一、Micro-IFA检测禽肺病毒抗体（论文文献综述）
李梦妮[1]（2021）在《鸡TLR15受体单克隆抗体的研制及抗原表位的鉴定》文中进行了进一步梳理Toll样受体是一种高度保守的Ⅰ型跨膜糖蛋白模式识别受体,可以识别多种微生物的病原相关分子模式,快速启动免疫应答,在机体的抗感染过程中发挥重要的作用。2006年,Higgs等对鸡的基因组进行生物信息学分析,发现了一个定位于鸡的第三条染色体上特有的基因,将之命名为鸡Toll样受体15（Chicken toll like receptor 15,ChTLR15）。迄今,除邢波建等制备出ChTLR15多克隆抗体外,未见关于ChTLR15单克隆抗体的报道,研制并获得ChTLR15的单克隆抗体（Monoclonal antibody,MAb）对研究其生物学特性与功能,具有重要意义。本研究根据GenBank中发表的ChTLR15基因序列设计引物,利用PCR技术扩增出部分胞外区序列,即编码第162-386位氨基酸（Amino acid,aa）的序列,长度为675 bp,将其克隆至原核表达质粒pET-30a中,构建了重组质粒pET-30a-ChTLR15（162-386aa）,将该重组质粒导入宿主菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导发现ChTLR15（162-386aa）-His主要以包涵体形式表达,蛋白大小约为26kDa,随后采用尿素梯度透析法对其进行复性。通过Ni-NTA亲和层析介质和凝胶过滤层析纯化,获得了高纯度的重组ChTLR15（162-386 aa）-His蛋白,以皮下多点注射方式将其免疫6周龄的雌性Balb/c小鼠,并通过间接酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）确定抗原最适包被浓度为0.35 μg/mL,血清最适稀释度为1:6400。三次免疫后用确立的间接ELISA检测条件测定小鼠效价,效价符合要求后即可取免疫小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。采用杂交瘤细胞技术和有限稀释法,经过3次亚克隆获得4株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2G4、6C7、6D10、7C4。通过Western blot对4株单抗特异性进行鉴定,结果显示4株单抗均能与免疫原蛋白反应。采用间接ELISA及间接免疫荧光（Indirect immunofluorescence,IFA）两种方法同时筛选,ELISA结果显示6C7、6D10反应性较强,2G4、7C4反应性微弱。IFA实验结果显示,2G4、6C7、7C4在可传代的鸡巨噬细胞系HD11及鸡成纤维细胞系DF-1上具有不同强度的荧光反应,却不具备瞬转人源胚胎肾细胞HEK293T（Human emborynic kidney 293T cell,HEK293T）荧光反应性;6D10具备瞬转HEK293T反应性而不具备HD11及DF-1荧光反应性。制备腹水并检测四株单抗的ELISA和IFA效价,结果表明6C7和6D10的腹水ELISA效价分别为1:20480、1:40960,2G4和7C4腹水无ELISA效价;6C7和7C4在传代细胞系HD11及DF-1中腹水IFA效价分别为1:2560、1:5120,而2G4较低,6D10在传代细胞系中无IFA效价;6D10瞬转HEK293T细胞IFA效价为1:320。根据单克隆抗体亚类分型试剂盒对所获得的4株单抗细胞上清进行亚类鉴定,结果显示2G4与6C7亚类为IgG2a、6D10与7C4亚类为IgG1。为确定单克隆抗体所针对的抗原表位,我们采用逐步截短免疫原与单抗进行反应的策略。经过Western blot鉴定,确定单抗2G4与7C4识别的抗原表位为230QLGTVLEF237、6C7与6D10识别的抗原表位为245EMDLLS250。筛选精准的抗原表位可深化对免疫反应的认知,有助于更加准确的使用单抗。利用6C7株单抗对禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）感染鸡的脏器进行免疫组化检测,结果显示感染鸡肝、脾、肺、肾的TLR15表达量增加,而对照组仅有少量TLR15表达。利用6C7株单抗采用激光共聚焦技术观察ChTLR15在HD11细胞中的定位,结果显示ChTLR15蛋白位于细胞表面。本研究制备的单抗具有较好的特异性和反应性,为ChTLR15有关的免疫调节机制研究提供了重要的物质保障,也可为后续抗感染机理的研究奠定基础。
孙晓琦[2]（2021）在《IBV感染鸡PBMCs-Mφ蛋白组学及STING对感染细胞ISGs基因表达及病毒复制的影响》文中进行了进一步梳理鸡传染性支气管炎（IB）是由传染性支气管炎病毒（IBV）引起的一种高度传染性的呼吸道疾病,在全世界广泛流行。IBV属于冠状病毒科冠状病毒属,是一种单股正链RNA病毒。IBV最早是在1930年在美国被发现并报道。由于IBV血清型众多,商业化IBV疫苗有时不能提供很好的交叉免疫保护,从而导致保护效果不佳,造成临床发病而导致巨大的经济损失。因此,深入研究IBV感染中宿主免疫反应机制是十分必要的。巨噬细胞是抵抗微生物感染的重要先天免疫细胞,参与先天免疫应答和适应性免疫应答。巨噬细胞可以识别病原体,并随之启动细胞内各种信号通路,以促进免疫调节分子的生成。目前,对IBV感染巨噬细胞的蛋白组学分析未见报道。干扰素刺激基因（ISGs）,具有抗病原微生物感染的生物活性。其中,ISGs基因抗黏病毒基因（Mx）、干扰素诱导蛋白5（IFIT5）、2’,5’-寡腺苷酸合成酶样蛋白（OASL）能够通过直接靶向病原体生命周期来控制其感染进程。干扰素基因激活蛋白（STING）是一种免疫调节分子。在一些病毒感染过程中,STING可以激活细胞中ISGs表达,抑制病毒复制,参与调控机体内的免疫应答,起到保护机体的作用。本研究在建立IBV感染鸡外周血单个核细胞来源巨噬细胞（PBMCs-Mφ）模型的基础上,应用蛋白组学分析感染前后差异蛋白并对靶蛋白进行定量分析,并通过验证试验,阐明了STING对IBV感染的PBMCs-MφISGs表达及病毒复制的影响。本研究首先提取鸡PBMCs-Mφ,应用流式细胞术鉴定提取的细胞中PBMCs-Mφ占91.3±1.2%,说明提取的细胞可以满足后续试验要求。IBV M41株经过适应传代后,以10 MOI感染PBMCs-Mφ,应用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）、间接免疫荧光技术（IFA）、TCID50法,检测感染不同时间细胞中病毒的含量并绘制病毒生长曲线,明确IBV在PBMCs-Mφ中的生长特性和生命周期。结果表明,IBV可以感染PBMCs-Mφ,并可在感染36 h引起明显CPE、达到病毒复制峰值。在前期研究中,应用qRT-PCR技术检测IBV感染后PBMCs-Mφ基因表达的变化。结果显示,IBV感染早期抑制PBMCs-Mφ中免疫相关基因的表达,随后被激活,并且基因表达的动态变化与病毒复制密切相关。根据上述结果,选择免疫相关基因表达上调且病毒生长速度较快的时间点即感染后24 h提取细胞蛋白,应用蛋白组学分析未感染IBV（Mock组）和感染IBV（IBV组）的PBMCs-Mφ间的差异蛋白并对差异蛋白进行生物信息学分析。结果显示,本试验一共鉴定到5662个蛋白质,其中4921个蛋白质包含定量信息。在定量到的蛋白质中,IBV组与Mock组比较后有114个蛋白表达发生上调,53个蛋白表达发生下调。通过对所有差异表达蛋白的功能分类、功能富集及基于功能富集的聚类分析,结果表明,差异蛋白广泛分布于细胞生命过程中。通过蛋白互作网络结果可知,抗病毒相关ISGs蛋白:Mx、IFIT5、OASL表达显着上调且存在互作关系。同时诱导ISGs生成的干扰素（IFN）通路的关键蛋白STING表达显着上调。以上结果说明,IBV感染PBMCs-Mφ后细胞免疫反应被激活,其中ISGs基因Mx、IFIT5、OASL可能起到重要的抗病毒作用。随后,选择ISGs及STING相关蛋白利用PRM方法验证蛋白组测序结果。结果显示,鉴定的2个蛋白STING和IFIT5与蛋白组测序结果一致,说明本试验中蛋白组学分析结果可靠。最后,为了探究STING是否在IBV感染的PBMCs-Mφ中起到调控ISGs基因Mx、IFIT5、OASL表达以及病毒复制的作用,本研究进行了STING重组真核表达质粒（p3×Flag-cmv-10-STING）的构建、转染条件的摸索、STING-si RNA的筛选。随后,将细胞分为Mock组、IBV组、NC-si RNA+IBV组、STING-si RNA+IBV组、p3×Flag-cmv-10+IBV组、p3×Flag-cmv-10-STING+IBV组,应用qRT-PCR技术、Western Blot技术、TCID50法检测STING基因沉默和过表达对IBV感染PBMCs-Mφ的ISGs表达和病毒复制的影响。结果显示,IBV感染PBMCs-Mφ后Mx、IFIT5、OASL m RNA的表达在感染早期抑制,而后激活。STING可以进一步激活IBV感染PBMCs-Mφ中的Mx、IFIT5、OASL m RNA的表达,并抑制IBV在细胞中的复制。同时,STING可以降低病毒毒力,减轻IBV对IBV易感细胞的伤害。以上结果说明STING可通过调控ISGs的表达而发挥抗病毒作用,并可成为IBV感染中的抗病毒靶点。综上所述,IBV M41株可以在PBMCs-Mφ中适应存活,并可在感染36 h产生CPE。同时,IBV感染PBMCs-Mφ后细胞中蛋白出现表达变化,其中Mx、IFIT5、OASL、STING等抗病毒蛋白表达显着上调。通过干预PBMCs-Mφ中STING的表达,发现STING可以促进IBV感染PBMCs-Mφ中ISGs基因Mx、IFIT5、OASL的表达并抑制细胞中病毒复制。本试验结果为IBV致病机制、免疫防治以及抗病毒药物研究提供新的思路。
