一、人骨髓间充质干细胞的分离培养及向成骨细胞定向分化的实验研究（论文文献综述）
肖艳宇[1]（2021）在《gga-let-7a-5p通过靶向GDF6调节鸡骨髓间充质干细胞多向分化》文中研究说明骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSC）,是一种常见的干细胞,可以定向诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、肌肉细胞、神经细胞等,在分化过程中细胞及外观特征发生变化,细胞标志物也会随之发生变化。Micro RNA是由一段核苷酸形成的微小RNA序列,其在细胞内利用调控靶基因来行使功能。Micro RNA在干细胞的增殖分化中发挥不容忽视的作用。本试验的目的是分离和培养具有多向分化潜能的鸡BMSCs,探究gga-let-7a-5p靶向GDF6对BMSCs多向分化的调控作用,为gga-let-7a-5p调控BMSCs在再生医学上的应用和疾病治疗提供实验基础与参考依据。1、鸡BMSCs分离培养及其多向分化潜能验证。利用全骨髓贴壁法从孵育16-18天鸡胚中获取BMSCs,经过多次更换培养液与控制消化时间的方法对BMSCs进行纯化。通过观察细胞外观特征、免疫荧光检测CD29、CD44以及波形蛋白的表达、集落形成能力试验,对本试验分离的BMSCs初步鉴定。为验证BMSCs的分化潜能,对BMSCs进行定向诱导为成骨、脂肪、肌肉、神经细胞。通过q-PCR和免疫荧光检测这4种细胞各自标志基因表达水平,结合各自的特异性染色,证明BMSCs具有多向分化潜能。结果表明:（1）本试验获得的BMSCs呈纤维状、梭状,且经过多次传代,细胞形态保持不变;（2）免疫荧光检测表明BMSCs表达CD29、CD44以及波形蛋白;（3）BMSCs培养10天时均形成细胞数超过50的细胞集落,表明这些BMSCs具有良好增殖能力;（4）BMSCs向成骨细胞分化时,细胞表面被茜素红染成红色,并表达其标志基因RUNX2、COL1A1、BGLAP和BMP2;（5）BMSCs向脂肪细胞分化时,油红O染色呈阳性,并表达其标志基因PPARG、FABP4、CEBPA和CEBPB;（6）BMSCs向肌肉细胞分化时,表达其标志基因Myo D1、myf5、Myo G和Pax7;（7）BMSCs向神经细胞分化时,甲苯胺蓝染色呈阳性,并表达其标志基因NES、TUBB3、NGF和MAP2。2、gga-let-7a-5p差异表达对BMSCs定向分化能力的影响。首先用gga-let-7a-5p增强剂（mimics）或抑制剂（inhibitors）转染BMSCs进行差异化表达,然后再将这些BMSCs定向诱导分化为成骨、脂肪、肌肉、神经细胞,q-PCR检测相应的分化标志基因,并进行相应的特异性染色。结果表明:（1）gga-let-7a-5p过表达时,成骨细胞、肌肉细胞和神经细胞标志基因m RNA表达上调,而脂肪细胞标志基因m RNA表达下调;（2）gga-let-7a-5p表达受抑制时,成骨细胞、肌肉细胞和神经细胞标志基因m RNA表达下调,但脂肪细胞标志基因m RNA表达上调。3、GDF6过表达对BMSCs定向分化能力的影响。依据gga-let-7a-5p靶基因预测的结果,构建靶基因GDF6过表达质粒（pc DNA3.1-EGFP-GDF6）,并将其转染BMSCs,再将其分别诱导成成骨、脂肪、肌肉、神经细胞,q-PCR检测相应的分化标志基因,并进行相应的特异性染色。结果表明,GDF6过表达时,成骨细胞、肌肉细胞和神经细胞标志基因m RNA表达下调,而脂肪细胞标志基因m RNA表达上调。总而言之,本研究获得了具有良好增殖能力的BMSCs,表达干细胞标志基因CD29、CD44以及波形蛋白,而且能诱导分化为成骨、脂肪、肌肉、神经细胞,具有多系谱分化的能力;gga-let-7a-5p差异表达和GDF6过表达后BMSCs定向诱导分化试验证明,gga-let-7a-5p促进BMSCs向成骨细胞、肌肉细胞、神经细胞分化,抑制BMSCs向脂肪细胞分化;而GDF6过表达则得到相反的结果,证明gga-let-7a-5p靶向作用于GDF6,促进BMSCs分化为成骨、肌肉、神经细胞,但脂肪细胞的分化受到了阻碍。
李强强[2]（2021）在《新型镁合金对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响及机制研究》文中指出目的:（1）体外分离、培养及鉴定SD大鼠骨髓间充质干细胞的研究;（2）研究新型镁合金对SD大鼠骨髓间充质干细胞功能的影响;（3）研究新型镁合金对SD大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用及机制。方法:（1）体外分离、培养及鉴定SD大鼠骨髓间充质干细胞:全骨髓贴壁法分离培养、纯化BMSCs;观察细胞形态,绘制细胞生长、贴壁率曲线;检测BMSCs表面标志物、诱导成骨等方法进行鉴定。（2）新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金对SD大鼠BMSCs功能影响:实验分为5组,分别为无新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液的对照组,25%、50%、75%、100%浓度的新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液的实验组。取BMSCs分别与25%、50%、75%、100%浓度的新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液培养,设立对照组,观察细胞生长情况;研究不同浓度新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液对BMSCs黏附（CCK-8法）及增殖的影响;同时研究其对BMSCs凋亡的影响。（3）新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金对SD大鼠BMSCs成骨分化作用的研究:将从SD大鼠提取分离的BMSCs培养,实验分为5组,实验组加入含有上述不同浓度新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液的成骨诱导培养基,对照组加入等量的成骨诱导培养基,培养至第3周,采用茜素红染色法检测矿化能力;培养至第2周,测定碱性磷酸酶活性;荧光定量PCR检测成骨相关基因Runx2、OCN、OPN的表达情况;采用Western blot法检测成骨相关蛋白Runx2、OCN、OPG的表达情况。结果:（1）SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、培养及鉴定:应用全骨髓贴壁法可在体外分离出纯度高的BMSCs;24小时内BMSCs几乎完全贴壁且细胞贴壁率随培养时间增加而上升,说明其活性良好;BMSCs生长曲线基本符合正常细胞生长曲线;P3代BMSCs经流式细胞鉴定:CD44、CD90高表达,CD31、CD45低表达;定向诱导向成骨细胞分化,可见明显矿化结节。（2）新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金对SD大鼠BMSCs功能影响的研究:（1）细胞黏附:除100%浓度浸提液组外,随着培养时间延长,细胞黏附数量增加;与不含浸提液组比较,1小时、3小时、5小时、7小时浸提液组中,75%浓度浸提液组细胞黏附数量增长最显着,差异有统计学意义（P<0.05）;（2）细胞增殖:第1、3、5、7天,各浸提液细胞数量均高于对照组,75%浓度浸提液最高（P<0.05）;（3）细胞凋亡:流式细胞仪检测结果显示未见明显细胞凋亡（P>0.05）。（3）新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金对SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化作用的研究:（1）茜素红染色:5组细胞茜素红染色均有矿化结节形成,与对照组比较,实验组增加明显;（2）碱性磷酸酶活性:新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液干预SD大鼠BMSCs,第7天和第14天各组ALP活性检测结果示:各组碱性磷酸酶活性第14天高于第7天,与空白组比较,各浸提液组均高于空白组,各组间差异均有统计学意义（P<0.05）。第7天和第14天,75%浓度浸提液组碱性磷酸酶活性最高（P<0.05）;（3）RT-PCR检测成骨相关基因的表达:与无新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液对照比较,新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液组成骨相关基因Runx2、OPN、OCN的表达增高（P<0.05）,75%浓度最高,有显着性差异（P<0.05）。（4）Western blot法检测成骨相关蛋白的表达:新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金浸提液各组均能提高成骨相关蛋白OCN、Runx2、OPG的表达（P<0.05）。结论:（1）应用全骨髓贴壁培养法体外可成功分离BMSCs。（2）新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金对SD大鼠骨髓间充质干细胞黏附、增殖具有促进作用,无明显细胞毒性,对其凋亡无明显影响,具有良好的生物相容性。（3）新型Mg-Nd-Gd-Sr-Zn-Zr合金可促进SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化。
