向抑制肿瘤血管生成提供生物材料。(本文来源于《南京医科大学学报(自然科学版)》期刊2018年03期）
戴华,张海霞,王美玲,葛凡,沈颖[6]（2017）在《人神经菌毛素1的b1b2结构域(HuNRP1~b)蛋白单克隆抗体的制备》一文中研究指出目的制备人神经菌毛素1的b1b2结构域(Hu NRP1b)蛋白,研制抗Hu NRP1b单克隆抗体(m Ab)。方法将Hu NRP1b的编码基因克隆入p ET22b载体,构建重组表达质粒p ET-Hu NRP1b,经酶切、测序鉴定正确后转化大肠杆菌并进行诱导表达,SDS-PAGE分析重组Hu NRP1b蛋白(r Hu NRP1b,His-Hu NRP1b)的表达。将获得的His-Hu NRP1b免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0细胞融合,以融合表达可溶性标签"触发因子"(TF)的重组蛋白TF-Hu NRP1b建立检测抗Hu NRP1bm Ab的间接ELISA,筛选阳性杂交瘤细胞株;以ELISA、Western blot法分析m Ab的特异性,以间接免疫荧光法(IFA)鉴别m Ab识别天然蛋白的能力。结果 His-Hu NRP1b得到成功表达;获得2株稳定分泌抗Hu NRP1bm Ab的细胞株(1A10、6A2)。Western blot结果显示m Ab与表达r Hu NRP1b的重组菌反应,分别在相对分子质量(Mr)34 000(His-Hu NRP1b)及Mr89 000(TF-Hu NRP1b)处出现特异性条带,而与空载体表达菌不反应,说明m Ab特异性针对r Hu NRP1b;IFA结果表明,所获得的m Ab能够识别乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞表面表达的天然Hu NRP1蛋白,说明m Ab具有识别天然的Hu NRP1的能力。结论成功制备了小鼠抗Hu NRP1bm Ab。(本文来源于《细胞与分子免疫学杂志》期刊2017年09期）
杨玮枫[7]（2016）在《抗沙门氏菌PEG菌毛单克隆抗体的研制及初步临床应用》一文中研究指出沙门氏菌广泛分布在自然界中,为革兰氏阴性菌,是肠杆菌科属中重要的人畜共患病原菌。目前已确认的沙门氏菌血清型高达2600多种。在畜禽生产养殖中,沙门氏菌污染一直是不可忽视的问题,其中肠炎沙门氏菌(S.enteritidis)和鸡-雏沙门氏菌(S.gallinarum-pullorum)是禽类养殖中沙门氏菌污染的常见血清型,可引起产蛋鸡生产性能下降、肉鸡逐渐消瘦和雏鸡大量死亡等危害,对养殖业造成巨大的经济损失。本文研究D群沙门氏菌中肠炎沙门氏菌和鸡-雏沙门氏菌特异表达的PEG菌毛,通过PCR扩增该菌毛主要亚单位pegA基因,构建原核表达系统并制备PEG菌毛单克隆抗体,利用玻板凝集方法快速检测肠炎沙门氏菌和鸡-雏沙门氏菌,为判断禽沙门氏菌污染提供依据。本文分叁部分进行研究论述：研究一：沙门氏菌PEG菌毛主要亚单位基因pegA的原核表达。根据GenBank中PEG菌毛的全基因序列,设计一对针对菌毛主要亚单位pegA的特异性引物,以鸡白痢沙门氏菌CVCC 526基因组为模板,利用PCR扩增技术大量获得pegA目的基因。基因片段克隆入pMD19-T载体,测序结果表明序列大小为531 bp,符合预计大小且序列未突变。为制备并纯化重组蛋白,将pegA基因片段克隆入带有HIS标签的原核表达载体pET-22b (+)中,构建重组质粒pET-22b (+)-pegA。将筛选好的重组质粒pET-22b (+)-pegA转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,获得大小约为23 KDa的可溶性蛋白。表达的重组蛋白经镍柱试剂盒纯化后,获得浓度约0.83 mg/mL的纯化重组蛋白,命名为rPegA。通过SDS-PAGE和Western blot分析蛋白条带大小和反应特异性,确定制备的融合蛋白为预期目的蛋白。研究二：抗沙门氏菌PEG菌毛单克隆抗体的制备。将表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,在细胞融合和叁次亚克隆筛选后获得3株稳定分泌的单克隆杂交瘤细胞株,分别命名为1D10,3D12和484。