方文秀[3]（2021）在《鸡细胞表面受体Nectin4和SLAMF1在NDV感染中的作用》文中指出新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的多种禽类的急性高度接触性传染病。NDV可感染多种禽类动物,具有明显的细胞、组织和宿主嗜性。目前的研究表明,NDV的主要受体是唾液酸或含唾液酸的蛋白,其配体是病毒HN蛋白。然而,唾液酸在禽类组织细胞内的分布情况无法解释NDV的嗜性现象。目前,陆续有学者提出NDV可能存在唾液酸以外的受体。其它副粘病毒的受体包括Nectin4、SLAMF1和CD46等,对NDV粒子表面糖蛋白HN进行结构预测分析,发现HN头部区侧面存在可能与Nectin4和SLAMF1结合活性区域。因此,我们对鸡Nectin4和SLAMF1在NDV感染中的作用开展了以下研究:首先,开展NDV利用唾液酸以外受体吸附入侵细胞的可能性研究。使用广谱性唾液酸消化药物预处理细胞后,唾液酸酶并不能完全阻断对NDV的感染。病毒与宿主细胞结合过程中可能涉及除唾液酸以外的其它受体。然后,扩增获得了鸡Nectin4和SLAMF1。本研究尝试了鸡的不同来源细胞和组织样品,最终在CEF中扩增得到鸡Nectin4和SLAMF1基因。经比对,扩增获得的序列确实为鸡Nectin4和SLAMF1完整阅读框,说明这两个基因在鸡细胞中是正常表达的。两个基因连入原核表达载体并诱导表达,最终包涵体形式表达的重组蛋白。将原核表达产物免疫小鼠,得到多克隆抗体,两者在禽类细胞上均具有Western Blotting效价。通过建立标准曲线建立鸡Nectin4和SLAMF1荧光定量PCR检测方法,并检测了不同禽类细胞中Nectin4和SLAMF1的mRNA水平。结果显示,Nectin4在DF-1细胞中mRNA表达水平相对较高,而SLAMF1在免疫细胞中mRNA表达水平相对较高。NDV感染能够刺激CEF中Nectin4和SLAMF1 mRNA水平和蛋白水平的显着上调,表明鸡Nectin4和SLAMF1与NDV感染具有一定的相关性。为了研究NDV感染后Nectin4和SLAMF1在鸡体内的变化,将NDV人工感染SFP鸡,检测不同组织脏器中Nectin4和SLAMF1的mRNA水平和蛋白水平的变化。将对照组中的健康鸡数据经统计学分析并绘制柱状图,以得到正常健康鸡组织中Nectin4、SLAMF1的mRNA相对分布。结果表明,Nectin4和SLAMF1在鸡体内的分布与新城疫典型病变呈正相关。感染NDV后,鸡组织细胞中Nectin4和SLAMF1的基因和蛋白表达量在感染最初上调,随着感染时间的增加表现下调。构建的鸡Nectin4、SLAMF1真核表达质粒得到正确表达且在细胞膜上表达。通过转染过表达基因后,在不同细胞上均表现为Nectin4和SLAMF1增强NDV的吸附能力。过表达后感染NDV,qPCR检测上清中的NP以及检测上清TCID50,结果显示Nectin4和SLAMF1可以促进NDV的感染与增殖。通过CRISPR Cas9技术将受体基因敲低后感染NDV,结果显示NDV感染显着减少。将Nectin4、SLAMF1原核表达产物预处理病毒后接种DF-1细胞,通过qPCR检测细胞上清中的NP并检测上清TCID50,结果表明Nectin4和SLAMF1原核表达产物对NDV具有遮蔽作用。利用内源性Co-IP实验研究Nectin4和SLAMF1与NDV相互作用的关系,转染受体蛋白质粒后感染NDV,Co-IP检测到Nectin4和SLAMF1与病毒蛋白的互作。将NDV-HN与NDV-F分别与受体蛋白共转染后进行Co-IP试验,结果表明Nectin4和SLAMF1的配体是HN而非F。综上表明,鸡Nectin4和SLAMF1是NDV与宿主细胞结合过程中除唾液酸以外的受体,两者在鸡体内的分布与NDV的组织嗜性相关,且能够促进NDV的吸附和感染,确定鸡Nectin4和SLAMF1的配体为HN。本文研究了 NDV感染相关的细胞受体,揭示受体差异对于NDV细胞、组织嗜性的影响,为NDV的防制研究奠定理论基础。
王磊[4]（2019）在《牛呼吸道合胞体病毒反向遗传操作系统构建的基础研究》文中提出牛呼吸道合胞体病毒（Bovine respiratory syncytial virus,BRSV）是副黏病毒科、肺病毒亚科、肺病毒属的成员,为有囊膜病毒,其基因组是负链RNA,全长约15000 nt,可转录出10条病毒RNA,并翻译成11种蛋白质,其中9种为结构蛋白、2种为非结构蛋白。BRSV呈世界性分布,在我国的流行也比较普遍。BRSV感染牛如果继发性细菌感染,呼吸系统疾病会更加复杂,是发病牛高度死亡的主要原因,给养牛业带来了巨大的经济损失。疫苗免疫仍是防控该病的有力手段。基于反向遗传技术的病毒基因结构与功能的研究,是揭示BRSV致病机理、免疫保护机制以及病毒的宿主和组织嗜性等相关研究的基础。本研究以BRSV核酸呈阳性的鼻拭子样品LJX31为材料,对BRSV全长基因组进行序列测定,并进行序列同源性及进化树分析,以确定中国流行的BRSV的遗传进化关系。在此基础上构建BRSV反向遗传质粒系统,可用于BRSV反向遗传系统的建立,为BRSV的结构与功能研究奠定基础。全长基因组序列测定和分析结果显示,LJX31全长基因组为15150 nt,5’端非编码区为45 nt,3’端非编码区为161 nt。基因组的编码区位于46-14989 nt,包括NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2和L基因。L基因最大,含有6573 nt;NS2基因最小,含有492 nt;NS1、N、P、M、SH、G、F和M2基因全长依次为527、492、1202、869、950、466、840、1902和960 nt。全长基因组序列比对分析显示,LJX31与美国Atue51908株的同源性为96.4%。LJX31的全长基因组存在13个核苷酸的插入和3个核苷酸的缺失。与Atue51908株相比,NS1、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2和L基因的同源性为92.1-98.5%。对G蛋白的编码基因序列进行同源性和遗传进化分析显示,LJX31与美国毒株V41的同源性最高、亲缘关系最近,同源性达95.1%,表明LJX31可能来源于美国。为构建BRSV LJX31的反向遗传操作系统,分别构建了基因组全长cDNA质粒,以及N、P、L和M2-1蛋白的真核表达质粒;同时,为了增加拯救病毒对细胞的适应性,本研究构建了BRSV受体蛋白CX3CR1的真核表达质粒。N、P、L、M2-1和CX3CR1这5个蛋白表达质粒作为辅助质粒,与全长基因组cDNA质粒共转染BRSV易感细胞,可进行病毒的拯救。本研究同时构建了基于T7启动子和CMV启动子的全长基因组cDNA质粒PVK-LJX31和PCI-LJX31;N、P和M2-1蛋白的编码基因直接克隆至PCI-neo载体,分别构建表达质粒PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1;L蛋白的编码基因经过密码子优化后克隆至p3xflag-CMV载体,构建表达质粒p3xflag-YH-L;CX3CR1蛋白的编码基因采用PCR方法从牛的肺组织中扩增获得,直接克隆至PCI载体,构建表达质粒PCI-CX3CR1。PVK-LJX31、PCI-LJX31、PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1、p3xflag-YH-L和PCI-CX3CR1,经酶切和序列分析确定序列正确,这样BRSV LJX31反向遗传系统所需的遗传元件均获得了相应的重组质粒。采用IFA对PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1、p3xflag-YH-L进行表达验证,结果显示每个质粒转染细胞后,其细胞内表达产物均能与相应的抗体发生反应,表明质粒均能在转染细胞中获得表达。此外,通过微基因组质粒pok（-T7）-W对LJX31基因组的顺式作用元件和调控区以及PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1和p3xflag-YH-L四个辅助质粒的功能进行验证,结果显示,pok（-T7）-W质粒转染细胞后,再用BRSV感染细胞,可在细胞中表达绿色荧光蛋白,表明LJX31基因组的顺式作用元件和调控区是有功能的;而pok（-T7）-W质粒和PCI-N、PCI-P、PCI-M2-1和PCI-YH-L四个辅助质粒共转染细胞时,却不能够在细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达,表明PCI-neo-N、PCI-neo-P、PCI-neo-M2-1和p3xflag-YH-L四个辅助质粒形成RNP复合物的能力、或者RNP复合物的功能有缺陷。综上所述,本研究对BRSV LJX31的全长基因组序列进行测定及分析,并构建了该毒株反向遗传操作系统的遗传元件,包括基因组质粒、辅助质粒及其功能鉴定的方法,为BRSV反向遗传平台的建立打下了坚实的基础。
王贝贝[5]（2018）在《禽偏肺病毒通用型抗原和抗体检测方法的建立》文中认为禽偏肺病毒（avian metapneumovirus,aMPV）是引起鸡和火鸡呼吸系统疾病的一种重要病原体,主要引起禽类的急性上呼吸道感染和感染鸡的肿头综合症,该病还引起产蛋鸡和种鸡的产蛋量和蛋的品质下降,该病的感染率较高且传播性强。当与其他细菌或病毒造成混合感染时,发病禽群的死亡率会大大增加。目前,除澳大利亚之外的大多数养禽国家均有aMPV的报道,对我国和世界养禽业造成很大经济损失。根据遗传进化分析和抗原变异,aMPV目前有A、B、C和D四个亚型。aMPV的诊断方法有病毒分离鉴定、分子生物学方法和血清学方法。已建立的方法中病毒分离鉴定因采样问题和耗时长等问题没有得到广泛的应用;分子生物学方法已经被大量用于实验室的病原检测,但目前报道的方法均是针对aMPV中的12个亚型进行检测。适用于各亚型aMPV的通用型检测方法未见报道;ELISA是检测aMPV抗体的常用方法,商品化的ELISA试剂盒也均是针对某一亚型。能够检测aMPV所有亚型病原和抗体检测方法的建立将有助于对aMPV的流行病学调查和有效防控。为此,本研究在比较aMPV各亚型基因组序列的基础上,设计针对aMPV N基因保守区的特异性引物,建立了一种通用型的Eva Green荧光定量RT-PCR检测方法;同时原核表达各亚型aMPV N蛋白保守区,并以纯化的重组N蛋白作为包被抗原建立了一种检测aMPV特异性抗体的通用型间接ELISA方法。1.禽偏肺病毒通用型Eva Green荧光定量RT-PCR检测方法的建立为建立各亚型禽偏肺病毒（aMPV）的快速检测方法用于我国aMPV感染的流行病学调查,本研究对aMPV 4个亚型的基因组核苷酸序列比对分析,针对aMPV N基因的保守区域设计了一对特异性引物,通过条件优化,建立了检测aMPV各亚型的通用型Eva Green荧光定量RT-PCR方法。结果显示,该方法在模板浓度为103拷贝/u L108拷贝/u L范围内具有良好的线性关系;检测下限为103拷贝/μL,敏感性为常规RT-PCR的10倍。与其它常见禽类病毒无交叉反应;组内重复试验和组间重复试验的变异系数分别为0.891.34%和2.013.29%,具有较好的重复性。利用所建立的方法对河南省部分地区鸡场送检病鸡样品进行检测,结果显示被检地区鸡场的aMPV的平均阳性率为46.66%,与普通RT-PCR的符合率为100%。本研究所建立的Eva Green荧光定量RT-PCR方法可以用于aMPV的检测,为aMPV感染的流行病学调查提供了一种方法。2.禽偏肺病毒（aMPV）N蛋白的原核表达和免疫反应性分析根据aMPV4个亚型的N蛋白氨基酸序列进行分析,并选取N蛋白的高度保守区域,根据大肠杆菌密码子偏好性优化合成基因,之后将其克隆入p ET-32a（+）表达载体,获得重组质粒p ET32-N。通过一系列条件的优化,aMPV-N蛋白表达的最佳条件为在37℃,IPTG浓度为1mmol/L的情况下诱导6 h,重组蛋白以包涵体形式表达,便于纯化目的蛋白。Western blot检测结果表明所表达的N蛋白可以与相应的抗血清发生良好的免疫结合,为aMPV的诊断方法的建立奠定了基础。3.基于N蛋白的禽偏肺病毒通用型间接ELISA抗体检测方法的建立本研究利用在大肠杆菌中表达的aMPV N蛋白作为包被抗原,建立了检测aMPV各亚型抗体的间接ELISA方法。所建立方法的最佳条件为:抗原最适包被量为1μg/孔,包被时间为37℃1h,然后4℃过夜;被检血清的最佳稀释度为1:400,作用时间为2h;二抗选用HRP标记的兔抗鸡Ig Y,稀释度为1:8000,作用时间为1.5 h;显色液TMB作用条件为室温15 min。所建立ELISA的判定标准为:样品的S/P值大于或等于0.234判为阳性,小于0.194判为阴性。用建立的ELISA方法对抗鸡新城疫病毒、禽流感病毒、减蛋综合征病毒阳性血清进行了检测,均无交叉反应,表明该方法有较好的特异性,组内和组间重复的最大变异系数为5.33%和5.34%,所建立的ELISA方法重复性良好。用所建立的ELISA方法对50份来自于疑似肿头综合症病鸡的血清样品进行检测,与RT-PCR病原学检测结果一致性较好。结果表明,本研究所建立的ELISA方法可用于抗aMPV抗体的检测,为aMPV的监测和流行病学调查提供了一种可选方法。