吴博[3]（2021）在《SEMA3B调控miR-214信号通路对老年性骨质疏松患者BMMSC成骨分化的影响研究》文中进行了进一步梳理目的:明确SEMA3B/miR-214/Osterix通路对老年性骨质疏松患者BMMSC成骨分化的调控作用。方法:在需行髋关节置换的老年患者中,用QCT骨密度测量技术分成骨质疏松和非骨质疏松组。采用全骨髓贴壁法对术中收集的骨髓进行分离培养,获得BMMSC。利用流式细胞技术对其鉴定,碱性磷酸酶活性测定和ARS染色检测成骨分化能力。通过Real-time PCR检测SEMA3B、miR-214及Osterix在老年骨质疏松和非骨质疏松组BMMSC中的表达。利用在线数据库及荧光素酶报告基因明确miR-214与SEMA3B和Osterix之间的潜在靶点关系。通过AGO2-RIP试验进一步验证SEMA3B、miR-214的交互作用。通过诱导老年骨质疏松组BMMSC的成骨分化,在0th/3th/7th/10th/14th/21th天Real-time PCR检测SEMA3B、miR-214、Osterix及成骨相关基因（OCN、ALP、Runx2）的表达。然后,采用慢病毒质粒转染技术明确SEMA3B/miR-214/成骨基因信号通路的调控关系,进一步阐明老年性骨质疏松疾病的发病机制。结果:（1）BMMSC分离、培养、纯化和鉴定实验过程中对BMMSC进行分离、培养,可以得到老年骨质疏松和非骨质疏松组的BMMSC。通过流式细胞学技术鉴定,90%以上BMMSC中CD29、CD90呈现阳性,CD34、CD45表达阴性,其结果与原代表型一致。通过ALP活性测定和ARS染色,我们发现与非骨质疏松组的BMMSC相比,骨质疏松组ALP活性减弱,橙红色钙沉积物明显减少（P<0.05）,符合骨质疏松和非骨质疏松BMMSC的细胞特性。（2）Real-time PCR检测SEMA3B、miR-214及Osterix在老年骨质疏松和非骨质疏松组BMMSC中的表达我们通过实验发现,与非骨质疏松组相比,老年骨质疏松组BMMSC中的SEMA3B、Osterix的表达均降低,而miR-214表达显着提高（P<0.01）,表明SEMA3B、Osterix及miR-214在老年骨质疏松和非骨质疏松组BMMSC中存在表达差异,提示SEMA3B、Osterix及miR-214在老年性骨质疏松的发生发展存在相关性。（3）在线数据库、荧光素酶报告基因以及AGO2-RIP试验利用在线数据库Target Scan筛选出了SEMA3B与miR-214、miR-214与Osterix之间的靶结合位点,通过荧光素酶报告基因验证了SEMA3B与miR-214、miR-214与Osterix之间确实可以发生特异性结合。通过AGO2-RIP试验,进一步验证了SEMA3B、miR-214可以发生特异性结合。（4）SEMA3B、miR-214、Osterix及其成骨相关基因在老年骨质疏松组BMMSC的成骨分化过程中的表达。通过诱导老年骨质疏松组BMMSC的成骨分化,我们在第0/3/7/10/14/21天分别测量SEMA3B、miR-214、Osterix及其成骨相关基因的表达水平,我们发现SEMA3B、Osterix及其成骨相关基因随着诱导成骨分化时间的增加,其表达水平也逐渐增高,而miR-214表达水平会随诱导时间增加而逐渐减少（P<0.05）。在老年骨质疏松组BMMSC的成骨分化过程中,其SEMA3B与成骨相关基因、Osterix的表达成正相关,而与miR-214的表达呈负相关。miR-214与成骨相关基因、Osterix的表达呈负相关。（5）慢病毒及质粒转染通过慢病毒或质粒载体转染老年骨质疏松患者BMMSC,分别使SEMA3B、miR-214的沉默（干扰）或过表达,检测其基因的表达水平。我们发现沉默SEMA3B时,其Osterix和成骨相关基因的表达水平降低,而miR-214的表达水平增高,BMMSC成骨分化能力减弱。过表达SEMA3B时,Osterix和成骨相关基因的表达水平增高,而miR-214的表达水平降低,BMMSC成骨分化能力增高;干扰miR-214表达时,其Osterix和成骨相关基因的表达水平增高,BMMSC成骨分化能力增强。过表达miR-214时,其Osterix和成骨相关基因的表达水平降低,BMMSC成骨分化能力减弱。另外,与对照组相比,无论过表达（或干扰）miR-214时,相应的SEMA3B表达量差异均无显着意义（P>0.05）。结论:实验表明,SEMA3B对老年骨质疏松患者BMMSC具有促进成骨作用,而miR-214具有抑制成骨作用。lncRNA-SEMA3B可以负调控miR-214的表达,且可与miR-214发生特异结合。成骨分化相关分子Osterix为miR-214的潜在靶基因,且其表达受miR-214的负向调控。综上所述,SEMA3B/miR-214/Osterix信号通路参与了调控老年性骨质疏松患者BMMSC成骨分化的过程。
高飞[4]（2020）在《AGEs通过Wnt/β-catenin通路抑制BMSCs成骨分化及PTH的干预作用》文中研究说明糖尿病及骨质疏松症都是发病率很高的慢性进展性疾病,二者均影响患者生活质量,是造成患者致残及致死的主要原因之一。晚期糖基化终末产物（AGEs）是体内各脏器蛋白质在非催化酶参与的Maillard反应中,形成的多种结构稳定而不可逆的化合物。高血糖时,晚期糖基化终末产物生成加速,是造成多种糖尿病慢性并发症及原发性骨质疏松症的主要成因。一定条件下,骨髓间充质干细胞（MSCs）可以诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。来源于链尿霉素诱导的糖尿病鼠的骨髓间充质干细胞更趋向于衰老,增殖及分化能力减弱。体外实验中,AGEs抑制MSCs的增殖、自我更新及分化。AGEs增加晚期糖基化终末产物受体（RAGE）表达,抑制MSCs的矿化及成熟。体内、外实验均证明AGEs-RAGE可从多个方面影响骨质量,是糖尿病致骨质疏松的主要成因之一。Wnt/β-catenin信号通路调节骨形成与骨分化,促进骨髓间充质干细胞成骨,抑制成脂。细胞外的Wnt糖化蛋白与细胞表面受体结刺激细胞内事件合后发生,最具代表性的Wnt信号通路是经典的Wnt/β–catenin信号通路。既往研究多集中于AGEs或RAGE作用于骨髓间充质干细胞株或成骨细胞系的机制研究,然而,AGEs在原代培养的骨髓间充质干细胞增殖中的作用及机制报道不多。本研究探讨晚期糖基化终末产物在原代培养骨髓间充质干细胞层面抑制成骨分化机制及甲状旁腺素（PTH）的干预作用及机制,为糖尿病致骨质疏松的防治提供理论基础。第一部分大鼠BMSCs的分离、培养与鉴定目的:诱导、纯化BMSCs,观察BMSCs的成骨细胞、成脂细胞分化能力,进行BMSCs表面标记物的鉴定。方法:取4周龄健康雄性Sprague Dawley（SD）大鼠,脱颈处死后,分离双下肢,提取骨髓间充质干细胞,接种于培养瓶中,于37℃、5%CO2的孵育箱中孵育。采用1:2的比例传代培养,在倒置显微镜下观察第三代骨髓间充质干细胞贴壁细胞的形态改变以及生长变化;连续观察1周,通过血细胞计数板计数绘制细胞生长曲线;流氏细胞仪进行第三代BMSCs细胞表型鉴定;茜素红染色及油红O染色观察BMSCs成骨细胞、成脂细胞诱导分化能力。结果:原代BMSCs形态以梭形细胞为主,呈现放射状的集落细胞单位排列,伴随传代增加,细胞形态较前变短,且见伸出足突。细胞生长曲线提示传代培养的骨髓间充质干细胞符合正常细胞的生长特征且细胞生长能力良好。第三代骨髓间充质干细胞CD29,CD44,CD90表达为阳性,CD34,CD45表达隐阴性。骨髓间充质干细胞经成骨诱导分化后,茜素红染色、Von Kossa染色呈阳性。骨髓间充质干细胞经成脂诱导分化后,油红O染色呈阳性。结论:全骨髓贴壁培养法培养骨髓间充质干细胞,其操作步骤简单,且满足大量分离、纯化、扩增要求。培养成熟的细胞符合骨髓间充质干细胞的生物学特征,经诱导分化后具有成骨及成脂分化潜能。第二部分Wnt/β–catenin信号通路介导AGEs抑制BMSCs成骨分化目的:AGEs通过Wnt/β-catenin信号通路介导抑制骨髓间充质干细胞的成骨分化。方法:不同浓度AGEs（0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml）干预骨髓间充质干细胞细胞72小时,CKK-8法鉴定细胞增殖水平。