这叁株杂交瘤细胞经液氮冻存后复苏,连续传代后效价未降低,稳定性良好。间接ELISA方法测定单抗腹水效价3D12为1：64000。Western blot检测结果表明制备的单克隆抗体均能特异性的与重组蛋白、肠炎沙门氏菌CMCC50336,鸡白痢沙门氏菌CVCC526和鸡伤寒沙门氏菌T63发生反应,而与鼠伤寒沙门氏菌T14和大肠杆菌DH5a均不发生反应。玻板凝集试验结果表明,单抗腹水可以与肠炎沙门氏菌50336,鸡白痢沙门氏菌CVCC 526和鸡伤寒沙门氏菌T63凝集成阳性反应,而与鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌DH5a不产生凝集现象。说明本试验制备的PEG菌毛单克隆抗体具有良好的特异性。研究叁：沙门氏菌PEG菌毛单克隆抗体的初步临床应用。以PEG菌毛单克隆抗体建立玻板凝集方法,若玻板凝集试验呈阳性,表明被检菌液中含有肠炎沙门氏菌和／或鸡-雏沙门氏菌,反之则无。PEG菌毛单克隆抗体作为检测抗体,玻板凝集方法检测本实验室分离保存的72份沙门氏菌样本,共检测出43份阳性样品；沙门氏菌诊断血清作为平行对照,共检测出45份鸡-雏沙门氏菌和肠炎沙门氏菌阳性样品。沙门氏菌诊断血清和PEG单克隆抗体玻板凝集结果符合率为95.6%(43/45)。本试验研制的沙门氏菌PEG菌毛单克隆抗体介导的玻板凝集方法,对禽养殖业中肠炎沙门氏菌和鸡-雏沙门氏菌的检测和净化有潜在应用价值。(本文来源于《扬州大学》期刊2016-06-01）
王美玲[8]（2016）在《抗人神经菌毛素1 b1b2区单克隆抗体的制备及其单链抗体原核表达菌的制备》一文中研究指出神经菌毛素-1 (Neuropilin-1; NRP1)是一种多功能的非酪氨酸激酶受体,可结合III类神经轴突导向因子(SEMA 3)介导神经系统的发育,同时,通过与血管内皮生长因子(VEGF)结合调节血管的生成,尤其是在肿瘤的发生、发展中发挥重要的作用。NRP1由胞外区、跨膜区、胞内区组成,目前发现其胞外区的功能更为重要,胞外区分为a1a2、b1b2、c结构域,VEGF165主要通过与NRP1胞外区blb2结构域结合发挥作用。因此,本课题组通过基因工程技术克隆得到人NRP1 b1b2 (HuNRP1b1b2)结构域cDNA并表达其重组蛋白,通过杂交瘤技术获得特异性针对HuNRP-1b1b2单克隆抗体(McAbs)并初步分析其生物学功能发现其可以与天然NRP1结合并且能够抑制内皮细胞的迁移以及脐静脉内皮细胞的体外成管。选择有生物学活性的杂交瘤细胞株通过基因工程技术提取mAb的重链及轻链编码基因,构建含抗人神经菌毛素单链抗体(single chain Fragment variable, ScFv)编码基因的重组载体并进行原核表达。目的：构建抗HuNRP1b1b2单克隆抗体并研究其生物学活性,制备单链抗体原核表达菌,为进一步研究HuNRP1b1b2生物学的功能提供生物材料。方法：①克隆HuNRP1b1b2区的编码基因并对其进行蛋白表达；②制备抗HuNRP-1b1b2的mAb并分析其生物学特性；③提取阳性杂交瘤细胞株的总RNA,采用反转录PCR(RT-PCR)方法获取抗HuNRP1b1b2重链可变区(Heavy Variable, VH)及轻链可变区(Light Variable,VL)的基因序列；④用重迭PCR (overlap-PCR)方法获取抗HuNRP1b1b2 ScFV序列；⑤通过双酶切及定向克隆技术把ScFV克隆到噬菌粒pCANTAB5E载体,构建重组质粒pCANTAB5E-ScFV;⑥将重组的质粒转化入大肠杆菌TG1菌。结果：①获得人神经菌毛素1的blb2区蛋白,大小约34 kDa。②获得稳定分泌抗HuNRP1b1b2 McAbs细胞株,命名为6A2与1A10。③单克隆抗体能够识别天然NRP1,可有效抑制HUVEC的迁移并对HUVEC的体外成管能力具有一定的抑制作用。④通过噬菌体表面展示技术,初步获得HuNRP1b1b2单链抗体。结论：获得HuNRP1b1b2单克隆抗体,且单克隆抗体具有与天然NRP1的结合能力,并且能够抑制脐静脉内皮细胞的体外成管。通过噬菌体表面展示技术,初步获得HuNRP1b1b2单链抗体,为进一步研究HuNRP1的生物学功能垫下基础。(本文来源于《扬州大学》期刊2016-04-08）