谢军[6]（2018）在《禽流感病毒与新城疫病毒共感染对病毒复制影响及其机理初步研究》文中提出禽流感病毒（Aivan influenza virus,AIV）和新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是严重危害养禽业的两种重要传染病病毒。全球范围内,已发现多例野生禽类AIV和NDV共感染,但共感染对其病毒复制的影响及其机理尚不明确。本研究运用间接免疫荧光激光共聚焦技术、RT-qPCR、免疫印迹技术（WB）和ELISA检测分析了两种病毒共感染鸡成纤维细胞（DF-1）、人非小细胞肺癌细胞（A549）和非洲绿猴肾细胞（Vero）在前期感染（感染一种病毒前6 h,-6 h）、同时感染（两种病毒同时感染,0h）和后期感染（感染一种病毒后6 h,+6 h）三种共感染形式时对其核蛋白（nuclear protein,NP）在蛋白质水平表达的相互影响以及在细胞水平对病毒复制的影响,并对产生机理进行了初步分析,获得以下研究结果:1.NDV 强毒株 Herts/33（NDV）与 AIV 弱毒株 H9N2（AIV）分别感染 DF-1细胞,NDV、AIV感染后12 h可观察到明显细胞病变,24 h后细胞开始出现脱落。Western blot（WB）和RT-qPCR检测表明NDV和AIV均在感染8 h后病毒复制进入对数期,NDV在感染16-24 h后病毒复制进入稳定期,而AIV 8-24 h仍处于对数复制期。结合细胞病变效应结果,确定NDV和AIV感染后12 h和24 h作为共感染研究时间点。2.WB和IFA分析表明DF-1细胞中前期感染组（early infection group,EIG）12 h 时 NDV 显着抑制 AIV 复制（p<0.05）,后期感染组（post infection group,PIG）和同时感染组（concurrent group,CG）中NDV极显着促进AIV复制（p<0.01）,24 h时三个组中NDV均极显着抑制AIV的复制（p<0.001）,表明共感染时NDV能下调AIV复制水平。AIV仅在EIG中抑制NDV复制,CG和PIG中AIV能显着促进NDV复制（p<0.05）,表明共感染时AIV能促进NDV复制。A549细胞中,共感染12时三个组中NDV均显着抑制AIV复制（p<0.05）,24 h时NDV均极显着抑制AIV复制（p<0.001）,表明共感染时NDV抑制AIV复制;除PIG 24 h时AIV显着促进DNV复制（p<0.05）,12 h时三个感染组中AIV极显着抑制NDV复制（p<0.001）,24 h时EIG和CG中AIV极显着抑制NDV复制（p<0.001）。表明AIV和NDV共感染DF-1和A549细胞时两种病毒复制之间存在一定程度相互抑制作用,而Vero细胞中不存在这种抑制作用。3.ELISA检测表明AIV感染A549细胞时IFN-β表达稳定（600～400 pg/mL）,NDV感染时表达自12h后显着提高,24h时保持稳定进入平台期,表达量最高达7758 pg/mL。共感染时NDV对AIV复制影响三个组中干扰素表达量均极显着提高（p<0.001）;AIV对NDV复制影响中EIG和PIG中干扰素表达显着受到抑制（p<0.05）,而CG中干扰素表达显着提高。表明IFN-β参与了 AIV和NDV共感染时对病毒复制的相互抑制。4.运用JAK信号通路抑制剂Ruxolitinib和Tofacitinib处理A549细胞,WB检测表明EIG和CG中药物单独处理或混合处理时NDV均能显着或极显着促进AIV复制,PIG中药物单独处理时AIV复制仍受到抑制,两种药物混合处理能显着提高AIV复制（p<0.05）。AIV对NDV复制影响中EIG中单独或混合使用药物AIV均能显着（p<0.05）或极显着（p<0.001）促进NDV复制,PIG和CG在药物单独处理时AIV能显着抑制NDV复制（p<0.05）,联合用药时却能显着促进AIV复制（p<0.05）。进一步表明IFN-β中的JAK信号通路参与了 AIV和NDV共感染时对病毒复制的相互影响,其复杂机理有待深入研究。
黄琪[7]（2016）在《鸡SP-A单抗制备及其组织病理学研究》文中提出鸡肺表面活性蛋白A（chicken pulmonary surfactant protein A,cSP-A）是鸡肺房上皮细胞分泌的一种亲水性糖蛋白,其基因序列与哺乳动物SP-A有一定的同源性,在机体呼吸系统先天性免疫防御中发挥重要作用,是家禽呼吸系统中最为重要的天然免疫蛋白之一。本研究的主要目标是通过原核系统表达可溶性cSP-A蛋白,制备其单抗;通过建立病毒感染模型,研究cSP-A的组织病理学变化,为cSP-A抗病毒的机制研究和临床应用奠定基础,主要包括以下几方面内容。1.cSP-A可溶性表达及检测将cSP-A全长基因序列插入pCold-TF载体中,构建重组载体pCold-cSP-A,转化到感受态宿主菌BL21（DE3）中,加入不同浓度的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）于16°C中诱导表达24h,经超声波裂解,通过His-bind纯化试剂盒纯化,分别进行SDS-PAGE检测。结果cSP-A蛋白获得可溶性表达,融合蛋白大小为80 KDa。Western Blot结果显示,该蛋白可被特异性多抗识别。抑菌实验显示,与纯化的天然cSP-A蛋白不同,cSP-A原核表达产物并不具备抑菌活性。2.cSP-A单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定利用pCold-cSP-A纯化蛋白作为免疫原,等体积包裹弗氏佐剂,腹腔注射6周龄的BALB/c小鼠,制备抗cSP-A单克隆抗体。用pcDNA3.1-cSP-A真核表达载体转染293T细胞经间接IFA筛选单抗,获得3株单克隆抗体,分别命名为:1D12、2F1和5C8;对3株抗体进行亚型鉴定,3株单抗轻链均为κ,1D12重链为IgG1,2F1和5C8均为IgG2a;经IFA、间接ELISA及Western Blot检测发现:1D12株单抗效价最高,特异性最好。对1D12和5C8株单抗进行抗原表位的鉴定,结果发现两株单抗均针对cSP-A蛋白的45-60aa,属于该蛋白的亲水区。3.cSP-A荧光定量RT-PCR方法的建立及检测设计153bp的cSP-A的qRT-PCR引物,选择cβ-actin（JN639846）为内参基因,以pcDNA3.1-cSP-A重组质粒作为阳性标准品,建立cSP-A的SYBR Green I RT-PCR检测方法,对30日龄SPF鸡的肺、气管、支气管、喉头、气囊、肝、脾、肾、胰、十二指肠、盲肠和法氏囊等组织样品进行qRT-PCR的检测。以法氏囊的Ct值为对照,用2（-ΔΔCt）相对定量PCR法计算分析cSP-A基因在SPF鸡各组织中的相对表达量,用GraphPad Prism 5软件进行统计。结果成功建立了qRT-PCR方法,标准曲线的线性回归方程为Y=-3.5832X+36.07（R2=0.99303）,敏感度检测可达1.58×102拷贝/μL。结果发现:在30日龄SPF鸡的各组织中,cSP-A的表达量依次为:肺、气管、支气管、喉头、气囊、肾脏。此外,肝、脾、胰中有非常少量的表达。4.H9N2流感病毒、新城疫病毒和传染性支气管炎病毒感染SPF鸡对cSP-A表达量的影响设置IBV组、NDV组、H9N2组、IBV和H9N2共感染组、对照组共5组,每组8只4周龄SPF鸡,滴鼻攻毒,对照组为无菌PBS。攻毒后第3天,每组取3只鸡进行肺、气管、支气管、前喉、气囊、肝、脾、肾、胰、十二指肠、盲肠和法氏囊脏器的采集。所有脏器取两份,一份液氮冻存,一份10%福尔马林浸泡。分别用H&E染色,qRT-PCR检测以及免疫组化方法（IHC）检测样本的病理变化以及cSP-A表达量的变化。H&E染色结果显示,对照组鸡各脏器没有明显的病理变化,而各攻毒组鸡各脏器均有不同程度的病变,其中以NDV组最为严重,混合感染组比H9N2单独攻毒组、IBV单独攻毒组病理变化更加明显。qRT-PCR结果显示,与对照组相比,各攻毒组呼吸道中cSP-A表达量均明显下降,且H9N2+IBV共感染组中表达量比单独攻毒组更低。这一结果在免疫组化中再次得到验证。这说明cSP-A也许可作为呼吸道病理损伤的检测指标之一。通过以上实验,本研究成功地在大肠杆菌中表达了cSP-A可溶性蛋白,并制备了较高效价的单克隆抗体,并利用此单抗检测了cSP-A的病理组织学变化,为下一步深入研究c SP-A的抗病毒机制及临床作用研究奠定了基础。