选择0.2mg/ml AGEs和小牛血清白蛋白干预,细胞培养至3-7天CCK法测定细胞增殖情况,成骨液诱导第7天RT-PCR测定Col-Ⅰ及LRP5mRNA表达,Western-blot检测AGEs对BMSCs成骨分化过程中B-cateninm、OSX、RUNX2、RAGE表达量的影响,28天茜素红染色比较矿化结节形成差异。给予RAGE中和抗体阻断RAGE信号通路后观察AGEs对ALP、LRP5、RUNX2、OSX和RAGEmRNA及B-cateninm、OSX、RUNX2、RAGE蛋白表达的影响。给予Wnt/β-catenin通路促进剂Wnt3a后观察β-catenin、OSX、RAGE蛋白表达的影响。结果:在BMSCs培养基中分别加入不同浓度AGEs后与相应浓度的BSA组比较,BMSCs的OD值都有所降低,且在0.05mg/ml0.2mg/ml范围内（P<0.05）。0.2mg/ml的AGEs及相应浓度的BSA作用细胞3-7天,AGEs组较BSA组BMSCs的增殖情况有差异（P<0.05）。AGEs组作用于BMSCs28天后较对照组矿化结节的形成数量减少。选用含0.2mg/ml AGEs的成骨诱导液培养细胞7天后,Western-blot检测显示AGEs增加RAGE蛋白表达,抑制β-catenin、OSX、RUNX2蛋白表达（P<0.05）。给予RAGE中和抗体阻断RAGE信号通路后减少RAGE表达,增加ALP、Runx2、OSXmRNA表达（P<0.05）。Western-blot结果显示AGEs增加RAGE蛋白表达,抑制β-catenin蛋白表达（P<0.05）。给予Wnt/β-catenin通路促进剂Wnt3a后增加了β-catenin、OSX蛋白表达,抑制了RAGE蛋白表达（P<0.05）。28天茜素红染色比较矿化结节提示AGEs组明显抑制了钙结节的形成,而间断加入Wnt3a后可以部分对抗AGEs的成骨分化抑制作用。结论:Wnt/β–catenin信号通路介导AGEs抑制大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化。抗RAGE中和性抗体阻断AGEs与RAGE的结合后,骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的能力增强。Wnt3a促进Wnt/β–catenin通路作用,部分拮抗AGEs的成骨分化抑制作用。第三部分AGEs对BMSCs增值、成骨分化影响及PTH干预作用目的:在给予AGEs刺激因素的基础上,加入外源性的PTH,检测细胞增殖及分化,观察PTH是否可拮抗AGEs的作用。方法:AGEs作用于BMSCs7天后,采用RT-PCR检测ALP、COL-ⅠmRNA;Western Blot检测β-catenin、OSX、RUNX2、RAGE蛋白;AGEs作用于BMSCs 28天后,茜素红染色和Von Kossa染色检测AGEs对于BMSCs矿化的影响。PTH预处理BMSCs,给予AGEs作为干预因素,RT-PCR法检测ALP、COL-ⅠmRNA,Western Blot技术检测B-cateninm、OSX、RUNX2、RAGE蛋白,第28天茜素红染色,观察矿化结节形成情况。结果:PTH干预后,抑制了AGEs的作用,与AGEs组相比RAGE蛋白表达减少,β-catenin、OSX、RUNX2蛋白表达增高（P<0.05）。10-8mmol/L PTH干预后部分逆转AGEs成骨分化,定量分析茜素红染色钙结节的形成表明在28天AGEs抑制88%细胞矿化（P<0.05）,PTH可以修复23%AGEs对骨髓间充质干细胞的负性作用（P<0.05）。结论:PTH通过Wnt/β–catenin信号通路部分逆转AGEs对BMSCs增殖、成骨分化的负性作用。
杨云飞[5]（2020）在《GYY4137对绝经后骨质疏松症患者BMMSC成骨分化的影响作用》文中指出目的:体外研究外源性硫化氢（GYY4137）对绝经后骨质疏松症患者骨髓间充质干细胞（BMMSC）增殖和成骨分化的生物学影响及探讨其可能机制。方法:取绝经后骨质疏松性骨折行全髋置换治疗的患者20名,术中自股骨近端做骨髓取样用于细胞培养。采用全骨髓贴壁法行原代细胞培养获得h-BMMSC,利用流式细胞技术鉴定。以有限稀释法纯化获得纯度较高的原代h-BMMSC。MTT法检测外源性H2S供体GYY4137对h-BMMSC增殖能力的影响并筛选GYY4137的最佳干预量-效浓度。进一步实验,取培养至第3代的h-BMMSC,将其分为对照组（h-BMMSC）和实验组（GYY4137+h-BMMSC）。将细胞分别培养至1th/7th/14th/21th,使用裂解法收集两组h-BMMSC的RNA,并实施RT-PCR检测,将两组细胞成骨相关性基因的mRNA表达变化进行比较。于培养至第7th/14th/21th时,采用茜素红（ARS）染色方法检测两组细胞中矿化结节的形成状况并进行ARS量化分析。所得数据录入SPSS 25.0软件实施统计学意义上的分析。最后,通过综述探讨H2S促进h-BMMSC增殖和成骨分化的可能信号通路调控机制。结果:流式细胞鉴定显示90%以上的细胞表型呈CD90/73双重阳性、CD34/45阴性。MTT检测结果显示,100μM浓度的GYY4137最能有效刺激h-BMMSC的增殖能力,且刺激时长与细胞增殖成正比。RT-PCR检测结果显示,于第7和14天,实验组成骨性相关基因的表达明显高于对照组（P<0.01）;第21天,两组的成骨性基因表达均下降（实验组下降较为明显,P<0.01）。经茜素红染色后,7、14、21天时镜下观察,实验组与对照组相比矿化结节量明显增多。ARS量化分析结果组间比较(OD值:F7th=6.88,F14th=38.58,F21th=38.56;P<0.05)。文献综述提示,Wnt/β-catenin信号通路可能是GYY4137对h-BMMSC成骨分化的主要调控机制。结论:外源性H2S（GYY4137）可以促进绝经后骨质疏松症患者BMMSC的增殖和成骨分化。此外,这种作用的机制可能是通过调节Wnt/β-catenin信号通路来实现的。
郭雨晴[6]（2020）在《明胶-羟基磷灰石支架材料促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化》文中提出目的探讨共沉淀法合成的明胶-羟基磷灰石支架材料的理化性质及其对大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖分化的影响,并通过动物实验验证该支架材料促进大鼠颅骨缺损的骨修复。方法全骨髓贴壁法分离纯化SD大鼠骨髓间充质干细胞;对第2代细胞表面标记分子进行流式细胞术分析;P2代进行矿化诱导21天,茜素红染色分析细胞的成骨分化潜能;采用不同循环次数的共沉淀法制备复合羟基磷灰石的明胶载体并对材料理化表征进行分析;采用扫描电镜、CCK-8、死活实验观察材料对大鼠骨髓间充质干细胞增殖的影响,碱性磷酸酶定量分析材料对其成骨分化的影响。成年雄性SD大鼠12只,每组4只,随机分成A、B、C三组。所有大鼠均在左右颅骨处去骨,造直径为5mm,深度约为3mm的圆形骨缺损。A组左侧放置r BMSCs-1HA-Gel复合物,右侧为阴性空白对照组;B组组左侧放置r BMSCs-Gel复合物,右侧为阴性空白对照组;C组左侧放置r BMSCs-1HA-Gel复合物,右侧放置r BMSCs-Gel复合物。术后12周行摄CBCT,然后取材,并制作组织学切片进行HE、Masson染色。对两组大鼠颅骨缺损处的骨缺损修复、愈合情况进行评价。上述所得实验数据均用SPSS17.0进行统计学分析,检测数据均以（?）±s表示,多组间差异的比较采用双因素重复测量资料的方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1、全骨髓贴壁法培养出原代细胞。流式细胞术结果显示该细胞高表达干细胞表面标记分子CD29,CD90;低表达血管内皮细胞表面标记分子CD45,CD11b。用成骨诱导液对第2代大鼠骨髓间充质干细胞细胞进行诱导后,茜素红染色后有矿化结节生成,说明其具有向成骨细胞分化的能力。2、根据自然离子不同交替次数,制备出1循环材料、2循环材料、3循环材料和对照组明胶材料,扫描电镜显示复合支架材料表面有颗粒物沉淀;红外光谱显示复合材料中存在较强的化学键合;X射线衍射显示颗粒沉淀为羟基磷灰石。1循环复合材料孔隙率接近人松质骨;体外降解实验显示该材料具有可降解性。与对照组相比较,扫描电镜观察结果显示大鼠骨髓间充质干细胞在1循环材料上黏附和伸展情况最良好;CCK-8实验结果显示1循环材料促进细胞增殖,ALP实验结果显示与1循环材料增强碱性磷酸酶的表达,差异有统计学意义（P<0.05）。3、CBCT及切片染色结果显示,实验组新骨形成速度及骨密度优于对照组,差异有统计学意义（P<0.05）。结论利用共沉淀法合成的1HA-Gel复合支架材料定向诱导后的r BMSCs具有良好的生物相容性,促进r BMSCs成骨分化,并且r BMSCs-1HA-Gel能有效地修复大鼠颅骨缺损,有望成为新型的骨组织工程支架材料。
