导读:本文包含了外源定向论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:骨髓间充质干细胞,软骨细胞,分化,生长因子
外源定向论文文献综述
谭荣邦[1]（2013）在《外源性TGF-β1和IGF-1诱导骨髓间充质干细胞定向分化软骨细胞的实验研究》一文中研究指出目的：关于体外培养、鉴定间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)以及诱导MSCs定向分化为软骨细胞,目前尚缺乏相对完整和规范的实验方法。本课题拟通过对MSCs的体外培养、扩增,研究MSCs一般形态结构；通过流式细胞术、免疫荧光法结合MSCs分化功能法共同鉴定MSCs;胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)和转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)诱导MSCs定向分化为软骨细胞,将不同时间段内单独使用和联合使用两种诱导因子对所诱导出的细胞Ⅱ型胶原表达量的影响相比较；通过光镜和电镜研究诱导前后MSCs细微、超微结构形态学改变,同时检测TGF-β1和IGF-1对MSCs增殖能力的影响,为进一步开发MSCs作为组织工程气管软骨种子细胞和体外构建组织工程气管软骨提供实验基础和技术可行性。方法：1MSCs获取、培养、纯化与鉴定1.1MSCs获取、培养及纯化：①颈椎脱臼处死大鼠,无菌条件下分离大鼠股骨和胫骨,取骨髓；②通过换液及传代去除杂质细胞。光镜观察细胞形态。1.2MSCs的鉴定：①形态学鉴定免疫荧光法；②表型鉴定流式细胞术；③功能鉴定诱导MSCs定向分化为软骨细胞。1.3MTT法检测采用四甲基偶氮唑盐(MTT)微量酶反应比色法检测TGF-β1、 IGF-1及TGF-β1+IGF-1对MSCs增殖能力的影响。1.4扫描电镜观察MSCs诱导前形态。1.5透射电镜观察MSCs诱导前形态。2诱导MSCs定向分化为软骨细胞。2.1体外诱导及分组根据诱导分化因子使用方法,实验分四组：A组：50ng/ml IGF-1和10ng/ml TGF-β1。B组：10ng/ml TGF-β1。C组：50ng/ml IGF-1。对照组：单独使用DMEM高糖培养基,不加诱导分化因子。A、B、C组在DMEM高糖培养基里加入维生素C50μg/ml、胰岛素6.25μg/ml、地塞米松51.6ng/ml作为基础诱导分化液。取第四代MSCs按1×105/ml接种于六孔板,内置盖玻片行细胞爬片。光镜观察MSCs诱导后形态学改变。2.2扫描电镜观察MSCs诱导后形态学变化。2.3透射电镜观察MSCs诱导后形态学变化。2.4MSCs诱导分化软骨细胞后鉴定：①Ⅱ型胶原免疫荧光染色②RT-PCR检测③Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色,多种方法共同鉴定MSCs诱导出的软骨细胞。结果：1光镜观察原代培养24h后首次换液,去除未贴壁细胞,大部分细胞呈梭型、叁角形,小部分呈圆形。3代后细胞纯化,MSCs形态均一,杂质细胞极少见。诱导7d后MSCs形态开始发生改变,逐渐转变成叁角形、星形、多边形,21d后绝大多数MSCs呈叁角形、星形、多边形细胞形态,可见多个突起。2MSCs鉴定①流式细胞术检测显示实验所培养的细胞广泛高度表达CD90、 CD29,而极少表达CD34、CD45。②MSCs免疫荧光显示MSCs表达CD90、CD29阳性率在99%以上,而不表达CD34、CD45。3MTT法检测A组、B组和C组增殖活性高于对照组(P<0.05)。TGF-β1、IGF-1可增强MSCs增殖活性。4扫描电镜观察MSCs呈长梭形,扁平伸展状,可见突起。诱导两周MSCs体积增大,呈多边形、叁角形、星形,可见多个突起。5透射电镜观察MSCs诱导前透射电镜见一个细胞核,可见一个核仁。胞浆见线粒体。细胞诱导7d后细胞核增大,核仁增多。诱导14d见线粒体、粗面内质网和空泡较7d时增加,可见较多的微绒毛和脂滴。诱导21d空泡和脂滴增加,可见数个髓鞘样小体。6MSCs诱导出软骨细胞后鉴定：6.1Ⅱ型胶原免疫荧光染色诱导21d后,A组、B组免疫荧光显示胞浆呈棕红色,高度表达Ⅱ型胶原,而C组和对照组结果呈阴性。6.2RT-PCR检测Ⅱ型胶原表达RT-PCR结果显示A组和B组电泳中可见Ⅱ型胶原扩增条带,呈阳性,C组和对照组呈阴性。6.3Ⅱ型胶原免疫细胞化学染色A组和B组Ⅱ型胶原染色呈阳性,胞浆呈棕黄色。而C组和对照组结果呈阴性。以JEDR8010D形态图像分析软件VESION1.0扫描,结果显示A组Ⅱ型胶原表达量比B组显着提高(P<0.01),且随着时间的延长,表达量逐渐增加。结论：本实验采用全骨髓培养+贴壁纯化法分离培养MSCs,培养出大量高度纯化的MSCs,可满足MSCs作为种子细胞构建组织工程气管软骨需求,全骨髓培养+贴壁纯化法是值得推荐的MSCs培养方法。流式细胞术、免疫荧光法结合MSCs分化功能法是目前MSCs较为理想的鉴定方法。TGF-β1与IGF-1对MSCs均有促增殖作用,MSCs诱导分化为软骨细胞时细微和超微结构改变提示细胞分化、代谢功能旺盛。联合使用TGF-β1、 IGF-1诱导MSCs在体外定向分化为软骨细胞,TGF-β1和IGF-1协同刺激MSCs分化为软骨细胞,可获得了较佳的诱导效应,从而构建出目前较为完整的、规范的体外培养MSCs、诱导MSCs定向分化为软骨细胞的模型,为进一步应用组织工程技术修复气管软骨缺损提供了实验基础与技术可行性。(本文来源于《扬州大学》期刊2013-05-01）