姜莉莉[8]（2014）在《东北地区野生鸟类主要禽免疫抑制病病原感染情况调查及与REV PR相互作用宿主蛋白的筛选》文中指出近年来,禽网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus, REV）与J-亚群禽白血病病毒（Avian Leukosis virus subgroup J, ALV-J）、鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus, CAV）和马立克氏病病毒（Marek’s disease virus, MDV）等几种免疫抑制性病毒的混合感染在养鸡场中普遍存在,使得鸡群免疫力低下,导致针对禽流感、新城疫等重要疫病的疫苗免疫失败,并容易造成继发感染,使疫病的诊断和防控难度加大。其中,有3大病毒性肿瘤病之称的禽白血病（AL）、禽网状内皮组织增生症（RE）和马立克氏病（MD）对禽类健康的危害甚为严重。针对上述病原的分子流行病学研究主要集中于家禽和水禽,很少有关野生鸟类的调查报道,且目前对野生鸟类携带病原的研究主要集中在禽流感病毒和新城疫病毒,国内外尚未见有关野生鸟类禽免疫抑制病病原的流行病学调查报道。野生鸟类作为许多病原携带者和自然宿主,可潜在传播人和动物的重要传染病。随着候鸟的迁徙,携带某些病毒的候鸟可能会将病毒传播到不同的地方而导致疾病的爆发和流行。因此,对野生鸟类进行常见病原的流行病学监测,具有重要的指示意义。为研究野生鸟类感染或携带禽免疫抑制病病原情况,本研究对2010年5月至2012年11月期间收集自东北三省部分地区的野生鸟类样品进行了几种常见禽免疫抑制病病原的分离鉴定及流行情况分析。样品来自于我国东北地区鸟类环志站和野生动物疫源疫病监测站,共收集到野生鸟类样品916份,其中野鸭样品581份；鸟类样品以雀形目的小型鸟为主,共335份。一方面进行了病毒的分离鉴定,调查了几种病原的感染流行情况；另一方面选取有代表性的毒株进行了基因克隆和分子遗传特征分析。1.东北地区野生鸟类几种常见的禽免疫抑制病病原PCR检测常规方法提取野鸟样品的DNA和RNA,用针对以下几种禽免疫抑制病病原的特异性PCR检测方法进行野鸟带毒情况初检：REV, ALV-A （Avian Leukosis virus subgroup A）, ALV-B （Avian Leukosis virus subgroup B）, ALV-J, CAV, MDV,禽传染性法氏囊病病毒（IBDV）以及禽呼肠孤病毒（Avian reovirus, ARV）。实验结果表明野鸟存在REV, ALV-A, ALV-B, ALV-J以及CAV的感染。部分样品检测,没有发现MDV、IBDV和ARV的感染。所有野生鸟类样品的REV PCR阳性检出率为10.7%,其中野鸭阳性率为13.1%,小型鸟阳性率为6.6%；CAV PCR阳性检出率为4.1%；ALV-A PCR阳性检出率为4.35%；ALV-B PCR阳性检出率为6.4%；ALV-JPCR阳性检出率为6.8%；野生鸟类REV、ALV-A、ALV-B和ALV-J携带情况不具明显的季节性,不同种类野鸟的REV和ALV-J阳性检出率有一定差别。其中野鸭REV以针尾鸭阳性检出率最高,小型鸟中以长尾雀阳性检出率最高；ALV-J以凤头潜鸭阳性检出率最高,小型鸟以红肋蓝尾鸲阳性检出率最高。2.东北地区野鸟源REV的分离鉴定及gp90基因遗传演化分析将用REV PCR检测引物初筛为阳性的病料经适当处理后接种敏感细胞DF1培养增殖,进行病毒的分离。经特异性PCR和间接免疫荧光方法（IFA）鉴定,以及电镜检测,确定共分离到10株野鸟源REV,其中2株来源于小型鸟,其余8株分离自野鸭。对鉴定为阳性的REV分离株,对其保护性抗原基因gp90基因进行克隆和序列测定,与GenBank上已发表的REV参考株进行序列比对和分析。测序结果显示10株分离株的gp90大小为1191bp,编码了397个氨基酸；序列分析结果显示：10个REV分离株gp90基因氨基酸序列相似性为92.4%-100%；核苷酸遗传进化分析表明,所比对的序列明显地分三个分枝,每个分枝代表REV的3个不同亚型；10个野鸟源REV分离株与现有的东北分离株亲缘关系较近,位于同一分枝,趋于形成1个北方分离群；与美国和中国台湾地区的某些分离株同源性较高。与170A株和我国早期南方分离株HA9901亲缘关系较远；与SNV株亲缘关系最远。结果说明我国存在Ⅰ、Ⅲ2种亚型的REV，Ⅲ型是目前东北地区的家禽流行毒株,野鸟存在REV感染,且以Ⅲ型REV为主导。该研究首次自野鸟体内分离到REV,证明REV可感染野生鸟类。该研究结果既丰富了REV流行病学资料,同时也提醒我们重视野生鸟类迁徙在疾病传播中所扮演的角色,为深入研究REV致病机制、免疫抑制机制等奠定基础。以提取的DBYR1102前病毒cDNA为模板,分段克隆DBYR1102基因组,并进行测序分析。结果显示,DBYR1102po1基因最保守,gag、pol和env基因氨基酸序列与中国北方禽源分离株相似性较高,属于Ⅲ型REV。3.东北地区野鸟源ALV-J分离鉴定及gp85基因遗传演化分析通过特异性PCR、间接ELISA抗原检测和IFA等方法,确定共分离到6株野鸟源ALV-J,其中4株来自野鸭,2株来源于野生小鸟。克隆6个野鸟源ALV-J分离株的主要保护性抗原基因gp85,并进行序列比对和遗传进化分析,结果发现野鸟源ALV-J分离株gp85基因ORF为921-924bp,分别编码307和308个氨基酸。各毒株gp85基因编码氨基酸序列同源性为81.2%-99.7%。毒株DBYJ1102, DBYJ1103, DBYJ1004和DBYJ106之间表现出高度的序列相似性,与近几年ALV-J蛋鸡分离株的推导氨基酸序列同源性较高,进化树显示处于同一分支,被称为Ⅰ群；而毒株DBYJ1101和DBYJ1105之间相似性较高,与原型株HPRS-103、美国代表毒株UD5以及大多数的肉鸡分离株的推导氨基酸序列表现出较高的同源性,共处于同一分支,被称为Ⅱ群。以上结果表明,6株ALV-J野鸟分离株gp85基因变异较大,其中两株与ALV-J英国肉鸡原型毒株HPRS-103株亲缘关系较近,另外4株与中国近几年蛋鸡分离株亲缘关系较近。提示野鸟毒株的遗传演化变异。4.REV p30蛋白的表达、纯化及间接ELISA检测方法的初步建立扩增REV p30基因,将其克隆至原核表达载体pET-30a（+）中,构建原核表达质粒pET30-p30,转化BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,通过Western blot检测,p30蛋白在表达上清中呈可溶性表达。利用Ni-NTA His Bind Resin纯化重组蛋白,并用蔗糖浓缩重组蛋白,免疫新西兰白兔,制备兔抗p30多抗。SDS-PAGE及western blot结果表明,p30蛋白获得正确表达,表达产物具有良好免疫原性。制备的多克隆抗体的效价约为1：25600,以纯化的重组蛋白作为包被抗原,在包被量为3.2μ g/孔、血清1：250倍稀释条件下,P/N值最大,初步建立了REV抗体间接ELISA检测方法。该研究为REV的检测及p30基因的深入研究奠定了基础。5.酵母双杂交筛选与REV聚合酶PR相互作用的宿主蛋白研究与REV相互作用的宿主细胞蛋白对研究PR蛋白的功能、REV致病性以及感染机制等方面具有重要意义。本研究以REV PR为诱饵蛋白,利用酵母双杂交系统从本实验室构建的鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblast, CEF） cDNA酵母表达文库中筛选得到与REV聚合酶PR相互作用的宿主细胞蛋白,并通过酵母回返验证实验,证明了PR与Snapin在酵母细胞中存在相互作用。本实验构建了pGBKT7-PR酵母双杂交诱饵质粒,转化酵母菌,结果表明诱饵质粒没有自激活活性和毒性。用诱饵质粒筛选CEF cDNA文库,通过对阳性文库质粒插入片段测序分析,得到与PR相互作用的宿主蛋白ATPlB1和Snapin。已有研究表明Snapin蛋白参与细胞多种生化过程,并能发挥抗病毒作用。利用酵母菌Y2H进行回返验证,结果表明在酵母系统中,Snapin和PR存在相互作用。从CEF细胞成功扩增Snapin的基因,构建了带有Flag标签的pCAGGS-Snapin真核表达载体和带有HA标签的pCAGGS-PR真核表达载体。以上结果不仅为进一步通过免疫共沉淀（coimmunoprecipitation, Co-IP）验证PR和Snapin的相互作用提供了依据。同时为深入研究REV与宿主相互作用奠定了基础。
薛聪[9]（2013）在《禽偏肺病毒的分离鉴定及Nested RT-PCR检测方法的建立与应用》文中研究表明禽偏肺病毒（Avian metapneumovirus, aMPV），是家禽常见的呼吸道病原之一。aMPV感染火鸡可引起火鸡鼻气管炎，感染产蛋鸡可导致产蛋率下降、孵化率降低。aMPV也被认为是肉鸡肿头综合征（Swollen head syndrome, SHS）的重要诱发因素之一。aMPV于1978年首次在南非报道之后，欧洲、亚洲等地陆续出现该病毒的相关报道。aMPV可以分为A、B、C、D4个亚型，其中A亚型和B亚型在世界各地广泛报道，C亚型和D亚型分别在美国和法国报道。中国大陆地区仅于1999年报道分离到1株禽偏肺病毒；2007-2008年的血清学调查结果显示山东某些地区种鸡血清学阳性率可达100%；2009-2010年，孙静等利用地高辛标记的核酸探针对山东省部分地区临床健康肉鸡群的多种呼吸道病原进行检测，aMPV检出率高达36.87%，而且多重感染现象严重，aMPV对养禽业的危害不容忽视。本研究使用建立的aMPV Nested RT-PCR检测方法，对aMPV进行了分离鉴定，并对分离株的部分特性进行了初步研究，从而为该病的预防控制提供理论依据。本研究内容主要分为两部分：1、禽偏肺病毒逆转录套式PCR检测方法的建立和应用本研究根据GenBank上发表的B亚型禽偏肺病毒Fusion （F）基因的保守序列设计两对特异性引物，建立了一种检测B亚型禽偏肺病毒的逆转录套式PCR检测方法。应用该方法对B亚型禽偏肺病毒山东地区分离株进行检测，能够特异性地扩增出415bp的目的片段。该方法具有高度特异性和敏感性。分别以新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性支气管炎病毒作为模板进行扩增，结果均为阴性。经过检测，第一次PCR扩增的敏感性为107copies/μL，第二次扩增的敏感性可达到102copies/μL，第二次扩增的敏感性比第一次高105倍。应用该方法对采自山东省不同地区的142份具有呼吸道症状的临床病例进行aMPV检测，最终从中检测出75份为阳性。试验结果表明，建立的逆转录套式PCR检测方法特异、敏感、实用，为B亚型禽偏肺病毒的快速诊断及深入研究奠定了基础。2、禽偏肺病毒SDWF株的分离鉴定及特性的初步研究从山东省部分地区的商品肉鸡中采集禽偏肺病毒临床疑似病料，并进行RT-PCR检测，筛选出禽偏肺病毒阳性病料作为分毒材料。将阳性病料接种SPF鸡胚，盲传至第7代时鸡胚生长明显迟滞，胚体矮小。取阳性尿囊液在鸡胚成纤维细胞（CEF）上传代培养，出现禽偏肺病毒典型细胞病变（CPE）：细胞变圆、悬浮，并且有合胞体形成。分离株能够在Vero细胞上生长，并于攻毒后48h左右观察到部分细胞圆缩、悬浮，随培养时间的延长，圆缩的细胞逐渐增多；攻毒72h后可以观察到典型的合胞体。将分离株接种于DF-1细胞，观察到类似细胞病变。采用终点稀释法对病毒液进行初步纯化，并对其进行扩大培养。将病毒液接种于DF-1细胞进行间接免疫荧光试验，可以在胞质中观察到特异的绿色荧光，胞核没有观察到荧光；阴性对照组未出现荧光。对出现典型细胞病变的细胞培养物进行RT-PCR鉴定，可以观察到415bp的特异性目的条带；将PCR产物连接、转化后测序，并与Genbank中发表的F基因序列比较，结果与B亚型禽偏肺病毒核苷酸同源性最高，达97.4%-99.3%；与A亚型禽偏肺病毒核苷酸同源性较低，为77.4%-78.1%；而与C亚型禽偏肺病毒核苷酸同源性最低，为69.5%-69.7%。基因分型结果最终显示分离株为B亚型禽偏肺病毒，将其命名为B亚型禽偏肺病毒SDWF株。病毒的核酸类型试验结果表明SDWF株为RNA病毒。血凝试验结果显示分离株不能凝集健康鸡的红细胞以及鸭的红细胞。理化学特性研究结果表明分离株对脂溶性溶剂乙醚、氯仿敏感，为具有囊膜的病毒；对酸性环境有一定的抵抗力；60°C1h可使毒株失活。测定分离株的鸡胚成纤维细胞半数感染量，按照Reed-Muench方法计算SDWF株的TCID50为10-3.3/0.1mL。SPF鸡攻毒试验结果表明，分离株可以引起鸡的呼吸道症状；采集肺脏、气管等脏器做组织切片，显微镜下观察到攻毒组肺脏出现充血、出血以及炎性细胞浸润的现象；气管黏膜上皮细胞坏死脱落，黏膜固有层充血、出血并有炎性细胞浸润；对照组未见异常。