耿瑶[7]（2020）在《hsa-miRNA-223-3p对人骨髓间充质干细胞成骨分化细胞影响的实验研究》文中提出目的:通过对人骨髓间充质干细胞（Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）的分离、纯化和鉴定,以及诱导BMSCs体外成骨分化,过表达hsa-miR-223-3p,探讨hsa-miR-223-3p对BMSCs成骨分化细胞的调控作用。方法:抽取新鲜人骨髓10 mL,通过肝素（2500 U/mL,0.5 mL）抗凝后注入预置有Percoll密度梯度离心液的试管内,通过Percoll密度梯度离心法来分离纯化单个核细胞。利用10%FBS DMEM完全培养基培养人骨髓间充质干细胞。结合免疫细胞化学检测鉴定贴壁的人骨髓间充质干细胞上相关表面抗原标志物的表达。使用含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的成骨诱导液诱导人BMSCs向成骨细胞分化。分别于细胞诱导培养的第7天、14天、21天,进行培养液ALP水平的检测以及细胞茜素红染色。在诱导成功的成骨细胞中,过表达hsa-miR-223-3p,通过实时荧光定量PCR方法检测Wnt信号通路标志物Wnt5a及其下游信号分子OPG、RUNX2的mRNA水平的变化。在蛋白水平上,通过Western blot方法检测Wnt5a、OPG和RUNX2表达的变化。通过生物信息学软件发现Wnt5a上有hsa-miR-223-3p的结合位点,构建pmirGLO/Wnt5a-3’UTR和pmirGLO/Wnt5a-3’UTR mut质粒,分别与hsa-miR-223-3p mimcs/NC共转染至293T细胞。通过双荧光素酶报告基因实验验证hsa-miR-223-3p与Wnt5a的靶定关系。结果:1.通过Percoll密度梯度离心法分离培养的细胞呈扁平的纺锤形,与成纤维细胞类似;细胞核相对较大,核仁一个或为多个,胞浆丰富。免疫细胞化学检测检测结果显示:CD 34、CD 45呈阴性表达,排除造血组织来源细胞,CD 44呈阳性表达,提示所培养的细胞为人骨髓间充质干细胞,保证了研究对象的准确性。2.随着成骨诱导时间的延长,检测到培养液中ALP的水平逐渐增加,茜素红细胞染色见暗红色或红褐色钙盐结节沉积逐渐增加。说明在体外可以成功诱导BMSCs的成骨分化。3.在BMSCs经体外诱导的成骨细胞中,过表达hsa-miR-223-3p,Wnt5a、OPG、RUNX2的mRNA水平和蛋白水平都是降低的（P<0.05）。4.hsa-miR-223-3p可直接靶定Wnt5a的3’UTR区,降低Wnt5a的荧光素酶的活性。当突变掉hsa-miR-223-3p与Wnt5a结合的种子序列后,这种靶定作用消失。当封闭hsa-miR-223-3p后,野生型Wnt5a的荧光素酶的活性增加,而突变型Wnt5a的荧光素酶的活性不变。结论:通过Percoll密度梯度离心法分离培养的细胞具有人骨髓间充质干细胞的各种特性。在BMSCs成骨细胞分化细胞中,过表达hsa-miR-223-3p可以影响Wnt信号通路标志物Wnt5a及其下游信号分子OPG、RUNX2的表达。hsa-miR-223-3p可直接与Wnt5a结合,Wnt5a作为hsa-miR-223-3p的下游靶基因,受其负向调控。
杨馥如[8]（2019）在《CRISPR系统对脂肪间充质干细胞成骨分化的调控作用研究》文中进行了进一步梳理由于创伤或肿瘤而引起的骨缺损是骨科、整形修复科、口腔颌面外科等科室的常见疾病,其严重影响患者的组织功能和外形。骨水泥或其他人工材料可以促进轻度的骨缺损愈合,而较大的骨缺损则需要血管化的骨移植进行修复。常用的方法有髂骨或腓骨瓣移植,其虽然可以修复大部分的骨缺损,但会导致供区损伤较大。因此,近年来迅速发展的组织工程和再生医学为修复或替换受损组织提供了新的思路,其中种子细胞是研究者的首选材料。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）是干细胞的一种,能分化为间质组织,具有亚全能分化潜能,在特定的体内外环境下,能够诱导分化成为多种组织细胞。间充质干细胞的自我更新的能力,是维持其终生具有分化潜能的基础。其多谱系分化能力,即可以分化为神经、心脏、肝脏、骨、软骨、肌腱、脂肪、上皮等多种细胞,为多种疾病的治疗提供了重要的原材料。以上两个特性使其在再生医学方面成为除诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）和胚胎干细胞（Embryonic stem cells,ESCs）之外备受瞩目的干细胞来源。间充质干细胞可从成体各组织中获得,包括脂肪、骨髓、骨膜、松骨质、脐带及牙髓中,因易于分离、培养、扩增和纯化,且多次传代后仍具有干细胞特性,不存在免疫排斥的特性,被广泛应用于再生医学领域和自身免疫性疾病的治疗。此外,间充质干细胞因无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等优势,成为最具临床应用前景的多能干细胞。间充质干细胞按来源可分为:骨髓间充质干细胞,脂肪间充质干细胞（adipose-derived stem cells,ASCs）,胎盘间充质干细胞,脐带间充质干细胞等,相较于其他间充质干细胞,由于脂肪干细胞具有成来源充足、获取方便、创伤小及产量高、瘤危险性低、遗传稳定性、免疫原性低,可分泌各种细胞因子,促进血管形成,并能招募其他细胞参与重建,等优点被作为重要的种子细胞,因此本实验选取其作为研究材料。间充质干细胞的三系分化能力（成脂分化能力、成骨分化能力和成软骨分化能力）是决定间充质干细胞多能性的主要指标,等其中成骨分化能力在临床上被广泛应用于骨损伤的修复研究。之前,间充质干细胞的骨损伤修复大都是基于未分化的间充质干细胞的相关特性,之后,随着研究的深入,越来越多的报道显示分化后的间充质干细胞的组织替代和修复作用更强的特异性。因此借助特定的方法获得分化后的间充质干细胞在临床应用上具有深远的意义。目前,体外诱导干细胞定向分化,有多种方法,包括化合物法、转录因子诱导法以及小分子诱导法等。虽然这些方法可以有效的诱导间充质干细胞的分化,但其特异性有待提高。所以,快速精准地控制间充质干细胞的诱导分化对间充质干细胞的临床研究具有重要的意义。CRISPR-Cas9（Clusterregularlyinterspaced short palindromic repeats-associated protein 9,CRISPR-Cas9）基因编辑技术,是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术,以其基因编辑的便利性、精准性和临床应用的可操作性已被广泛应用。有研究表明,失活的Cas9（deadCas9,dCas9）蛋白能够快速特异地操纵目的基因。与普通的外源性过表达相比,CRISPR-Cas9系统能够同时内源性的调控多个基因的特异性表达,从而对细胞的命运进行精准调控。间充质干细胞的成骨诱导分化和成脂诱导分化受到多种细胞因子和激素的调控,表现为一种相互关联和制约的平衡关系,涉及到的信号通路复杂,有研究表明:骨质疏松症就是因为成骨分化和成脂分化出现失衡,并以牺牲成骨细胞数量为代价的方式产生多的脂肪细胞。因此对其关系的研究将为间充质干细胞的临床治疗骨质疏松疾病提供一定的理论依据。本研究共分为三部分:第一部分脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定本章节通过运用酶解法和优化的组织贴壁法分离小鼠脂肪间充质干细胞,通过观察细胞形态学,检测体外增殖能力、流式表面标志物、成克隆能力（CFU）、以及成骨、成软骨和成脂诱导分化能力等,结果表明所获得的细胞具有很强的体外增殖能力,且经过长期传代后增殖能力无明显改变;流式表面标志物CD44和CD90表达阳性;对诱导分化后的成骨细胞、软骨样细胞和脂肪细胞等染色表明所分离到的细胞具有多向分化潜能,进一步证实所分离的细胞为脂肪间充质干细胞。从而建立了一套稳定的体外分离、培养、鉴定及诱导分化体系。第二部分CRISPR系统介导脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化本章节通过利用CRISPR系统对脂肪间充质干细胞中的两个成骨前体基因Runx2和Osterix进行内源性的瞬时过表达,观察其对MSCs成骨诱导分化能力的影响。RT-qPCR结果显示,内源性的过表达两个成骨前体基因可以迅速使得MSCs朝着成骨方向诱导分化;茜素红染色结果显示,内源性的瞬时过表达两个成骨前体基因显着提高了成骨的诱导分化效率。此外,对成骨分化过程中的OPN、OCN及Coll-I等基因进行检测,结果显示,内源性过表达Runx2和Osterix后,以上基因表达水平迅速上调,继而加速进入成骨分化阶段。这种利用基因工程手段快速改变MSCs命运的方法为临床应用奠定了坚实的基础,同时为MSCs的成骨诱导分化的特异性指明了方向。第三部分CRISPR系统促进间充质干细胞成骨分化与抑制成脂分化的研究本章节通过利用CRISPR系统内源性的过表达成骨前体基因Runx2和Osterix,观察脂肪间充质干细胞的命运状态,着重分析CRISPR系统对ASCs成骨分化特异性的调控和在成骨分化过程中对成脂分化的影响,实验结果表明:成骨前体基因Runx2和Osterix表达水平上调,PPARγ、LPL等成脂相关基因表达水平下调。这一结果进一步证实了CRISPR系统内源性的过表达成骨前体基因Runx2和Osterix能够促进脂肪间充质干细胞的成骨分化,同时抑制其成脂分化,对成骨诱导分化和成脂诱导分化具有特异性作用,为探索间充质干细胞的成骨分化与成脂分化之间的复杂关系奠定理论基础,为间充质干细胞在骨性疾病的临床治疗方面提供思路。综上,本论文初步建立了一套稳定脂肪间充质干细胞的体外分离、培养及鉴定体系;利用CRISPR系统对分离的脂肪干细胞中的Runx2和Osterix两个成骨相关的前体基因进行内源性过表达,可加速其脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化,抑制成脂诱导分化,阐明了成骨和成脂诱导分化的相互联系,为MSCs的成骨诱导分化的特异性指明了方向,为后期临床应用研究奠定了一定的基础。