王昌耀[2]（2012）在《外源性透明质酸对骨髓来源间充质干细胞体外定向分化的诱导效应研究》一文中研究指出1、骨髓来源间充质干细胞的提取、培养与扩增目的：优化获取兔骨髓间充质干细胞方法,并对细胞进行纯化、鉴定及扩增,同时对其生物学性状进行研究。方法：取新生新西兰大耳白兔骨髓5.0ml,采用密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代对其进行纯化,观察细胞形态和表面标志物的表达,从而对其进行鉴定。观察第1、3、5、7代细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线。结果：经密度梯度离心、贴壁筛选并结合细胞传代均可得到贴壁细胞集落,密度梯度离心集落形成率稍高,但贴壁筛选法操作更简便。传代至第3代和第5代细胞形态单一,细胞排列具有典型的漩涡状结构。第1、3、5代细胞增殖能力强,生长旺盛；至第7代细胞增殖明显减弱。所分离培养的细胞表达CD44、CD90,不表达CD34。结论：分离培养的细胞为间充质干细胞,且成份单一,具有多向分化潜能,且无造血系干细胞标志。经体外传代,增殖能力强,适宜作为种子细胞进行下一步研究。2、外源性透明质酸对MSCs增殖及分化情况的影响目的：通过研究外源性透明质酸(hyaluronic acid, HA)对兔骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, Mscs)体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对Mscs的作用,为Mscs为基础的组织工程化软骨的临床应用奠定基础。方法：全骨髓法+贴壁培养法分离培养兔Mscs,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入HA诱导液(含0.25mg/ml HA+含10%FBS的HG-DMEM),以TGF-β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7、14、21d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果：经HA诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结论：外源性HA具有诱导兔Mscs向软骨细胞分化的能力,但比TGF-β3的诱导能力弱。提示关节腔内环境对Mscs向软骨细胞分化有正性促进作用,支持HA作为软骨组织工程基质使用。3、不同浓度透明质酸对骨髓来源间充质干细胞成软骨分化的影响目的：探讨不同浓度透明质酸对骨髓来源间充质干细胞向软骨方向定向分化的影响。方法：取P3代未诱导的骨髓来源间充质干细胞,按培养液中添加的透明质酸浓度不同分为两实验组,A组：低浓度组(基础培养基+HA0.1mg/m1),B组：高浓度组(基础培养基+HA0.2mg/m1)。同时设立空白对照组(基础培养基)及阳性对照组(基础培养基+10ng/ml TGF-β3),观察细胞形态,增殖情况并绘制生长曲线,分别于诱导后第7、14、21d行免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果：经添加软骨诱导剂后,干细胞细胞增殖速度放缓,形态由长梭形变为多角形、椭圆形,胞浆Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,半定量分析显示两实验组Ⅱ型胶原表达无差异,但均比阳性对照组弱,空白对照组无Ⅱ型胶原表达。结论：不同浓度外源性HA诱导兔Mscs向软骨细胞分化的能力无差异,且均比TGF-β3的诱导能力弱。提示HA作为细胞外基质的主要成分,有促进Mscs向软骨细胞分化的作用,但改变外环境中透明质酸浓度不会影响Mscs的软骨分化。自体关节腔内环境支持以干细胞为基础的组织工程化软骨修复软骨缺损。4、不同分-子-量透明质酸对骨髓来源间充质干细胞成软骨分化的影响目的：探讨不同分子量透明质酸对骨髓来源间充质干细胞向软骨方向定向分化的影响。方法：取P3代未诱导的骨髓来源间充质干细胞,培养液中分别添加不同分子量透明质酸做诱导剂,分为叁个实验组,A组：低分子量组(基础培养基+HA0.1mg/ml,平均分子量约1000kD),B组：中分子量组(基础培养基+HA0.1mg/ml,平均分子量约1800kD),高分子量组(基础培养基+HA0.1mg/m1,平均分子量约2000kD)。