杨波[10]（2013）在《不同宿主感染REV情况调查及分离株gp90基因序列分析》文中进行了进一步梳理网状内皮组织增生症（Reticuloendotheliosis, RE）是指由网状内皮组织增生病毒（Reticuloendotheliosis virus, REV）引起的禽类的一种重要的免疫抑制病和致瘤性疾病,包括急性网状细胞肿瘤、生长抑制、淋巴组织和其他组织慢性肿瘤形成的病理综合症。REV不仅可以单独使禽类致病,也可与其他疾病混和感染,降低禽类对其他疾病的抵抗力,给禽类养殖业造成巨大经济损失。REV的常见宿主为鸡、鸭等家禽,同时REV亦可感染野生鸟类。为了解不同宿主对REV的感染情况,从全国各地采集了不同宿主来源的样品1563份,对其进行初步PCR检测,从不同宿主来源的样品中得到68份阳性样品,将阳性样品适当处理后接种DF-1细胞,利用IFA、PCR复检等方法检测后得到7株REV分离株,分别为CH120057株、CH120099株、CH120220株、CH120276株、CH120277株、WB11042株和WB11043株。分别从不同宿主阳性检出率和分离率、不同品种的鸡阳性检出率、不同品种的野鸟的阳性检出率和不同品种的水禽检出率4个角度对不同宿主来源感染REV的情况进行分析,推断得出鸡仍是REV的主要宿主。由实验数据我们分析推测不同品种的鸡样品中蛋鸡可能比其他品种的鸡更易感染REV,其次是肉鸡；小型雀形目鸟类比雁鸭类野鸟阳性感染率高；与鹅相比,鸭子是目前我国水禽类REV的主要宿主。以所分离的REV的病毒全基因组cDNA为模板,用REV特异性引物扩增gp90基因片段。PCR产物经回收、纯化后,克隆至pMD-18T载体,随机选取3个阳性克隆进行测序。测序结果表明分离的7株REV的gp90基因阅读框架全长均为1191bp,编码397氨基酸,未出现任何缺失和插入。通过遗传进化树分析结果显示,CH120057株、WB11043株、CH120057株在同一支上,同另一支上的CH120220株、CH12076株与ZD0708株亲缘关系较近,可能与ZD0708株存在共同祖先,gp90基因目前较保守还未出现较严重的突变,但仍有核酸位点发生突变导致氨基酸也发生位点突变。7株分离株之间的同源性较高,由此推测不同宿主间也可能存在相互传播。本研究丰富了我国REV流行病学调查数据,证实了目前我国大陆地区野生鸟类已经存在REV病毒的感染,这也是我国首次从迁徙野生鸟类群体中分离和鉴定出REV。
二、Micro-IFA检测禽肺病毒抗体（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Micro-IFA检测禽肺病毒抗体（论文提纲范文）
（1）鸡TLR15受体单克隆抗体的研制及抗原表位的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 哺乳动物TLRs研究进展 |
| 1.1.1 TLRs的发现 |
| 1.1.2 TLRs的结构 |
| 1.1.3 TLRs识别的配体及分布 |
| 1.1.4 TLRs介导的信号通路 |
| 1.2 鸡TLRs的研究进展 |
| 1.2.1 鸡TLR15的结构与定位 |
| 1.2.2 ChTLRs识别的配体 |
| 1.2.3 ChTLRs的基本属性 |
| 1.2.4 ChTLRs与细菌感染相关性研究 |
| 1.2.5 ChTLRs与病毒感染 |
| 1.2.6 鸡TLRs与寄生虫感染 |
| 1.3 单克隆抗体技术 |
| 1.3.1 单克隆抗体的概述 |
| 1.3.2 单克隆抗体的应用 |
| 1.4 展望 |
| 参考文献 |
| 第2章 鸡TLR15基因的原核表达、纯化及慢病毒过表达载体构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株和载体 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 模板提取 |
| 2.2.2 表达抗原序列的确定 |
| 2.2.3 引物的设计与合成 |
| 2.2.4 大肠杆菌感受态的制备 |
| 2.2.5 pET-30a-ChTLR15(162-386aa)原核表达质粒的构建及鉴定 |
| 2.2.6 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.2.7 重组蛋白的Ni-NTA亲和层纯化 |
| 2.2.8 重组蛋白凝胶过滤层析纯化 |
| 2.2.9 慢病毒过表达载体构建 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 表达抗原序列的分析结果 |
| 2.3.2 PCR扩增产物 |
| 2.3.3 重组蛋白的SDS-PAGE鉴定结果 |
| 2.3.4 重组蛋白的Western blot鉴定结果 |
| 2.3.5 重组蛋白Ni-NTA亲和层析纯化结果 |
| 2.3.6 重组蛋白凝胶过滤层析纯化结果 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第3章 鸡TLR15单克隆抗体的研制 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 试剂 |
| 3.1.2 仪器 |
| 3.1.3 实验动物及细胞 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 免疫原的准备 |
| 3.2.2 间接ELISA检测方法的建立 |
| 3.2.3 血清效价的测定 |
| 3.2.4 杂交瘤细胞融合 |
| 3.2.5 阳性杂交瘤细胞株的筛选及亚克隆 |
| 3.2.6 单克隆抗体的特性鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 抗原最适包被浓度和抗体最佳稀释度的确定 |
| 3.3.2 小鼠的血清抗体效价 |
| 3.3.3 细胞融合与筛选 |
| 3.3.4 单克隆抗体的特性 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第4章 鸡TLR15蛋白B细胞表位鉴定及其在鸡组织和细胞中的分布 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒、菌株、试剂、仪器 |
| 4.1.2 抗原表位预测 |
| 4.1.3 引物的设计 |
| 4.1.4 截短片段的构建 |
| 4.1.5 截短蛋白的诱导表达 |
| 4.1.6 抗原表位的初步定位 |
| 4.1.7 抗原表位的精确鉴定 |
| 4.1.8 激光共聚焦显微镜观察鸡TLR15在HD11细胞中的定位 |
| 4.1.9 鸡TLR15在SPF鸡组织中的分布 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 抗原表位预测结果 |
| 4.2.2 pET-30a-truncated ChTLR15基因克隆结果 |
| 4.2.3 鸡TLR15在HD11细胞中的定位结果 |
| 4.2.4 鸡TLR15在SPF鸡组织中分布的检测结果 |
| 4.3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）IBV感染鸡PBMCs-Mφ蛋白组学及STING对感染细胞ISGs基因表达及病毒复制的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 IB概述 |
| 1.1.1 IB病原学 |
| 1.1.2 IB流行病学 |
| 1.1.3 IB诊断与防控 |
| 1.1.4 IB与免疫 |
| 1.2 巨噬细胞 |
| 1.2.1 巨噬细胞生物学功能 |
| 1.2.2 巨噬细胞与IBV感染 |
| 1.3 蛋白组学概述 |
| 1.3.1 蛋白组学简介 |
| 1.3.2 蛋白组学研究方法 |
| 1.3.3 蛋白组学的应用 |
| 1.4 干扰素刺激基因(ISGs)概述 |
| 1.4.1 ISGs的生成 |
| 1.4.2 ISGs生物学功能及种类 |
| 1.5 干扰素基因刺激蛋白(STING)研究进展 |
| 1.5.1 STING概述 |
| 1.5.2 STING激活ISGs |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒与动物 |
| 2.1.2 试剂盒、工具酶和抗体试剂 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 IBV感染PBMCs-Mφ模型的建立 |
| 2.2.2 蛋白组学分析 |
| 2.2.3 STING对IBV感染PBMCs-MφISGs生成及病毒复制的影响 |
| 2.2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 IBV感染PBMCs-Mφ模型的建立 |
| 3.1.1 PBMCs-Mφ的鉴定 |
| 3.1.2 IBV在PBMCs-Mφ上的适应性培养及细胞病变观察 |
| 3.1.3 IBV M41感染PBMCs-Mφ的RT-PCR鉴定 |
| 3.1.4 IBV M41感染PBMCs-Mφ中病毒拷贝数的测定 |
| 3.1.5 病毒生长曲线 |
| 3.1.6 IFA检测IBV在PBMCs-Mφ上的增殖 |
| 3.2 IBV感染PBMCs-Mφ蛋白质组学分析结果 |
| 3.2.1 PBMCs-Mφ蛋白定量及鉴定 |
| 3.2.2 质谱分析 |
| 3.2.3 差异蛋白鉴定 |
| 3.2.4 差异表达蛋白的功能分类 |
| 3.2.5 差异表达蛋白功能富集分析 |
| 3.2.6 蛋白互作网络 |
| 3.2.7 PRM蛋白验证 |
| 3.3 STING调控IBV感染PBMCs-MφISGs的生成及病毒复制 |
| 3.3.1 STING基因真核表达质粒的构建 |
| 3.3.2 瞬时过表达STING基因转染条件的建立 |
| 3.3.3 瞬时沉默STING基因转染条件的建立 |
| 3.3.4 STING调控IBV感染PBMCs-Mφ中Mx、IFIT5、OASL的表达 |
| 3.3.5 STING调控PBMCs-Mφ中IBV的复制 |
| 4 讨论 |