杨清毅[9]（2019）在《基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨骨碎补治疗激素性股骨头坏死实验研究》文中进行了进一步梳理目的:基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨激素性股骨头坏死可能的发病机制及骨碎补对骨髓间充质干细胞增殖和成骨-成脂分化的影响,为临床治疗提供理论依据。方法:第一部分临床实验研究实验一:2015年5月至2016年4月从我院11例激素性股骨头坏死行人工关节置换术（实验组）和7例股骨颈骨折、股骨粗隆间骨折行人工关节置换或髓内固定术（对照组）患者术中从股骨近端抽取骨髓。实验经医院伦理委员会通过,术前每位患者均签署知情同意书。全骨髓培养法分离、培养、纯化骨髓间充质干细胞,P3代用于实验研究。采用流式细胞仪进行表面抗原鉴定,CCK-8法、细胞周期检测两组细胞增殖情况,油红O染色鉴定其成脂能力,茜素红染色鉴定其成骨能力,RT-PCR和Western-blot检测各组骨髓间充质干细胞中Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子β-Catenin、Cyclin D1、Runx2、PPAR-γ的m RNA和蛋白表达差异,基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨激素性股骨头坏死可能发病机制。实验二:不同浓度梯度的骨碎补总黄酮干预P3代激素性股骨头坏死患者的骨髓间充质干细胞,分为0g/L骨碎补总黄酮组、10-1g/L骨碎补总黄酮组、10-2g/L骨碎补总黄酮组、10-3g/L骨碎补总黄酮组、10-4g/L骨碎补总黄酮组、10-5g/L骨碎补总黄酮组、10-6g/L骨碎补总黄酮组、10-7g/L骨碎补总黄酮组,干预7天,检测各组细胞增殖率,得到最佳干预浓度用于下序实验研究。再分别用最佳干预浓度骨碎补总黄酮及经典成骨诱导剂干预P3代激素性股骨头坏死患者的骨髓间充质干细胞,分为对照组、骨碎补总黄酮治疗组、经典成骨诱导剂组,干预21天后,检测各组ALP活性,茜素红染色及定量检定各组成骨能力,RT-PCR和Western-blot检测各组骨髓间充质干细胞中Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子Wnt10b、LRP5、β-Catenin、Cyclin D1、Runx2、Osterix的m RNA和蛋白表达差异,基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨骨碎补对激素性股骨头坏死患者BMSCs增殖和成骨-成脂分化的影响。第二部分动物实验研究随机将160只雄性SD大鼠分为对照组、模型组和治疗I、II、III组,每组各32只。给予模型组地塞米松磷酸钠（30mg/Kg,T.w.）臀肌注射。治疗I、II、III组在模型组基础上同时给于骨碎补水煎剂正常浓度、浓缩5倍、浓缩10倍灌胃治疗,对照组采用生理盐水干预。12周后给予所有大鼠处死获取标本--股骨头组织和骨髓间充质干细胞用于检测。通过HE染色观察及Image J软件检测各组股骨头骨小梁面积、脂肪空泡面积及软骨厚度;通过股骨头轴向压力测试测定各组股骨头力学改变;通过全骨髓培养法体外分离、培养以上五组骨髓间充质干细胞,传代纯化,P3代用于实验研究。通过CCK-8、成骨-成脂定向诱导后I型胶原SP染色、茜素红染色、油红O染色及定量、ALP定量检测五组大鼠P3代骨髓间充质干细胞增殖功能变化和成骨-成脂分化情况,并通过RT-PCR、Western Blot检测Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子Wnt10b、β-Catenin、Cyclin D1、Runx2、Osterix、PPAR-γ的m RNA和蛋白表达水平,进一步探讨基于Wnt/β-Catenin信号通路的激素性股骨头坏死可能的发病机制及骨碎补对BMSCs增殖和成骨-成脂分化的影响。结果:第一部分临床实验结果实验一结果:1.两组hBMSCs细胞表面抗原检测结果:实验组各表面抗原（CD29、CD44、CD45、CD54、CD90）较对照组有显着性差异（P<0.05）。2.两组hBMSCs细胞增殖、细胞周期检测结果:实验组较对照组增殖能力明显下调（P<0.05）。3.两组hBMSCs细胞成骨-成脂定向诱导及定量检测结果:实验组较对照组成骨分化能力明显减弱,成脂分化能力增强,定量检测差异有统计学意义（P<0.05）。4.RT-PCR结果:实验组相较对照组Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及促进增殖、成骨分化因子Wnt10、LRP5、β-Catenin、Cyclin D1、Runx2 m RNA的表达明显下调,成脂分化因子PPAR-γm RNA的表达明显上调,差异有统计学意义（P<0.05）,Osterix m RNA的表达差异无统计学意义（P>0.05）。5.Western Blot结果:实验组相较对照组Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及促进增殖、成骨分化因子Wnt10、β-Catenin、Cyclin D1、Runx2蛋白的表达显着下调,成脂分化因子PPAR-γ显着上调,差异有统计学意义（P<0.05）。实验二结果:1.不同浓度骨碎补总黄酮干预激素性股骨头坏死患者hBMSCs 7天细胞增殖结果显示10-5g/L骨碎补总黄酮组细胞增殖率最高,与其他各组均有显着性差异（P<0.05）,为最佳干预浓度。2.ALP检测结果:较对照组,骨碎补总黄酮组(10-5g/L)和经典成骨诱导剂组干预1周、2周ALP活性明显增高（P<0.05）;经典成骨诱导剂组ALP活性较骨碎补总黄酮组高,但两者无显着性差异（P>0.05）。3.三组SONFH患者hBMSCs干预3周茜素红染色及定量检测结果:对照组钙结节染色结果呈阴性,相较对照组,骨碎补总黄酮组和经典成骨诱导剂组茜素红染色可见大量阳性钙结节,定量检测有显着性差异（P<0.05）;经典成骨诱导剂组和骨碎补总黄酮组钙结节定量检测有显着性差异（P<0.05）。4.三组SONFH患者hBMSCs各基因m RNA相对表达量RT-PCR检测结果:相较对照组,骨碎补总黄酮治疗组和成骨诱导剂组hBMSCs Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及促进增殖、成骨分化因子Wnt10、LRP5、β-Catenin、Cyclin D1、Runx2、Osterix m RNA的表达有显着性差异（P<0.05）。骨碎补总黄酮组和成骨诱导剂组两者之间Wnt10、β-Catenin、Runx2、Osterix m RNA的表达有显着性差异（P<0.05）;LRP5、Cyclin D1m RNA的表达无显着性差异（P>0.05）。5.三组SONFH患者hBMSCs各蛋白相对表达量WB结果:相较对照组,骨碎补总黄酮治疗组和成骨诱导剂组hBMSCs Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及促进增殖、成骨分化因子β-Catenin、Cyclin D1、Runx2、Osterix蛋白表达有显着性差异（P<0.05）。骨碎补总黄酮组和成骨诱导剂组两组之间β-Catenin、Cyclin D1、Runx2、Osterix蛋白表达也有显着性差异（P<0.05）。第二部分动物实验研究结果1.五组SD大鼠股骨头组织HE染色结果:与对照组相比,模型组骨小梁面积、最大软骨厚度明显减小,脂肪空泡面积明显增大,差异均有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比,治疗I、II、III组骨小梁面积和最大软骨厚度明显增大、脂肪空泡面积明显减少,差异均有统计学意义,尤其是治疗II组效果最佳（P<0.05）。2.