魏永峰,杨振泉,高璐,饶胜其,尹永祺[9]（2016）在《鼠李糖乳杆菌菌毛SpaA亚基的表达、抗体制备及其种属特异性研究》一文中研究指出【目的】制备鼠李糖乳杆菌菌毛亚基Spa A多克隆抗体,研究其种属特异性。【方法】应用PCR方法从鼠李糖乳杆菌GG的基因组扩增出spa A,并连接到质粒p ET-28α(+)中。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达和镍柱纯化制备重组SpaA。通过免疫BALB/c小鼠获得多克隆抗体,利用全菌ELISA、Western和Dot-blot分析了SpaA在18株乳酸菌(12个种)中的分布特征。【结果】表达的重组SpaA分子量为36 k D,与预期大小一致;获得的Spa A抗体效价为1:12 800。Western结果显示抗体与天然Spa A具有良好的反应性。在测定的18株乳酸菌中,鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌3个种属菌株的spa A基因PCR和RT-PCR检测均为阳性。但全菌ELISA和Dot-blot结果显示,只有3株鼠李糖乳杆菌的全菌细胞与SpaA抗体呈特异性反应,而其它种属的菌株没有明显的交叉反应。【结论】尽管spa A基因在鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌中具有高度同源性,但SpaA蛋白只特异性地呈现在鼠李糖乳杆菌细胞表面。本研究中获得的Spa A抗体,为高黏附性鼠李糖乳杆菌的免疫磁珠分离及菌毛功能研究提供了工具。(本文来源于《微生物学通报》期刊2016年06期）
张留君[10]（2015）在《动物源性粪肠球菌ebp菌毛基因的保守性及其多克隆抗体的制备》一文中研究指出粪肠球菌是医院内和动物感染的重要病原体,对人、畜健康和食品安全构成严重的威胁。一般认为肠道表皮屏障是细菌性病原体侵入的优先入口,黏附并定植到肠上皮细胞是其感染的关键步骤。菌毛在革兰氏阴性和阳性细菌的感染中起着关键的作用,但动物源性粪肠球菌ebp菌毛基因的携带情况、保守性以及它的致病作用还不清楚。本研究通过对动物源性粪肠球菌的ebp基因分布情况、保守性进行分析,并原核表达ebp菌毛蛋白,制备高效价、高特异性的多克隆抗体,以分析其致病作用和免疫原性,从而为动物源性粪肠球菌感染的预防和治疗打下良好的基础。使用Nallapareddy等人所描述的引物,采用PCR方法对2006年至2011年间从河南省不同地区分离的50株动物源性粪肠球菌ebp基因的携带情况进行检测,结果显示50株动物源性粪肠球菌全部携带ebpABC基因。再根据GenBank上已发表的粪肠球菌OG1RF株的ebp基因序列,使用Primer Premier 5.0设计ebpABC全基因引物,对10株动物源性粪肠球菌ebp菌毛蛋白的编码基因进行PCR扩增,产物经胶回收试剂盒纯化回收,与pMD18-T载体连接,转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中,筛选阳性克隆进行测序。然后应用DNASTAR(5.0版本)软件将测定出的10株动物源性粪肠球菌的ebp基因序列进行比对分析,并与粪肠球菌OG1RF株的ebp基因序列进行比较,结果显示测定的10株动物源性粪肠球菌之间ebpA、ebpB和ebpC基因DNA序列的同源性分别为98.0%-100%、98.8%-100%和99.0%-100%,所推导的氨基酸序列的同源性分别为98.4%-100%、98.2%-100%和98.7%-100%。10株菌与GenBank上已发表的人临床粪肠球菌OG1RF株相比,ebp基因DNA序列的同源性为98.2%-99.7%,所推导的氨基酸序列的同源性为98.5%-99.8%。由此可见,ebp基因在动物源性粪肠球菌中广泛分布且高度保守,并且与人源粪肠球菌的同源性也较高。使用生物信息学软件对粪肠球菌EbpA蛋白和EbpC蛋白的抗原表位进行预测,综合各软件的分析结果后将ebpA基因分成3段来表达,分别命名为ebpA1、ebpA2和ebpA3,将ebpC基因分成2段来表达,分别命名为ebpC1和ebpC2。