| 4.1 IBV感染PBMCs-Mφ模型的建立 |
| 4.2 IBV感染PBMCs-Mφ蛋白组学分析 |
| 4.3 STING对IBV感染PBMCs-Mφ中ISGs表达的影响 |
| 4.3.1 IBV感染上调ISGs |
| 4.3.2 STING对IBV感染PBMCs-MφISGs表达的影响 |
| 4.4 STING对IBV感染PBMCs-Mφ中病毒复制的影响 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）鸡细胞表面受体Nectin4和SLAMF1在NDV感染中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 病毒受体 |
| 1.2 副黏病毒及其主要受体研究进展 |
| 1.3 NDV主要受体研究进展 |
| 1.4 SLAMF1在副黏病毒中的研究进展 |
| 1.5 Nectin4在副黏病毒中的研究进展 |
| 第2章 NDV感染宿主细胞依赖唾液酸以外的受体初探 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞株和病毒 |
| 2.1.2 酶和试剂 |
| 2.1.3 主要仪器和设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病毒的扩增 |
| 2.2.2 病毒TCID_(50)的测定 |
| 2.2.3 CEF的制备 |
| 2.2.4 唾液酸药物消化细胞 |
| 2.2.5 NDV吸附 |
| 2.2.6 RNA的提取和反转录 |
| 2.2.7 实时荧光定量PCR |
| 2.2.8 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 唾液酸酶处理禽类细胞后对NDV吸附作用的影响 |
| 2.3.2 唾液酸酶处理哺乳动物细胞后对NDV吸附作用的影响 |
| 2.4 分析讨论 |
| 第3章 Nectin4和SLAMF1在鸡细胞、组织中的分布研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 载体、细胞株、实验动物和病毒 |
| 3.1.2 酶和试剂 |
| 3.1.3 培养基和溶液 |
| 3.1.4 主要仪器和设备 |
| 3.1.5 实验动物 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计与合成 |
| 3.2.2 RNA的提取和反转录 |
| 3.2.3 Nectin4和SLAMF1基因的克隆 |
| 3.2.4 鸡Nectin4和鸡SLAMF1的原核表达 |
| 3.2.5 鸡Nectin4和SLAMF1多抗的制备 |
| 3.2.6 Western Blotting检测多抗效价 |
| 3.2.7 标准曲线的建立 |
| 3.2.8 禽类细胞中Nectin4、SLAMF1的分布检测 |
| 3.2.9 NDV感染细胞后Nectin4、SLAMF1的变化 |
| 3.2.10 商品鸡体内组织Nectin4、SLAMF1的分布检测 |
| 3.2.11 鸡Nectin4和SLAMF1在感染鸡体内的变化 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 Nectin4和SLAMF1基因的克隆 |
| 3.3.2 鸡Nectin4和SLAMF1的原核表达 |
| 3.3.3 鸡Nectin4和SLAMF1多抗的Western Blotting效价 |
| 3.3.4 标准曲线的建立 |
| 3.3.5 不同禽类细胞中Nectin4和SLAMF1的分布 |
| 3.3.6 NDV感染细胞后Nectin4、SLAMF1的变化 |
| 3.3.7 商品鸡体内组织Nectin4、SLAMF1的分布检测 |
| 3.3.8 NDV感染鸡的组织病变 |
| 3.3.9 健康SPF鸡组织中Nectin4、SLAMF1的mRNA分布 |
| 3.3.10 感染鸡组织中Nectin4和SLAMF1转录水平的变化 |
| 3.3.11 感染鸡组织中Nectin4和SLAMF1蛋白水平的变化 |
| 3.4 分析讨论 |
| 第4章 鸡Nectin4和SLAMF1在NDV感染中的作用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 载体和细胞株 |
| 4.1.2 酶和试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 pcDNA3.1-Nectin4、pcDNA3.1-SLAMF1的合成与表达 |
| 4.2.2 pCMV6-Nectin4-FLAG、pCMV6-SLAMF1-FLAG的构建与表达 |
| 4.2.3 pCMV-HA-Nectin4、pCMV-HA-SLAMF1的构建与表达 |
| 4.2.4 鸡Nectin4和SLAMF1的外源性表达对NDV感染的影响 |
| 4.2.5 敲低Nectin4、SLAMF1基因对NDV感染的影响 |
| 4.2.6 Nectin4、SLAMF1原核表达产物对NDV-HN的遮蔽作用 |
| 4.2.7 Nectin4、SLAMF1蛋白与NDV的内源性相互作用 |
| 4.2.8 Nectin4、SLAMF1蛋白与NDV-HN蛋白的相互作用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 pcDNA3.1-Nectin4、pcDNA3.1-SLAMF1的表达 |
| 4.3.2 pCMV6-Nectin4-FLAG、pCMV6-SLAMF1-FLAG的表达 |
| 4.3.3 pCMV-HA-Nectin4、pCMV-HA-SLAMF1的表达 |
| 4.3.4 鸡Nectin4和SLAMF1的外源性表达对NDV感染的影响 |
| 4.3.5 敲低Nectin4、SLAMF1基因对NDV感染的影响 |
| 4.3.6 Nectin4、SLAMF1原核表达产物对NDV的遮蔽作用 |
| 4.3.7 Nectin4蛋白和SLAMF1蛋白与NDV的内源性相互作用 |
| 4.3.8 Nectin4蛋白和SLAMF1蛋白与NDV-HN蛋白的相互作用 |
| 4.4 分析讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（4）牛呼吸道合胞体病毒反向遗传操作系统构建的基础研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 牛呼吸道合胞体病毒 |
| 1.1.1 牛呼吸道合胞体病毒的概述 |
| 1.1.2 牛呼吸道合胞体病毒的分类及理化特性 |
| 1.1.3 牛呼吸道合胞体病毒编码的蛋白及其功能 |
| 1.1.4 牛呼吸道合胞体病毒的RNA复制 |
| 1.1.5 牛呼吸道合胞体病毒感染的流行病学 |
| 1.1.6 牛呼吸道合胞体病毒感染的病理特征和临床症状 |
| 1.1.7 牛呼吸道合胞体病毒疫苗 |
| 1.2 反向遗传操作系统 |
| 1.2.1 反向遗传操作技术 |
| 1.2.2 负链RNA病毒的反向遗传操作技术 |
| 1.2.3 副黏病毒的反向遗传操作技术 |
| 1.2.4 牛呼吸道合胞体病毒的反向遗传操作技术 |
| 1.3 本研究的目的及意义 |
| 第二章 牛呼吸道合胞体病毒反向遗传系统构建的基础研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 病毒和细胞 |
| 2.1.2 质粒和菌株 |
| 2.1.3 主要试剂和仪器 |
| 2.1.4 RT-PCR引物的设计与合成 |
| 2.1.5 RNA提取与RT-PCR |
| 2.1.6 基因片段的序列测定和病毒全长基因组序列的组装与分析 |
| 2.1.7 辅助质粒的构建 |
| 2.1.8 微基因组质粒的构建 |
| 2.1.9 辅助质粒的表达验证 |
| 2.1.10 微基因组的功能鉴定 |
| 2.1.11 辅助质粒的功能鉴定 |
| 2.1.12 全长基因组质粒的构建 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 牛呼吸道合胞体病毒LJX31全基因序列的测定与分析 |
| 2.2.2 辅助质粒及BRSV LJX31全基因组cDNA克隆的构建 |
| 2.2.3 辅助质粒的表达验证 |
| 2.2.4 微基因组的构建及功能鉴定 |
| 2.2.5 辅助质粒的功能鉴定 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）禽偏肺病毒通用型抗原和抗体检测方法的建立（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 英文缩写词表 |
| 摘要 |
| 文献综述 |
| 1 aMPV的病原学 |
| 1.1 aMPV的病原学特性 |
| 1.2 aMPV的分类 |
| 1.3 aMPV对禽的致病性 |
| 2 禽偏肺病毒的检测方法研究进展 |
| 2.1 病毒的分离鉴定 |
| 2.2 分子生物学方法 |
| 2.3 血清学方法 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 试验研究 |
| 试验一：禽偏肺病毒通用型EvaGreen荧光定量RT-PCR检测方法的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 毒株和临床样品 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 引物设计 |
| 1.4 病毒RNA的提取与cDNA合成 |
| 1.5 标准质粒的构建 |
| 1.6 aMPVEvaGreen荧光定量RT-PCR方法的建立 |
| 1.7 aMPVEvaGreen实时荧光定量RT-PCR方法特异性试验 |
| 1.8 aMPVEvaGreen实时荧光定量RT-PCR方法敏感性试验 |
| 1.9 aMPVEvaGreen实时荧光定量RT-PCR方法重复性试验 |
| 1.10 临床样品检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 aMPVEvaGreen实时荧光定量RT-PCR标准曲线的建立 |
| 2.2 aMPVEvaGreen实时荧光定量RT-PCR的特异性 |
| 2.3 aMPVEvaGreen实时荧光定量RT-PCR的敏感性 |
| 2.4 aMPVEvaGreen实时荧光定量RT-PCR的重复性 |
| 2.5 临床样品检测 |
| 3 小结 |
| 试验二：aMPVN蛋白的原核表达和免疫反应性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 重组质粒pET32a-N的构建 |
| 1.4 重组蛋白的表达 |