同时设立空白对照组(基础培养基)及阳性对照组(基础培养基+10ng/ml TGF-β3),观察细胞形态,增殖情况并绘制生长曲线,分别于诱导后第7、14、21d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,另外采用免疫组化染色及RT-PCR方法检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果：经添加软骨诱导剂后,干细胞细胞增殖速度放缓,形态由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性,胞浆Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,半定量分析显示实验组Ⅱ型胶原表达与对照组有差异,但B、C组间Ⅱ型胶原表达相似,空白对照组无Ⅱ型胶原表达。结论：不同分子量外源性HA诱导兔Mscs向软骨细胞分化的能力存在差异,分子量高的HA的诱导能力较低分子量HA的诱导能力强。证明透明质酸的分子量与Mscs的软骨分化有关联性,但均比TGF-β3的诱导能力弱。提高关节腔内透明质酸分子量对干细胞为基础的组织工程化软骨修复软骨缺损有帮助。5、外源性透明质酸诱导骨髓间充质干细胞修复兔膝关节软骨缺损的研究目的：探讨外源性透明质酸(hyaluronic acid, HA)诱导的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)对全层软骨缺损修复的效果,了解体内条件下经外源性透明质酸诱导的干细胞能否保持软骨分化表型,促进软骨修复。方法：4月龄日本大耳白兔24只,用手摇钻制成直径5mm、深4mm的圆柱形膝关节软骨缺损。分四组分别植入藻酸盐凝胶混合的经透明质酸诱导后兔骨髓间充质干细胞(组A,n=6),藻酸盐凝胶混合的未经诱导的兔骨髓间充质干细胞(组B,n=6),单纯藻酸盐凝胶组(组C,n=6),及缺损处不处理(组D,n=6)。术后5、8和12周观察软骨缺损修复情况,进行组织学评分。HE染色观察软骨细胞情况,RT-PCR检测修复组织中Ⅱ型胶原mRNA合成情况。结果：术后第8周,A组及B组与其他组比较,缺损处软骨充填较好,与正常软骨结合紧密,融合良好,组织学评分有差异,但A组与B组间评分无差异。至第12周,可见A组及B组关节面平滑,结合紧密,与周围软骨结合良好,移植物界限基本消失。大体评分A组、B组均优于其他组,且A组与B组间差异有显着性。组织学观察显示,修复组织A组类似透明软骨,B组接近纤维软骨,C组与D组细胞以纤维组织为主。PCR检测仅在A、B两组中见Ⅱ型胶原mRNA合成,且A组RNA表达优于B组。结论：体外经外源性透明质酸诱导的间充质干细胞在实验动物体内较好保持了软骨细胞形态与功能,有较好的修复软骨缺损的能力。未经诱导的间充质干细胞在体内关节腔环境的综合影响下可向软骨形态分化,也拥有一定的软骨修复能力,但这种能力明显逊于已诱导干细胞。经诱导的干细胞的成软骨能力随时间迁移逐渐明显。(本文来源于《山东大学》期刊2012-05-20）
刘艳[3]（2011）在《嗜热丝氨酸蛋白酶TfpA的外源表达与分子定向改造》一文中研究指出低质量蛋白消化利用率不高导致蛋白质供应不足和环境氮污染已成为当今畜牧业的两大主要问题。羽毛巾粗蛋白含量超过80%,含有大量动物需要的氨基酸,但是动物消化系统对羽毛的消化利用率非常低。本研究旨在探讨从Thermonospora fusca YX中分离的一种稳定的碱性嗜热丝氨酸蛋白酶TfpA消化羽毛的能力与机理,对tfpA基因进行改造,筛选适合TfpA的表达系统。研究内容包括以下叁个方面：研究一TfpA酶降解羽毛能力及机理的探讨在BMMY培养基中诱导X33酵母和重组X33-pPICTFP酵母表达,分别取上清液消化羽毛。结果表明,重组X33-pPICTFP酵母表达上清液在NaN3的抑菌作用下能消化羽毛。为进一步研究羽毛被降解的作用机制,实验对不同浓度r-TfpA的还原酶活性进行检测,结果发现r-TfpA不具有还原酶活性。同时研究发现10mmol/L PMSF能抑制r-TfpA的82.7%蛋白酶活性,亦能抑制r-TfpA消化羽毛。在重组TfpA降解羽毛粉的实验中添加10mmol/L Na2SO3,通过测定8h、24h、48h上清液中的可溶性蛋白质生成量和游离氨基酸相对生成量发现,在叁个时间点上添加Na2SO3组蛋白质生成量较之对照组都有所提高,但差异都不显着(P>0.05),8h时添加Na2SO3组氨基酸生成量较之对照组提高了26.1%,差异显着(P<0.05),24h、48h两个时间点反而降低了3.9%、1.2%,但差异都不显着(P>0.05)。以上结果表明,r-TfpA能降解羽毛,同时发现r-TfpA并不具有还原酶活性,其降解能力与其蛋白酶活性有关；还原剂Na2SO3能够加速重组TfpA降解羽毛粉,但不能提高重组TfpA降解羽毛粉的能力。研究二定点突变tfpA基因的在毕赤酵母中的表达根据TfpA分子结构特点,利用分子生物学技术,设计11个定点突变,并以pPICTFP质粒为模板,进行PCR扩增得到突变pPICTFP质粒,并转化到毕赤酵母X33中,对重组酵母X33-pPICTFP突变进行诱导表达,纯化及Wetern blot分析。结果发现,在诱导上清液中,M14(R220Q)酶活性比WT高18.8%,而M9(G192P)、 M15(D219N)都降低了,其他8个重组突变酵母则没有表现出蛋白酶活性。分别对表达上清进行纯化,12%SDS-PAGE电泳结果显示,M9、M14和M15蛋白分子量大小都为21.7kDa,与WT在毕赤酵母中表达大小一致,Western blot验证为TfpA蛋白。