五组SD大鼠股骨头生物力学测试结果:相较对照组股骨头,模型组和治疗I、II、III组股骨头软骨下骨最大轴向载荷、应力强度及轴向刚度明显变弱,股骨头软骨下骨的最大位移明显增加,有显着性差异（P<0.05）;相较模型组,治疗I、II、III组股骨头软骨下骨最大轴向载荷、应力强度及轴向刚度明显变强,股骨头软骨下骨的最大位移明显减小,有显着性差异（P<0.05）,尤其以治疗II、III组效果明显,二者之间无显着性差异。3.五组SD大鼠r BMSCs增殖结果:五组SD大鼠r BMSCs增殖曲线均呈现“S”型。相较对照组,模型组细胞增殖曲线下调最明显,有显着性差异（P<0.05）;相较于模型组,治疗I、II、III组细胞增殖曲线均上调,差异有统计学意义（P<0.05）,尤其以治疗II、III组上调明显。4.五组SD大鼠r BMSCs成骨功能检测结果:I型胶原SP染色、茜素红染色及定量、ALP活性检测结果显示相较对照组,模型组各指标明显降低;相较于模型组,治疗I、II、III组各指标明显增高,定量检测分析差异有统计学意义（P<0.05）,尤其以治疗II、III组效果明显,但二者之间差异无统计学意义（P>0.05）。RT-PCR和Western Blot结果显示相较对照组,模型组Wnt/β-Catenin信号通路主要因子及促进成骨分化因子Wnt10、β-Catenin、Runx2、Osterix m RNA及蛋白表达均有明显下调,差异有统计学意义（P<0.05）;相较模型组,治疗I、II、III组各因子m RNA及蛋白表达均有明显上调,差异有统计学意义（P<0.05）,尤以治疗II、III组效果明显。5.五组SD大鼠r BMSCs成脂功能检测结果:相较对照组,模型组油红O染色明显增强;相较于模型组,治疗I、II、III组明显减弱,定量检测分析差异有统计学意义（P<0.05）,尤其以治疗II、III组效果明显,但二者之间差异无统计学意义（P>0.05）。RT-PCR和Western blot结果显示相较对照组,模型组Wnt/β-Catenin信号通路主要因子Wnt10、β-Catenin m RNA及蛋白表达均有明显下调,PPAR-γm RNA及蛋白表达明显上调,差异有统计学意义（P<0.05）;相较模型组,治疗I、II、III组Wnt10、β-Catenin m RNA及蛋白表达均有明显上调,PPAR-γm RNA及蛋白表达明显下调,差异有统计学意义（P<0.05）,尤以治疗II、III组效果明显。结论:1.激素性股骨头坏死BMSCs增殖、成骨分化功能明显降低,成脂分化功能增强,符合“髓枯骨痿”中医理论,其机制可能与Wnt/β-Catenin信号通路抑制,Wnt10、LRP5、β-Catenin、Cyclin D1、Runx2下调,PPAR-γ上调有关。2.骨碎补可以通过促进激素性股骨头坏死BMSCs增殖、成骨分化功能,减弱成脂分化功能而发挥治疗作用,符合“肾主骨生髓,补肾壮骨”中医理论,其机制也可能与激活Wnt/β-Catenin信号通路,上调促增殖及成骨分化因子（Wnt10、β-Catenin、Cyclin D1、Runx2、Osterix）、抑制成脂分化因子（PPAR-γ）表达有关。
刘金豹[10]（2018）在《基于Wnt/β-Catenin信号通路的补肾活血胶囊治疗激素性股骨头坏死临床与实验研究》文中认为目的:1.通过临床疗效评价方法和影像学评价方法,观察补肾活血胶囊治疗激素性股骨头坏死的临床疗效。2.通过补肾活血胶囊对SD大鼠激素性股骨头坏死组织和体内外骨髓间充质干细胞的干预,以及检测Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子（Wnts、β-Catenin）及其下游促增殖（CyclinD1）、成骨-成脂分化（Runx2、Osterix、PPARγ）、血管内皮生长因子（VEGF）等特异性转录因子的基因和蛋白表达情况,探讨补肾活血胶囊基于Wnt/β-Catenin信号通路促进激素性股骨头坏死骨修复机制。方法:1.临床研究:2015年9月至2016年10月在山东中医药大学附属医院骨科门诊就诊的ARCO分期I、II期激素性股骨头坏死患者80例,随机分为对照组和治疗组,每组40例。对照组给与仙灵骨葆治疗,治疗组给与补肾活血胶囊治疗,分别于治疗前及治疗后3个月、6个月、9个月和12个月采用临床评价方法（Harris量表、WOMAC量表）和影像学评价方法（股骨头坏死面积评价、股骨头塌陷评价法）及肝肾功能检测评估补肾活血胶囊治疗早期激素性股骨头坏死的临床疗效及药物安全性。2.动物实验研究:1)在体实验:120只SD大鼠,随机分为对照组、模型组和治疗组,每组各40只。模型组给予地塞米松磷酸钠臀肌注射。治疗组同时给于补肾活血汤灌胃干预,其它两组采用生理盐水干预。6周后各组随机取5只大鼠股骨头用于HE染色动态观察各组股骨头变化及造模情况。12周后给予所有大鼠处死获取标本（血液、股骨头组织、骨髓间充质干细胞）用于检测。通过血生化检测（TC、TG、Ca、ALP）及HE染色观察各组股骨头坏死及修复情况;通过RT-PCR和Western Blot检测股骨头组织上述相同时间点Wnt/β-Catenin信号通路主要因子及其下游成骨-成脂、成血管分化等特异性转录因子（Wnt10b、β-Catenin、Runx2、Osterix、PPAR-γ、VEGF）基因和蛋白表达水平;通过CCK-8、茜素红染色、油红O染色、ALP定量检测三组大鼠P3代骨髓间充质干细胞增殖功能变化和经典成骨、成脂诱导剂诱导后rBMSCs成骨-成脂分化功能变化情况,并通过RT-PCR、Western Blot检测Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及其下游促增殖、成骨-成脂分化特异性转录因子（Wnt3a、β-Catenin、CyclinD1、Runx2、Osterix、PPAR-γ）蛋白和基因表达水平,从组织、细胞、蛋白、核酸层面揭示和探讨补肾活血胶囊基于Wnt/β-Catenin信号通路促进激素性股骨头坏死骨修复机制。2)离体实验:采用体外分离、培养、纯化、鉴定SD大鼠BMSCs,P3代用于实验,给予10-6mol/L地塞米松磷酸钠及不同梯度浓度的补肾活血汤含药血清干预分为对照组、低浓度含药血清组、中浓度含药血清组、高浓度含药血清组、激素组、低浓度含药血清+激素组、中浓度含药血清+激素组、高浓度含药血清+激素组八组,通过CCK-8、茜素红染色、ALP定量检测、RT-PCR、Western Blot等方法检测rBMSCs增殖、成骨分化情况及Wnt/β-Catenin信号通路核心蛋白、成骨-成脂分化特异性转录因子（β-Catenin、Runx2、PPAR-γ）基因和蛋白表达水平,进一步揭示和探讨补肾活血胶囊基于Wnt/β-Catenin信号通路对体外大剂量激素干预的rBMSCs成骨-成脂分化功能影响。结果:1.临床实验结果:Harris量表、WOMAC量表评分结果显示两组患者在治疗前差异无统计学意义（P>0.05）。两组患者治疗后组间比较:治疗后3个月差异无统计学意义（P>0.05）;随后6个月、9个月及12个月差异有统计学意义（P<0.05）;组内比较:对照组、治疗组患者治疗后3个月、6个月、9个月、12个月较治疗前比较结果差异均有统计学意义（P<0.05）。两组患者在治疗前MRI计算坏死面积结果差异无统计学意义（P>0.05）。两组患者在治疗后3个月、6个月、9个月、12个月组间及组内比较MRI计算坏死面积结果差异无统计学意义（P>0.05）。股骨头塌陷评价法结果显示至实验结束治疗组21髋出现股骨头塌陷;对照组31髋出现股骨头塌陷,结果差异有统计学意义（P<0.05）。股骨头塌陷曲线结果显示,治疗组的股骨头中位塌陷时间为9个月大于对照组6个月,Log-rank检验P<0.05,有统计学意义。肝功能、肾功能检测无明显损害。2.动物实验结果:1)在体实验结果:（1）血生化指标检测结果模型组与对照组相比,血TC、TG上调明显,血Ca、ALP下调明显,有统计学意义（P<0.05）;治疗组与模型组相比,血TC、TG下调明显,血Ca、ALP上调明显,有统计学意义（P<0.05）。（2）股骨头组织检测结果HE染色结果:模型组与对照组相比,骨小梁面积减少、脂肪空泡面积和空骨陷窝率增加,差异均有统计学意义（P<0.05）;治疗组与模型组相比,骨小梁面积增加,脂肪空泡面积和空骨陷窝率降低,差异均有有统计学意义（P<0.05）。RT-PCR和Western Blot结果:模型组与对照组相比,Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及下游成骨、成血管特异性转录因子（Wnt10b、β-Catenin、Runx2、Osterix、VEGF）的基因和蛋白表达下调（P<0.05）;成脂特异性转录因子（PPAR-γ）的基因和蛋白表达上调（P<0.05）。治疗组与模型组相比,Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及下游成骨、成血管特异性转录因子（Wnt10b、β-Catenin、Runx2、Osterix、VEGF）的基因和蛋白表达上调（P<0.05）;成脂特异性转录因子（PPAR-γ）的基因和蛋白表达下调（P<0.05）。