| 1.5 N蛋白的回收纯化 |
| 1.6 多克隆抗体的制备 |
| 1.7 N蛋白的Westernblotting鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达载体的鉴定 |
| 2.2 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.3 N蛋白的Westernblotting分析 |
| 3 小结 |
| 试验三：基于N蛋白的禽偏肺病毒通用型间接ELISA抗体检测方法的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 包被抗原的制备 |
| 1.3 aMPVN蛋白间接ELISA诊断方法的建立 |
| 1.4 间接ELISA方法判定标准的确定 |
| 1.5 特异性试验 |
| 1.6 敏感性试验 |
| 1.7 重复性试验 |
| 1.8 准确性试验 |
| 1.9 临床血清样品检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 包被抗原的制备 |
| 2.2 间接ELISA最佳反应条件的确定 |
| 2.3 间接ELISA方法判定标准的确定 |
| 2.4 特异性试验 |
| 2.5 敏感性试验 |
| 2.6 重复性试验 |
| 2.7 准确性试验 |
| 2.8 临床血清样品检测 |
| 3 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 附：作者读研期间发表文章 |
（6）禽流感病毒与新城疫病毒共感染对病毒复制影响及其机理初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词英文对照 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 新城疫病毒概述 |
| 1.1.1 NDV传染源及传播途径 |
| 1.1.2 NDV宿主及流行特点 |
| 1.1.3 分类及生物学特性 |
| 1.1.4 基因组结构和功能 |
| 1.1.5 新城疫病毒基因组的转录与复制 |
| 1.2 禽流感病毒概述 |
| 1.2.1 禽流感的历史和现状 |
| 1.2.2 禽流感病毒病毒粒子结构和NP蛋白功能 |
| 1.3 禽流感病毒与新城疫病毒共感染研究进展 |
| 1.3.1 禽流感病毒与新城疫病毒的区别 |
| 1.3.2 禽病多重感染相关研究 |
| 1.3.3 禽流感与新城疫共感染研究设想 |
| 第二章 禽流感病毒和新城疫病毒单独感染细胞研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 毒株扩增及TCID_(50)测定 |
| 2.1.2 细胞、实验用动物及抗体 |
| 2.1.3 主要试剂及耗材 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 主要缓冲液及试剂配制 |
| 2.1.6 细胞复苏 |
| 2.1.7 铺板 |
| 2.1.8 病毒稀释及细胞接毒 |
| 2.1.9 样品收集及处理 |
| 2.1.10 荧光实时定量PCR (RT-qPCR) |
| 2.1.11 SDS-PAGE凝胶电泳 |
| 2.1.12 Western blot(WB) |
| 2.1.13 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 RT-qPCR检测两种病毒单独感染DF-1细胞时病毒NP基因mRNA水平表达 |
| 2.2.2 Western blot (WB)检测两种病毒单独感染DF-1细胞时病毒NP蛋白水平表达 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 禽流感病毒与新城疫病毒共同感染对病毒复制的相互影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验设计 |
| 3.1.2 病毒与细胞 |
| 3.1.3 抗体 |
| 3.1.4 主要缓冲液及试剂配制 |
| 3.1.5 细胞接毒 |
| 3.1.6 Western blot (WB)和间接免疫荧光激光共聚焦 |
| 3.1.7 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 NDV和AIV共感染DF-1细胞对病毒NP蛋白表达相互影响 |
| 3.2.2 NDV和AIV共感染A549细胞对病毒NP蛋白表达相互影响 |
| 3.2.3 NDV和AIV共感染Vero细胞对病毒NP蛋白表达相互影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 禽流感病毒与新城疫病毒共感A549细胞对病毒复制相互作用机理初步研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 病毒与细胞 |
| 4.1.2 抗体 |
| 4.1.3 ELISA试剂盒和药物抑制剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 主要缓冲液及试剂配制 |
| 4.1.6 ELISA检测两种病毒共感染时IFN-β变化 |
| 4.1.7 样品收集及实验步骤 |
| 4.1.8 Western blot检测共感染对病毒NP蛋白表达影响 |
| 4.1.9 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 NDV、AIV单独感染A549细胞时IFN-β生成变化 |
| 4.2.2 NDV和AIV共感染A549细胞时IFN-β生成变化 |
| 4.2.3 IFN-β生成抑制条件下两种病毒共感染A549量病毒NP蛋白表达变化 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）鸡SP-A单抗制备及其组织病理学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 实验菌株及质粒 |
| 1.1.2 细胞、实验动物、自备抗体 |
| 1.1.3 主要工具酶及试剂盒 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 原核表达载体的构建 |
| 1.2.2 真核表达载体的构建 |
| 1.2.3 pCold-cSP-A融合蛋白的诱导表达 |
| 1.2.4 pCold-cSPA诱导表达产物的纯化 |
| 1.2.5 蛋白质免疫印迹法（Western-blotting）鉴定重组蛋白 |
| 1.2.6 鸡肺灌洗液的制备天然SP-A蛋白的制备与纯化 |
| 1.2.7 抑菌活性检测 |
| 1.2.8 单克隆抗体的制备 |
| 1.2.9 单克隆抗体效价测定及生物活性分析 |
| 1.2.10 抗cSP-A蛋白单克隆抗体抗原表位的鉴定 |
| 1.2.11 荧光定量RT-PCR检测鸡相关组织cSP-A的mRNA表达水平 |
| 1.2.12 动物攻毒实验 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 cSP-A蛋白的可溶性表达与鉴定 |
| 2.1.1 原核表达载体构建 |
| 2.1.2 重组蛋白的表达和纯化结果 |
| 2.1.3 Western Blot分析 |
| 2.2 抑菌活性检测 |
| 2.3 cSP-A真核表达载体构建 |
| 2.4 单克隆抗体的筛选与亚型鉴定 |
| 2.5 cSP-A蛋白抗原表位的鉴定 |
| 2.5.1 cSP-A基因的分段克隆、诱导表达与初步鉴定 |
| 2.5.2 1D12A3单克隆抗体抗原表位的精确鉴定 |
| 2.6 单克隆抗体的免疫学特性鉴定 |
| 2.6.1 单克隆抗体的筛选 |
| 2.6.2 ELISA检测 |
| 2.6.3 Western-blotting检测 |
| 2.6.4 间接免疫荧光染色检测 |
| 2.6.5 IHC检测 |
| 2.7 qRT-PCR结果 |
| 2.7.1 标准品梯度稀释的PCR扩增 |
| 2.7.2 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.7.3 溶解曲线的分析 |
| 2.7.4 敏感性试验检测 |
| 2.7.5 正常鸡不同脏器中cSP-A mRNA表达水平 |
| 2.8 鸡攻毒实验 |
| 2.8.1 各攻毒组中cSP-A在各脏器中表达水平的变化 |
| 2.8.2 病理组织学观察 |
| 2.8.3 cSP-A蛋白表达水平的结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 鸡SP-A的可溶性表达、纯化与活性检测 |
| 3.2 单抗的表位及免疫学特性 |
| 3.3 cSP-A在健康鸡中组织分布情况 |
| 3.4 鸡SP-A可作为病理损伤的检测指标 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附作者在读研期间发表的学术论文 |
（8）东北地区野生鸟类主要禽免疫抑制病病原感染情况调查及与REV PR相互作用宿主蛋白的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.2 REV病原学、分子病毒学及流行情况 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 基因结构及编码蛋白 |
| 1.2.3 流行病学 |
| 1.2.4 REV的危害 |
| 1.3 ALV-J病原学、分子病毒学及流行情况 |
| 1.3.1 ALV病毒亚型分类 |
| 1.3.2 ALV-J基因结构及编码蛋白 |
| 1.3.3 ALV-J流行病学研究 |
| 1.4 野鸟在动物病毒传播中的作用及意义 |
| 1.5 蛋白相互作用研究方法 |
| 1.5.1 酵母双杂交技术 |
| 1.5.2 噬菌体展示技术 |
| 1.5.3 免疫共沉淀技术 |
| 1.5.4 Pulldown 技术 |
| 1.5.5 荧光共振能量转移 |
| 1.6 Snapin蛋白研究概况 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 2 东北地区野生鸟类禽免疫抑制病病原感染情况调查 |
| 2.1 实验材料和实验仪器 |
| 2.1.1 病料、病毒和细胞 |
| 2.1.2 菌株、载体 |
| 2.1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样品采集及处理 |
| 2.2.2 病毒基因组DNA和RNA提取 |
| 2.2.3 禽免疫抑制病病原的特异性PCR检测 |
| 2.2.4 野鸟源REV分离及gp90基因遗传演化分析 |