然后,根据GenBank上已发表的粪肠球菌OG1RF株的ebpA和ebpC基因序列,设计5对带有合适酶切位点的引物,以提取的猪源粪肠球菌N9株的基因组DNA为模板分别扩增出ebpA1、ebpA2、ebpA3、ebpC1和ebpC2基因片段,大小分别为1167 bp、1098 bp、963 bp、981 bp和891 bp,扩增ebpB基因(EF1092A)所使用的引物引用Jouko Sillanpaa等人所描述的(酶切位点有改动),目的片段大小为1233 bp。将所扩增出的6个基因片段分别克隆到原核表达载体pET-28a中,构建了重组表达质粒pET-28a-ebpA1、pET-28a-ebpA2、pET-28a-ebpA3、pET-28a-ebpC1、pET-28a-ebpC2和pET-28aEF1092A(ebpB),经测序验证6个重组质粒均构建成功。将重组质粒转化到表达菌大肠杆菌BL21(DE3)中,在IPTG的诱导下均成功表达,获得了分子量大小分别约为46.7 kDa、45.0kDa、39.4 kDa、39.3 kDa、36.0 kDa和50.0 kDa的重组蛋白,与预期的目的蛋白分子量相符。通过优化表达条件,大量表达重组蛋白,用尿素法和镍柱对表达的蛋白进行纯化获得了高纯度的重组蛋白。使用6种已纯化的重组蛋白作为免疫原分别免疫新西兰大白兔,制备抗重组蛋白的多克隆抗体,经双向免疫琼脂扩散实验检测抗体效价分别为1:16、1:8、1:32、1:32、1:64和1:64。将多克隆抗体进行免疫印迹,结果显示制备的多抗可以与各自的重组蛋白特异性结合。而且,在多克隆抗体阻止野生菌株的生物膜生成实验中,当抗EbpA3蛋白IgG的终浓度为0.1875mg/mL时,粪肠球菌N9株的生物膜生成量最少,此数值与阴性对照值差异显着(P<0.05),表明抗EbpA3蛋白的IgG能够抑制粪肠球菌N9株生物膜的生成。(本文来源于《河南农业大学》期刊2015-06-01）
菌毛抗体论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的构建牛乳腺炎无乳链球菌菌毛岛屿PI-2a亚单位重组抗原AP_1-AP_2-BP,并制备其多亚单位抗体,为后期研制新型免疫疫苗和检测试剂提供实验基础。方法利用延伸PCR技术构建了AP_1-AP_2-BP叁联基因,并将该串联基因进行转化,诱导,表达,纯化,并将纯化蛋白制作为抗原,对家兔免疫,制备多亚单位抗体,并通过亲和层析的方式从免疫后的血清中获得纯化的IgG,完成多亚单位抗体的制备。结果 AP_1-AP_2-BP叁基因串联重组工程菌株通过诱导、表达,对产物亲和层析等方法获得的纯化蛋白,其相对分子质量为65 kDa,其含量达到3.3 mg/mL,并具有较好的免疫原性。经间接ELISA可知,经过4周的免疫抗体的滴度已达到1∶5 600的水平。通过Protein A280测量数据表明,纯化后的IgG的含量高达9.1 mg/mL。结论牛乳腺炎无乳链球菌的菌毛岛屿AP_1-AP_2-BP叁基因串联重组工程菌经诱导、表达后获得的纯化蛋白AP_1-AP_2-BP多亚单位抗原有较好的免疫原性,为制备相应多亚单位抗体的制备提供了良好的多价抗原,同时为将研制新型工程疫苗及检测试剂提供了科学研究基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
菌毛抗体论文参考文献
[1].周佳琪.鼠伤寒沙门氏菌菌毛蛋白FimA特异性适配体及多克隆抗体的制备研究[D].湖南师范大学.2019
[2].王雪吟,布日额,陈金龙,王金良,吴金花.牛乳腺炎无乳链球菌PI-2a菌毛岛屿AP_1-AP_2-BP基因亚单位抗体的制备[J].中国人兽共患病学报.2019
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[8].王美玲.抗人神经菌毛素1b1b2区单克隆抗体的制备及其单链抗体原核表达菌的制备[D].扬州大学.2016
[9].魏永峰,杨振泉,高璐,饶胜其,尹永祺.鼠李糖乳杆菌菌毛SpaA亚基的表达、抗体制备及其种属特异性研究[J].微生物学通报.2016
[10].张留君.动物源性粪肠球菌ebp菌毛基因的保守性及其多克隆抗体的制备[D].河南农业大学.2015