（3）三组大鼠BMSCs功能检测结果体外培养表面抗原鉴定结果:三组大鼠P3代rBMSCs表面抗原FITC单染结果表明,模型组各表面抗原（CD45、CD73、CD90、CD105）较对照组差异有统计学意义（P<0.05）;治疗组各表面抗原较模型组差异有统计学意义（P<0.05）。增殖情况检测结果:模型组与对照组相比,CCK-8检测细胞数量增殖结果及RT-PCR、Western Blot检测Wnt/β-Catenin信号通路主要相关蛋白及下游细胞周期蛋白（Wnt3a、β-Catenin、CyclinD1）基因和蛋白表达下调,差异有统计学意义（P<0.05）;治疗组与模型组相比,CCK-8检测细胞数量增殖结果及RT-PCR、Western Blot检测Wnt/β-Catenin信号通路主要相关蛋白及下游细胞周期蛋白（Wnt3a、β-Catenin、CyclinD1）基因和蛋白表达上调,差异有统计学意义（P<0.05）。三组rBMSCs体外成骨-成脂诱导后检测结果:模型组与对照组相比,茜素红染色及定量、ALP定量检测结果及RT-PCR、Western Blot检测Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及下游成骨特异性转录因子（Wnt10、β-Catenin、Runx2、Osterix、）基因和蛋白表达下调;油红O染色及定量、RT-PCR及Western Blot检测Wnt/β-Catenin信号通路下游成脂特异性转录因子（PPAR-γ）基因和蛋白表达上调,差异有统计学意义（P<0.05）。治疗组与模型组相比,茜素红染色及定量、ALP定量检测结果及RT-PCR、Western Blot检测Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子及下游成骨特异性转录因子（Wnt10、β-Catenin、Runx2、Osterix、）基因和蛋白表达上调;油红O染色及定量、RT-PCR及Western Blot检测Wnt/β-Catenin信号通路下游成脂特异性转录因子（PPAR-γ）基因和蛋白表达下调,差异有统计学意义（P<0.05）。2)离体实验结果:（1）CCK-8测增殖率结果:八组细胞增殖曲线除激素组外,其余七组细胞生长曲线呈“S”型。不同浓度的补肾活血方含药血清处理的rBMSCs增殖能力均强于对照组,不同浓度的补肾活血方含药血清和10-6mmol/L地塞米松磷酸钠干预的rBMSCs增殖能力均强于激素组（P<0.05）,并随浓度梯度的增高而增强。（2）茜素红染色及定量、ALP定量检测结果:不同浓度的补肾活血方含药血清处理的rBMSCs茜素红染色及定量、ALP定量检测结果均高于对照组,不同浓度的补肾活血方含药血清和10-6mmol/L地塞米松磷酸钠干预的rBMSCs茜素红染色及定量、ALP定量检测结果均高于激素组（P<0.05）,并随浓度梯度的增高而增高。（3）RT-PCR及Western Blot结果:不同浓度的补肾活血方含药血清处理的rBMSCs经RT-PCR、Western Blot检测Wnt/β-Catenin信号通路核心蛋白及下游成骨分化特异性转录因子（β-Catenin、Runx2）基因和蛋白表达均高于对照组,成脂分化特异性转录因子（PPAR-γ）基因和蛋白表达均低于对照组;不同浓度的补肾活血方含药血清和10-6mmol/L地塞米松磷酸钠干预的rBMSCs经RT-PCR、Western Blot检测Wnt/β-Catenin信号通路核心蛋白及下游成骨分化特异性转录因子（β-Catenin、Runx2）基因和蛋白表达均高于激素组,成脂分化特异性转录因子（PPAR-γ）基因和蛋白表达均低于激素组。差异均有统计学意义（P<0.05）,并随浓度梯度的递变而递变。结论:1.临床研究结果表明,补肾活血胶囊对激素性股骨头坏死疗效显着,可以明显改善SONFH患者临床症状并延缓股骨头坏死塌陷时间,并无明显肝肾功能损害。2.动物实验血生化及HE染色结果表明补肾活血胶囊能够促进SD大鼠激素性股骨头坏死骨组织修复。3.补肾活血胶囊促进SD大鼠激素性股骨头坏死组织骨修复机制可能与调控体内Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子（Wnt10b、β-Catenin）及下游成骨-成脂分化相关特异性转录因子和血管内皮生长因子（Runx2、Osterix、PPAR-γ、VEGF）的基因和蛋白表达有关。4.补肾活血胶囊促进体内外大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化,抑制成脂分化机制也可能与调控Wnt/β-Catenin信号通路主要相关因子（Wnts、β-Catenin）及下游成骨-成脂分化相关特异性转录因子和细胞周期蛋白D1（Runx2、Osterix、PPAR-γ、CyclinD1）的基因和蛋白表达有关。
二、人骨髓间充质干细胞的分离培养及向成骨细胞定向分化的实验研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、人骨髓间充质干细胞的分离培养及向成骨细胞定向分化的实验研究（论文提纲范文）
（1）gga-let-7a-5p通过靶向GDF6调节鸡骨髓间充质干细胞多向分化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词中英文全称 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 骨髓间充质干细胞 |
| 1.2 影响骨髓间充质干细胞分化的因素 |
| 1.2.1 细胞因子对BMSC的影响 |
| 1.2.2 其他诱导培养基添加物对BMSC的影响 |
| 1.2.3 骨髓间充质干细胞向不同系谱细胞分化的调节机制 |
| 1.3 骨髓间充质干细胞的特性及应用 |
| 1.4 miRNA的相关研究 |
| 1.4.1 miRNA概述 |
| 1.4.2 miRNA生物发生途径 |
| 1.4.3 miRNA作用机理 |
| 1.4.4 miRNA靶基因预测 |
| 1.4.5 miRNA与干细胞 |
| 1.4.6 miRNA对干细胞分化的调控 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第2章 鸡BMSC分离培养及其多能性鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 实验仪器 |
| 2.2.4 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1BMSCs的分离与培养 |
| 2.3.2 向成骨细胞分化及其标志基因检测 |
| 2.3.3 向脂肪细胞分化及其标志基因检测 |
| 2.3.4 向肌肉细胞分化及其标志基因检测 |
| 2.3.5 向神经细胞分化及其标志基因检测 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 BMSC分离与培养 |
| 2.4.2 向成骨细胞分化及其标志物检测 |
| 2.4.3 向脂肪细胞分化及其标志物检测 |
| 2.4.4 向肌肉细胞分化及其标志物检测 |
| 2.4.5 向神经细胞分化及其标志物检测 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 gga-let-7a-5p对BMSC多向分化能力的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 主要试剂配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 BMSCs不同系谱分化时gga-let-7a-5p表达量的变化 |
| 3.3.2 gga-let-7a-5p过表达或抑制后在BMSCs中gga-let-7a-5p的表达量的检测 |
| 3.3.3 gga-let-7a-5p靶基因GDF6预测及验证 |
| 3.3.4 gga-let-7a-5p对BMSCs增殖能力的影响 |
| 3.3.5 gga-let-7a-5p对BMSCs定向分化能力的影响 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 BMSCs不同系谱分化时gga-let-7a-5p表达量变化情况 |
| 3.4.2 gga-let-7a-5p过表达或抑制处理后在BMSC中gga-let-7a-5p的表达量 |
| 3.4.3 gga-let-7a-5p靶基因验证与选择 |
| 3.4.4 gga-let-7a-5p对BMSCs增殖能力的影响 |
| 3.4.5 gga-let-7a-5p对BMSCs成骨分化的影响 |
| 3.4.6 gga-let-7a-5p对BMSCs脂肪分化的影响 |
| 3.4.7 gga-let-7a-5p对BMSCs肌肉分化的影响 |