测定蛋白酶比活力发现,M9、M14和M15酶比活力分别提高到WT的235%、129%和231%。以上结果表明,实验获得了TfpA在毕赤酵母中高表达量菌株X33-pPICTFP-M14,和高酶比活力突变蛋白酶M9、M14和M15。研究叁tfpA基因在酿酒酵母中的表达分别诱导酿酒酵母INVSc1、重组INVSc1-pYETFP、毕赤酵母X33和重组X33-pPICTFP,分析其生长曲线及产酶趋势。结果发现,酿酒酵母表达TfPA第4d收集上清的蛋白酶活性为246.5U/mL,明显高于同样条件下毕赤酵母表达TfPA第4d收集上清的160U/mL。在YPG培养基中诱导表达重组INVSc1-pYETFP,将发酵液进行离心,取上清进行生物膜浓缩、硫酸铵沉淀,采用分子筛G-50进行纯化和Western blot分析。SDS-PAGE电泳结果显示,蛋白分子量大小为21.7kDa,与WT在毕赤酵母中表达大小一致,Western blot验证为TfpA蛋白。测定r-TfpA蛋白酶比活力为5915U/mg,为毕赤酵母表达纯化r-TfpA的2.4倍。以上结果表明,较之毕赤酵母系统,在酿酒酵母系统中表达TfpA更具有优越性。综上所述,本研究首次揭示了TfpA酶对羽毛的降解能力,并进一步对其降解机制进行了研究。同时通过对TfpA活性中心的分子改造,获得了高表达量的重组TfpA菌株和高酶比活力的TfpA突变酶。此外,本研究通过TfpA在酿酒酵母和毕赤酵母中表达的比较,发现酿酒酵母系统提高了TfpA表达量和酶比活力。(本文来源于《四川农业大学》期刊2011-12-05）
寇建强[4]（2011）在《外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的影响》一文中研究指出背景：骨髓间充质干细胞有多向分化潜能,在不同的诱导条件下可以分化成许多不同的组织,近年来已成为组织工程软骨构建过程中最常用的种子细胞。目的：通过分析外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对骨髓间充质干细胞的作用。方法：全骨髓法+贴壁培养法分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入透明质酸诱导液,以转化生长因子β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7,14,21 d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果：经透明质酸诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性, RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结论：外源性透明质酸具有诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的能力,但比转化生长因子β3的诱导能力弱。结果提示,关节腔内环境对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化有正性促进作用,支持透明质酸作为软骨组织工程基质使用。(本文来源于《青岛大学》期刊2011-05-06）
寇建强,王昌耀,王英振[5]（2011）在《外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞定向分化为软骨细胞的影响》一文中研究指出背景:透明质酸是关节腔滑液最主要的成分,对细胞的形态发生起着非常重要的作用,但其用于软骨缺损修复时对骨髓间充质干细胞的影响如何呢?目的:通过分析外源性透明质酸对兔骨髓间充质干细胞体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对骨髓间充质干细胞的作用。方法:全骨髓法+贴壁培养法分离培养兔骨髓间充质干细胞,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入透明质酸诱导液,以转化生长因子β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7,14,21d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果与结论:经透明质酸诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结果提示,外源性透明质酸具有诱导兔骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的能力,但比转化生长因子β3的诱导能力弱,关节腔内环境对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化有正性促进作用,支持透明质酸作为软骨组织工程基质使用。(本文来源于《中国组织工程研究与临床康复》期刊2011年03期）