| 2.2.5 野鸟源ALV-J分离及gp85基因遗传演化分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 禽免疫抑制病病原PCR检测结果 |
| 2.3.2 野鸟源REV分离鉴定 |
| 2.3.3 野鸟源REV gp90基因序列分析及遗传演化分析 |
| 2.3.4 DBYR1102全基因组克隆及序列分析 |
| 2.3.5 野鸟源ALV-J分离鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 3 REV p30蛋白的表达纯化及ELISA检测方法的初步建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒株、质粒、菌株和实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂及仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计 |
| 3.2.2 DNA的提取及p30基因的扩增 |
| 3.2.3 重组表达质粒的构建与鉴定 |
| 3.2.4 重组蛋白的诱导表达与鉴定 |
| 3.2.5 重组蛋白的纯化与浓缩 |
| 3.2.6 融合蛋白的Western blot鉴定 |
| 3.2.7 抗REV-p30基因多克隆抗体的制备及生物学活性检测 |
| 3.2.8 间接ELISA检测方法的初步建立 |
| 3.2.9 间接ELISA检测方法的初步应用 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 REVp30蛋白的原核表达及蛋白纯化 |
| 3.3.2 重组p30蛋白的表达与鉴定 |
| 3.3.3 重组蛋白纯化与浓缩 |
| 3.3.4 融合蛋白Western blot鉴定 |
| 3.3.5 多克隆抗体的制备及检测 |
| 3.3.6 融合蛋白的间接ELISA检测结果 |
| 3.4 讨论 |
| 4 酵母双杂交筛选与REV聚合酶PR相互作用的宿主蛋白 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株、细胞、文库、抗体及质粒 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂、耗材 |
| 4.1.4 毒株、细胞、文库、抗体及质粒主要培养基及培养液配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 PR 诱饵载体的构建 |
| 4.2.2 pGBK-PR诱饵载体自激活性与毒性检测 |
| 4.2.3 酵母双杂交筛选 |
| 4.2.4 酵母共转化试验 |
| 4.2.5 酵母菌转化 |
| 4.2.6 Snapin真核表达载体构建 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 PR-pGBKT7诱饵质粒的构建 |
| 4.3.2 pGBPR诱饵质粒自激活性与毒性检测 |
| 4.3.3 文库滴度检测 |
| 4.3.4 杂交效率检测 |
| 4.3.5 回转验证实验结果 |
| 4.3.6 Snapin基因的扩增与酶切鉴定 |
| 4.3.7 PR真核表达质粒酶切鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 文库构建与质量鉴定 |
| 4.4.2 诱饵质粒构建与检测 |
| 4.4.3 文库筛选 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）禽偏肺病毒的分离鉴定及Nested RT-PCR检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 Abstract 1 引言 |
| 1.1 AMPV 的病原学 |
| 1.1.1 aMPV 的分类 |
| 1.1.2 aMPV 的形态特征 |
| 1.1.3 aMPV 的基因组成 |
| 1.1.4 aMPV 的理化特性 |
| 1.1.5 aMPV 的培养特性 |
| 1.2 AMPV 的流行病学 |
| 1.3 AMPV 的致病性 |
| 1.4 AMPV 感染的临床症状 |
| 1.5 AMPV 感染的病理学研究 |
| 1.6 AMPV 感染的免疫学研究 |
| 1.6.1 主动免疫 |
| 1.6.2 被动免疫 |
| 1.7 AMPV 感染的诊断 |
| 1.7.1 病原的分离鉴定 |
| 1.7.2 分子生物学诊断 |
| 1.7.3 血清学诊断 |
| 1.8 AMPV 的鉴别诊断 |
| 1.8.1 变异毒株 |
| 1.8.2 其它病毒 |
| 1.8.3 细菌和支原体 |
| 1.9 AMPV 感染的防治 |
| 1.9.1 综合防治 |
| 1.9.2 免疫预防 |
| 1.9.3 治疗 |
| 1.10 研究的目的和意义 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料、鸡胚和细胞 |
| 2.1.2 病毒和实验动物 |
| 2.1.3 仪器和设备 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 试验相关溶液的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 禽偏肺病毒 Nested RT-PCR 检测方法的建立及应用 |
| 2.2.2 禽偏肺病毒 SDWF 株的分离鉴定及特性的初步研究 3 结果与分析 |
| 3.1 AMPV 逆转录套式 PCR 检测方法的建立与应用 |
| 3.1.1 逆转录套式 PCR 结果 |
| 3.1.2 RT-PCR 产物的克隆与序列测定 |
| 3.1.3 特异性试验结果 |
| 3.1.4 敏感性试验结果 |
| 3.1.5 临床样品检测结果 |
| 3.1.6 F 基因的序列分析 |
| 3.2 禽偏肺病毒 SDWF 株的分离鉴定及特性的初步研究 |
| 3.2.1 病毒的鸡胚培养 |
| 3.2.2 病毒的细胞培养 |
| 3.2.3 鸡胚成纤维细胞半数感染量测定结果 |
| 3.2.4 IFA 检测结果 |
| 3.2.5 RT-PCR 检测结果 |
| 3.2.6 SDWF 株 F 基因序列测定及分析 |
| 3.2.7 禽偏肺病毒 SDWF 株理化学特性结果 |
| 3.2.8 血凝试验结果 |
| 3.2.9 动物回归试验结果 4 讨论 5 结论 参考文献 致谢 攻读硕士期间发表论文情况 |
（10）不同宿主感染REV情况调查及分离株gp90基因序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.2 禽网状内皮组织增生症研究进展 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 症状与病变 |
| 1.2.3 REV的危害 |
| 1.2.4 诊断 |
| 1.2.5 REV预防和控制 |
| 1.3 REV的流行病学研究进展 |
| 1.3.1 发生与分布 |
| 1.3.2 病毒的传播 |
| 1.3.3 REV的流行特征及趋势 |
| 1.3.4 野生鸟类对疾病的传播 |
| 1.4 本研究的主要目的和意义 |
| 2 不同宿主禽网状内皮组织增生症的流行病学调查 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验样品 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 样品的处理 |
| 2.2.2 PCR初筛 |
| 2.2.3 病毒分离与鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PCR初筛阳性样品 |
| 2.3.2 REV的分离和鉴定 |
| 2.3.3 不同种宿主样品中REV检测结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 REV总的阳性检出率与分离率的比较分析 |
| 2.4.2 不同品种鸡REV阳性检出率与分离率的比较分析 |
| 2.4.3 不同品种野生鸟类阳性检出率与分离率的比较分析 |
| 2.4.4 不同品种水禽阳性检出率与分离率的比较分析 |
| 2.4.5 不同宿主REV阳性检出率与分离率的比较分析 |
| 3 REV分离株的gp90基因克隆及序列分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 试验样品 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 病毒前DNA提取 |
| 3.2.2 PCR实验 |
| 3.2.3 PCR产物回收和纯化 |
| 3.2.4 连接 |
| 3.2.5 转化 |
| 3.2.6 阳性重组质粒鉴定 |
| 3.2.7 序列测定与分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 重组质粒PCR结果 |
| 3.3.2 测序结果 |
| 3.3.3 基因序列的比较和分析 |
| 3.4 讨论 |
| 4 结论 |
| 附录1 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、Micro-IFA检测禽肺病毒抗体（论文参考文献）
- [1]鸡TLR15受体单克隆抗体的研制及抗原表位的鉴定[D]. 李梦妮. 扬州大学, 2021
- [2]IBV感染鸡PBMCs-Mφ蛋白组学及STING对感染细胞ISGs基因表达及病毒复制的影响[D]. 孙晓琦. 东北农业大学, 2021
- [3]鸡细胞表面受体Nectin4和SLAMF1在NDV感染中的作用[D]. 方文秀. 扬州大学, 2021
- [4]牛呼吸道合胞体病毒反向遗传操作系统构建的基础研究[D]. 王磊. 中国农业科学院, 2019(08)
- [5]禽偏肺病毒通用型抗原和抗体检测方法的建立[D]. 王贝贝. 河南农业大学, 2018(02)
- [6]禽流感病毒与新城疫病毒共感染对病毒复制影响及其机理初步研究[D]. 谢军. 西北民族大学, 2018(05)
- [7]鸡SP-A单抗制备及其组织病理学研究[D]. 黄琪. 安徽农业大学, 2016(05)
- [8]东北地区野生鸟类主要禽免疫抑制病病原感染情况调查及与REV PR相互作用宿主蛋白的筛选[D]. 姜莉莉. 东北林业大学, 2014(02)
- [9]禽偏肺病毒的分离鉴定及Nested RT-PCR检测方法的建立与应用[D]. 薛聪. 山东农业大学, 2013(05)
- [10]不同宿主感染REV情况调查及分离株gp90基因序列分析[D]. 杨波. 东北林业大学, 2013(03)