姜朋涛,邢美芬,张戎,孙志达,杨晓帆[6]（2008）在《外源性IL-10对单核细胞定向分化为树突状细胞的影响》一文中研究指出目的:研究外源性IL-10对单核来源的树突状细胞(dendritic cells,DCs)的影响,为进一步认识IL-10在系统性红斑狼疮(system lupus erythemacosus,SLE)发病机制中的作用提供线索。方法:应用GM-CSF+IL-4+TNF-α体系诱导培养单核细胞来源的DCs,同时在该体系中加入与SLE患者血清浓度相当的外源性IL-10(30 pg/ml)。用流式细胞术检测DCs的表型(CD14、CD11c、CD1a、HLA-DR、CD80、CD86和CD83),CCK-8法检测Dcs刺激同种异体淋巴细胞增殖能力,ELISA法检测DCs分泌IL-12p40、IL-10和INF-γ水平。结果:30 pg/ml的外源性IL-10可使单核细胞来源的DCs(monocyte derived-DCs,MDDCs)HLA-DR、CD80、CD86和CD83的表达以及IL-12p40和IFN-γ的分泌水平受到抑制,并使其刺激同种异体T细胞增殖能力下降。结论:外源性IL-10对单核细胞定向分化为DCs产生了抑制作用。进一步证实IL-10在SLE发病机制中发挥了重要作用。(本文来源于《南京医科大学学报(自然科学版)》期刊2008年11期）
袁媛[7]（2007）在《外源性Wnt5a诱导K562细胞定向分化的研究》一文中研究指出目的:Wnt家族成员之一Wnt5a与其它家族成员一样,在个体发育中必不可少,近来研究发现它与肿瘤发生密切相关,但确切关系和作用机制不明,特别是它与白血病发生的关系和作用罕见报道。本研究观察了Wnt5a在髓细胞白血病病例和白血病细胞株中的表达情况,提示Wnt5a表达缺失可能与白血病发生有关。进而以外源性Wnt5a处理髓系白血病细胞株K562,观察其诱导K562细胞分化的作用。该研究为深入认识Wnt5a在白血病发生中的作用和机制打下了基础,并希望为白血病诊断提供新的肿瘤标志物和基因治疗靶点。方法:1.应用RT-PCR方法检测6例慢性髓细胞白血病患者和5例急性髓细胞白血病患者的骨髓或外周血标本,以及Jurkat、K562、HL-60等白血病细胞株中Wnt5a的表达。2.应用HEK293细胞扩增带有标记基因GFP的重组腺病毒AdWnt5a和对照AdGFP,并制备条件培养液:以AdWnt5a和AdGFP分别感染CHO细胞,16h后荧光显微镜下检测GFP表达,更换为低血清培养液继续培养,于48h后收集培养上清液,冷冻、干燥浓缩后,Western Blot鉴定Wnt5a蛋白的表达。3.分别以Wnt5a和GFP条件培养液连续培养K562细胞1～5d,并以台盼蓝染色进行活细胞计数和总细胞计数,绘制生长曲线并进行统计学分析。4.流式细胞仪分析Wnt5a条件培养液处理K562细胞1、3、5d时细胞周期的变化情况,并与对照组细胞进行比较。5.将Wnt5a、GFP条件培养液分别处理1～5d的K562细胞进行瑞姬氏染色,光镜下观察细胞形态的改变,并在透射电镜下观察细胞超微结构的变化。6.将Wnt5a和GFP条件培养液分别处理1～7d的K562细胞涂片固定,进行过氧化物酶(POX)、糖原(PAS)、α-醋酸萘酚(α-NAE)+氟化钠抑制试验的细胞化学染色,光镜下观察细胞阳性率并进行统计学分析。7.将Wnt5a和GFP条件培养液分别处理1～7d的K562细胞涂片固定,利用免疫细胞化学染色法检测单核细胞表面分化抗原CD13、CD68的表达,和粒细胞表面分化抗原CD14的表达,计算阳性率并进行统计学分析。结果:1.6例慢性髓细胞白血病病例均未表达Wnt5a,5例急性髓细胞白血病病例其中4例不表达或弱表达,仅1例高表达经查为完全缓解的病例。在K562、HL-60髓系白血病细胞株中Wnt5a也不表达,而Jurkat细胞有高表达,与文献报道一致,故以Jurkat作为实验中的阳性对照。2.用HEK293细胞扩增得到高滴度的重组腺病毒AdWnt5a和AdGFP上清液。分别以AdWnt5a和AdGFP上清感染CHO细胞,以制备Wnt5a和GFP条件培养液,荧光显微镜下观察到二者有较强的荧光信号,且Wnt5a条件培养液经Western Blot检测出了Wnt5a蛋白的表达。3.Wnt5a处理组、GFP对照组及未处理组的K562细胞,生长曲线显示,Wnt5a明显抑制K562细胞的增殖,但台盼蓝染色结果显示未影响到细胞的存活率。4.Wnt5a条件培养液处理5d的K562细胞与对照组细胞比较,细胞周期的G_2期增高了3.22倍,表明Wnt5a将细胞周期阻止在G_2期。5.光镜下与对照相比,经Wnt5a条件培养液处理的K562细胞:细胞体积缩小,核浆比减小,核染色质浓缩,核仁减少或消失,有的核出现了凹陷,并且出现了个别具有典型单核细胞形态的细胞。超微结构的变化:细胞核内异染色质增多,核仁减少或变小,胞质增多,核浆比减小,细胞器明显增多。6.Wnt5a处理后,K562细胞POX、PAS细胞化学染色的阳性率均明显提高,且与对照组相比差异显着。α-NAE染色呈强阳性,并且70%以上的阳性率可被氟化钠所抑制。7.Wnt5a处理组的K562细胞,其单核细胞系表面分化抗原CD14、CD68阳性率明显高于GFP对照组,二者差异显着;粒细胞系表面分化抗原CD13表达也增强,但与对照组比较无统计学意义。结论:1.RT-PCR方法检测发现,Wnt5a在90%的急、慢性髓细胞白血病和髓系白血病细胞株K562、HL-60中均表达缺失,而在1例完全缓解的病例中有表达,提示Wnt5a表达缺失可能与白血病的发生有关。2.Wnt5a条件培养液处理的K562细胞,与对照组相比:细胞生长明显受到抑制,细胞周期G_2期明显增高,提示Wnt5a可能将K562细胞周期阻滞在G_2期,使细胞不能进行正常的有丝分裂,从而抑制了细胞的增殖。3.Wnt5a条件培养液处理后细胞形态上出现了分化的表型,并观察到了个别典型的单核细胞形态,超微结构也显示有成熟的趋势。POX、PAS、α-醋酸萘酚(α-NAE)+氟化钠抑制的细胞化学染色结果表明,Wnt5a处理的K562细胞有向粒-单系统分化的现象。检测单核细胞系表面标志抗原CD14、CD68的免疫细胞化学染色结果,则进一步证实了外源性的Wnt5a可诱导K562细胞向单核细胞系分化的趋势。以上研究提示,Wnt5a表达缺失可能是髓细胞白血病发生的原因之一,Wnt5a可能在其中起到了抑癌基因的作用,该研究结果为白血病的基因诊断和治疗研究奠定了基础。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2007-11-01）
李俊,方小平,王转,李均,罗莉霞[8]（2006）在《外源基因定向插入甘蓝型油菜C基因组》一文中研究指出外源基因定向插入C基因组对于降低转基因甘蓝型油菜(Brassica napus,AACC)的生态环境风险具有十分重要的作用．本研究利用农杆菌介导的遗传转化方法将抗除草剂bar基因转入到芥蓝(B．oleracea var．alboglabra,CC)中,以转bar基因的芥蓝(CbCb)为父本,非转基因的白菜(B．rapa,AA)为母本,通过种间杂交、子房培养和染色体加倍,获得bar基因定向插入C基因组的人工合成甘蓝型油菜株系67个．PCR结果表明,人工合成的甘蓝型油菜bar基因为阳性的株系31个,阴性的株系36个．Basta(?)喷施结果表明,分子检测阳性的人工合成甘蓝型油菜高抗除草剂,分子检测阴性人工合成甘蓝型油菜则不抗．Southern blotting分析结果表明,外源bar基因已整合到人工合成甘蓝型油菜的基因组中．(本文来源于《科学通报》期刊2006年12期）
王丽,冯炎,傅小龙,蔡旭伟[9]（2006）在《外源性Smad7基因小鼠肺内定向表达的研究》一文中研究指出目的探讨放射线诱导Egr-1基因启动子调控腺病毒介导的Smad7基因在小鼠肺内表达的规律性、其表达的细胞内定位及小鼠耐受性。方法将Egr-1基因启动子的放射敏感元件和Smad7 cDNA包装到复制缺陷型腺病毒内,制备成AD．Egr-Smad7。120只C57BL／6J小鼠随机分组进入实验,每组6只。小鼠气管内给药,24 h后单次全胸放射。(1)66只分为11组:生理盐水组、AD．Egr-Smad7及未包装Egr-Smad7腺病毒(各分5个不同病毒滴度)组,观察给药后呼吸困难、紫绀情况及72 h内死亡情况,研究重组腺病毒滴度与小鼠急性耐受性关系。(2)36只分为6组:空白对照(C)组、单纯放射(R)组、AD．Egr-Smad7未放射(RA)组、AD．Egr-Smad7放射(RAR)组、未包装Egr-Smad7病毒未放射(AV)组及未包装Egr-Smad7病毒放射(AVR)组,放射8 Gy,5 h后免疫组织化学法检测外源性Smad7基因肺内表达的细胞内定位。(3)168只分为28组:C组、R组、RA组、BAR组、AV组及AVR组(各组按照腺病毒滴度又分为1×108、5×108、1×109 pfu／0．1 ml组,按照放射后时间又分为6 h及9 h组),放射8 Gy,研究重组腺病毒滴度与外源性Smad7基因肺内表达的关系。(4)324只分为54组:C组、R组、RA组、RAR组、AV组及AVR组(各组按照射后时间又分为放射后0、1、2、3、5、7、9、12及15 h组),放射8 Gy,研究照射后不同时间Smad7基因肺内表达的时效关系。(5)126只分为21组:C组、R组、RA组、RAR组、AV组及AVR组(各放射组按放射剂量又分为5、8、10、12、15及20 Gy组),照射后5 h研究Smad7基因肺内表达与放射剂量的关系。采用Western印迹法检测小鼠肺组织Smad7蛋白表达。结果重组腺病毒滴度在109pfu及以下时,小鼠可安全耐受,各组6只均存活,而5×109pfu及以上组小鼠5只以上死亡。AVR组外源性Smad7基因在肺泡上皮细胞、血管内皮细胞及细支气管上皮细胞胞浆内均有明显表达,而各对照组未见表达。外源性Smad7基因表达随重组腺病毒滴度升高而增加(P<0．01);单次放射0-12 Gy间其表达随放射剂量升高而增加,15 Gy时下降;放射后2-9 h其表达量最高(P<0．05),而后降低,15 h降至接近正常水平。结论重组腺病毒滴度在109pfu及以下时,小鼠可安全耐受。以腺病毒为载体,辐射诱导Egr-1启动子能够调控外源性Smad7基因在小鼠肺组织各种细胞胞质内广泛表达,外源性Smad7基因表达随重组病毒滴度升高而增加,并与放射剂量及放射后间隔时间有关。(本文来源于《中华医学杂志》期刊2006年26期）
李俊[10]（2006）在《外源基因定向插入甘蓝型油菜C基因组的研究》一文中研究指出转基因甘蓝型油菜的环境释放导致外源基因扩散到其野生近缘种形成超级杂草已引起人们广泛关注。加拿大已经在野生白菜种群中发现了抗除草剂外源基因。因此,转基因油菜的生态安全研究重点应在降低转基因向其近缘种扩散的生态风险上,而降低外源基因向A或AB基因组物种扩散的几率是解决转基因甘蓝型油菜生态风险的关键因素之一。根据芸薹属物种间相互杂交的细胞遗传学研究成果,甘蓝型油菜与白菜和芥菜类植物间有同源的A基因组,但无同源的C基因组染色体。因此,甘白或甘芥杂种在与B.rapa或Bjuncea回交或自交时,在染色体重组过程中C染色体由于没有与其同源的染色体配对而很容易丢失,即当外源基因位于甘蓝型油菜C染色体上时基因扩散的生态风险可能小。 本研究通过将bar基因转入芥蓝(CC)基因组中,以转基因芥蓝(CC,2n=18)与非转基因白菜(AA,2n=20)正反交,以人工合成不同胞质甘蓝型油菜(AACC,2n=38)的方式,获得C基因组转bar基因甘蓝型油菜。并对获得的C基因组转bar基因甘蓝型油菜进行了分子生物学、细胞遗传学、转基因遗传、花粉育性及农艺性状等研究。主要研究结果如下: 1.通过对影响芥蓝遗传转化的各个条件,如再生体系、外植体种类、农杆菌菌液浓度及共培养时间等参数的优化研究,建立了高效的农杆菌介导的芥蓝遗传转化体系,以子叶为外植体的最高转化频率达到了8.48%,以下胚轴为外植体的最高转化频率为7.17%。 2.通过白菜和转bar基因芥蓝的正反交,利用子房培养和胚培养的方法人工合成了分别具有白菜和甘蓝细胞质的C基因组转bar基因甘蓝型油菜,建立了不同胞质人工合成甘蓝型油菜的胚培养体系。以白菜为母本的正交共获得75个人工合成油菜株系,杂种苗诱导率(HPR)为2.32%;反交获4个株系,杂种苗诱导率(HPR)为1.16%。 3.PCR、PCR-Southern blot和PPT抗性检测结果表明,有31个株系是转基因阳性株系;对转基因芥蓝及人工合成油菜进行基因组Southern blot的比较结果表明,C基因组上的外源基因在人工合成油菜中未发生改变,即位于人工合成的甘蓝型油菜C基因组上。 4.对人工合成的甘蓝型油菜减数分裂行为观察结果表明,A、C2个染色体组在甘蓝型油菜细胞内保持独立,在减数分裂前期Ⅰ表现分裂速度存在差异,在后期Ⅰ,末期Ⅰ以及第二次减数分裂过程中很少出现染色体的异常配对现象。而人工合成油菜最初几代的染色体结构变化可能更多的来源于基因组内部的易位和重组。 5.C基因组转bar基因甘蓝型油菜中的外源基因向白菜和芥菜扩散规律研究初步结果表明,甘白杂种(34%以下)和甘芥杂种(28%以下)的育性都低,但甘白杂种的生存适合度高于甘芥杂种。甘白杂种与白菜回交一代的抗性转基因植株比例为33.03%,与Metz等的研究结果类似,初步表明外源基因在C基因组上能够降低转基因甘蓝型油菜的基因漂移风险。后续研究工作还在进行之中。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2006-06-01）
外源定向论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
1、骨髓来源间充质干细胞的提取、培养与扩增目的：优化获取兔骨髓间充质干细胞方法,并对细胞进行纯化、鉴定及扩增,同时对其生物学性状进行研究。方法：取新生新西兰大耳白兔骨髓5.0ml,采用密度梯度离心法、贴壁筛选法并结合传代对其进行纯化,观察细胞形态和表面标志物的表达,从而对其进行鉴定。观察第1、3、5、7代细胞的增殖情况,并绘制出生长曲线。结果：经密度梯度离心、贴壁筛选并结合细胞传代均可得到贴壁细胞集落,密度梯度离心集落形成率稍高,但贴壁筛选法操作更简便。传代至第3代和第5代细胞形态单一,细胞排列具有典型的漩涡状结构。第1、3、5代细胞增殖能力强,生长旺盛；至第7代细胞增殖明显减弱。所分离培养的细胞表达CD44、CD90,不表达CD34。结论：分离培养的细胞为间充质干细胞,且成份单一,具有多向分化潜能,且无造血系干细胞标志。经体外传代,增殖能力强,适宜作为种子细胞进行下一步研究。2、外源性透明质酸对MSCs增殖及分化情况的影响目的：通过研究外源性透明质酸(hyaluronic acid, HA)对兔骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, Mscs)体外增殖及定向分化为软骨细胞的影响,探讨关节腔内环境对Mscs的作用,为Mscs为基础的组织工程化软骨的临床应用奠定基础。方法：全骨髓法+贴壁培养法分离培养兔Mscs,取第4代细胞用于实验,实验组细胞加入HA诱导液(含0.25mg/ml HA+含10%FBS的HG-DMEM),以TGF-β3诱导组作为阳性对照,阴性对照组加入常规培养液。分别于诱导后第7、14、21d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果：经HA诱导后,细胞增殖速度减慢,由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性和Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,但表达均比阳性对照组弱。结论：外源性HA具有诱导兔Mscs向软骨细胞分化的能力,但比TGF-β3的诱导能力弱。提示关节腔内环境对Mscs向软骨细胞分化有正性促进作用,支持HA作为软骨组织工程基质使用。3、不同浓度透明质酸对骨髓来源间充质干细胞成软骨分化的影响目的：探讨不同浓度透明质酸对骨髓来源间充质干细胞向软骨方向定向分化的影响。方法：取P3代未诱导的骨髓来源间充质干细胞,按培养液中添加的透明质酸浓度不同分为两实验组,A组：低浓度组(基础培养基+HA0.1mg/m1),B组：高浓度组(基础培养基+HA0.2mg/m1)。同时设立空白对照组(基础培养基)及阳性对照组(基础培养基+10ng/ml TGF-β3),观察细胞形态,增殖情况并绘制生长曲线,分别于诱导后第7、14、21d行免疫组化染色及RT-PCR检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果：经添加软骨诱导剂后,干细胞细胞增殖速度放缓,形态由长梭形变为多角形、椭圆形,胞浆Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,半定量分析显示两实验组Ⅱ型胶原表达无差异,但均比阳性对照组弱,空白对照组无Ⅱ型胶原表达。结论：不同浓度外源性HA诱导兔Mscs向软骨细胞分化的能力无差异,且均比TGF-β3的诱导能力弱。提示HA作为细胞外基质的主要成分,有促进Mscs向软骨细胞分化的作用,但改变外环境中透明质酸浓度不会影响Mscs的软骨分化。自体关节腔内环境支持以干细胞为基础的组织工程化软骨修复软骨缺损。4、不同分-子-量透明质酸对骨髓来源间充质干细胞成软骨分化的影响目的：探讨不同分子量透明质酸对骨髓来源间充质干细胞向软骨方向定向分化的影响。方法：取P3代未诱导的骨髓来源间充质干细胞,培养液中分别添加不同分子量透明质酸做诱导剂,分为叁个实验组,A组：低分子量组(基础培养基+HA0.1mg/ml,平均分子量约1000kD),B组：中分子量组(基础培养基+HA0.1mg/ml,平均分子量约1800kD),高分子量组(基础培养基+HA0.1mg/m1,平均分子量约2000kD)。同时设立空白对照组(基础培养基)及阳性对照组(基础培养基+10ng/ml TGF-β3),观察细胞形态,增殖情况并绘制生长曲线,分别于诱导后第7、14、21d行甲苯胺蓝染色检测蛋白聚糖表达,另外采用免疫组化染色及RT-PCR方法检测细胞Ⅱ型胶原表达。结果：经添加软骨诱导剂后,干细胞细胞增殖速度放缓,形态由长梭形变为多角形、椭圆形,细胞外基质呈甲苯胺蓝异染性,胞浆Ⅱ型胶原免疫组化阳性,RT-PCR检测示Ⅱ型胶原mRNA表达阳性,表现出软骨细胞的分化特点,半定量分析显示实验组Ⅱ型胶原表达与对照组有差异,但B、C组间Ⅱ型胶原表达相似,空白对照组无Ⅱ型胶原表达。结论：不同分子量外源性HA诱导兔Mscs向软骨细胞分化的能力存在差异,分子量高的HA的诱导能力较低分子量HA的诱导能力强。证明透明质酸的分子量与Mscs的软骨分化有关联性,但均比TGF-β3的诱导能力弱。提高关节腔内透明质酸分子量对干细胞为基础的组织工程化软骨修复软骨缺损有帮助。5、外源性透明质酸诱导骨髓间充质干细胞修复兔膝关节软骨缺损的研究目的：探讨外源性透明质酸(hyaluronic acid, HA)诱导的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)对全层软骨缺损修复的效果,了解体内条件下经外源性透明质酸诱导的干细胞能否保持软骨分化表型,促进软骨修复。方法：4月龄日本大耳白兔24只,用手摇钻制成直径5mm、深4mm的圆柱形膝关节软骨缺损。分四组分别植入藻酸盐凝胶混合的经透明质酸诱导后兔骨髓间充质干细胞(组A,n=6),藻酸盐凝胶混合的未经诱导的兔骨髓间充质干细胞(组B,n=6),单纯藻酸盐凝胶组(组C,n=6),及缺损处不处理(组D,n=6)。术后5、8和12周观察软骨缺损修复情况,进行组织学评分。HE染色观察软骨细胞情况,RT-PCR检测修复组织中Ⅱ型胶原mRNA合成情况。结果：术后第8周,A组及B组与其他组比较,缺损处软骨充填较好,与正常软骨结合紧密,融合良好,组织学评分有差异,但A组与B组间评分无差异。至第12周,可见A组及B组关节面平滑,结合紧密,与周围软骨结合良好,移植物界限基本消失。大体评分A组、B组均优于其他组,且A组与B组间差异有显着性。组织学观察显示,修复组织A组类似透明软骨,B组接近纤维软骨,C组与D组细胞以纤维组织为主。PCR检测仅在A、B两组中见Ⅱ型胶原mRNA合成,且A组RNA表达优于B组。结论：体外经外源性透明质酸诱导的间充质干细胞在实验动物体内较好保持了软骨细胞形态与功能,有较好的修复软骨缺损的能力。未经诱导的间充质干细胞在体内关节腔环境的综合影响下可向软骨形态分化,也拥有一定的软骨修复能力,但这种能力明显逊于已诱导干细胞。经诱导的干细胞的成软骨能力随时间迁移逐渐明显。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
外源定向论文参考文献
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