| 3.4.8 gga-let-7a-5p对BMSCs神经分化的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 GDF6对BMSCs多向分化能力的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 主要试剂配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 获取GDF6过表达质粒 |
| 4.3.2 GDF6对BMSCs定向分化的影响 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 GDF6对BMSCs向成骨细胞分化的影响 |
| 4.4.2 GDF6对BMSCs向脂肪细胞分化的影响 |
| 4.4.3 GDF6对BMSCs向肌肉细胞分化的影响 |
| 4.4.4 GDF6对BMSCs向神经细胞分化的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 全文结论 |
| 5.2 本论文的主要创新点 |
| 5.3 本论文存在的不足 |
| 5.4 展望 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）新型镁合金对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词量表 |
| 前言 |
| 第一部分 SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 SD大鼠BMSCs形态学观察 |
| 2.2 SD大鼠BMSCs贴壁率 |
| 2.3 SD大鼠BMSCs不同代生长曲线 |
| 2.4 SD大鼠BMSCs表面标志物的鉴定结果 |
| 2.5 SD大鼠BMSCs多向分化能力的鉴定结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 新型镁合金对骨髓间充质干细胞功能影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 SD大鼠BMSCs细胞黏附 |
| 2.2 SD大鼠BMSCs细胞增殖 |
| 2.3 SD大鼠BMSCs细胞毒性 |
| 2.4 SD大鼠BMSCs细胞凋亡 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 新型镁合金对骨髓间充质干细胞成骨分化作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 矿化结节检测 |
| 2.2 碱性磷酸酶活性测定 |
| 2.3 成骨相关基因表达 |
| 2.4 成骨相关蛋白表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 骨髓间充质干细胞成骨分化的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）SEMA3B调控miR-214信号通路对老年性骨质疏松患者BMMSC成骨分化的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第1章 前言 |
| 第2章 人骨髓间充质干细胞的分离、培养及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要实验试剂 |
| 2.2.2 主要仪器与耗材 |
| 2.3 骨髓标本采集和分组 |
| 2.4 BMMSC 分离、培养、和鉴定过程 |
| 2.4.1 BMMSC体外原代、传代培养 |
| 2.4.2 BMMSC表面抗原鉴定 |
| 2.4.3 检测BMMSC成骨分化能力 |
| 2.5 统计学分析 |
| 2.6 实验结果 |
| 2.6.1 BMMSC分离、培养及纯化结果 |
| 2.6.2 BMMSC表面抗原鉴定结果 |
| 2.6.3 内源性碱性磷酸酶在BMMSC的活性测定结果 |
| 2.6.4 茜素红染色结果 |
| 2.7 讨论 |
| 2.8 小结 |
| 第3章 SEMA3B、miR-214 在骨髓间充质干细胞成骨分化中的相互作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验器材 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 SEMA3B、miR-214 在老年骨质疏松和非骨质疏松组中的差异表达 |
| 3.3.2 Real-time PCR检测SEMA3B、miR-214在BMMSC的表达 |
| 3.3.3 SEMA3B与 miR-214 之间的潜在靶点和相互作用 |
| 3.3.3.1 荧光素酶报告基因检测 |
| 3.3.3.2 AGO2-RIP试验 |
| 3.3.4 SEMA3B慢病毒感染BMMSC |
| 3.3.5 miR-214 质粒转染BMMSC |
| 3.4 统计学分析 |
| 3.5 实验结果 |
| 3.5.1 SEMA3B和 miR-214 在老年骨质疏松和非骨质疏松组中的差异表达 |
| 3.5.2 PCR检测SEMA3B、miR-214 及成骨相关基因表达 |
| 3.5.3 验证SEMA3B、miR-214 的潜在靶点和作用关系 |
| 3.5.4 慢病毒转染后SEMA3B、miR-214、成骨相关基因及其能力的检测 |
| 3.5.5 质粒转染后成骨相关基因及其能力检测 |
| 3.6 讨论 |
| 3.7 小结 |
| 第4章 lncRNA-SEMA3B/miR-214/Osterix信号轴在调控老年骨质疏松患者BMMSC成骨分化过程中的分子研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Osterix在老年骨质疏松和非骨质疏松组中的差异表达 |
| 4.3.2 生物信息学预测miR-214 的靶基因 |
| 4.3.3 荧光素酶报告基因检测 |
| 4.3.4 Osterix在体外诱导成骨分化过程中的表达 |
| 4.3.5 质粒转染后检测Osterix的表达水平 |
| 4.4 统计学分析 |
| 4.5 实验结果 |
| 4.5.1 Osterix在老年骨质疏松和非骨质疏松组中的差异表达 |
| 4.5.2 生物信息学及荧光素酶报告基因探究miR-214 的靶基因 |
| 4.5.3 Osterix在成骨分化过程中表达水平 |
| 4.5.4 质粒转染后检测Osterix的表达水平 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文和科研成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附录 |
（4）AGEs通过Wnt/β-catenin通路抑制BMSCs成骨分化及PTH的干预作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 第一部分 大鼠BMSCs的分离、培养与鉴定 |
| 前言 |
| 1 对象与方法 |
| 1.1 标本来源 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 观测 BMSCs 的形态学 |
| 2.2 BMSCs的细胞生长曲线 |
| 2.3 BMSCs表面标记物的表达 |
| 2.4 BMSCs 成骨诱导分化鉴定 |
| 2.5 成脂诱导分化鉴定 BMSCs |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 Wnt/β–catenin信号通路介导AGEs抑制BMSCs成骨分化 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要仪器和试剂 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 AGEs对 BMSCs增殖的影响 |
| 2.2 AGEs对 BMSCs成骨分化过程中矿化(钙结节的形成)的影响 |
| 2.3 AGEs对 Col-ⅠmRNA、LRP5 mRNA表达的影响 |
| 2.4 AGEs对大鼠骨髓间充质干细胞B-cateninm、OSX、RUNX2、RAGE蛋白表达影响 |
| 2.5 促进B-cateninm信号通路观察AGEs对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化及矿化的影响 |
| 2.6 抑制RAGE表达后AGEs对大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 AGEs对 BMSCs增殖、成骨分化影响及PTH的干预作用 |
| 前言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 主要仪器和试剂 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同实验组对细胞ALP、COL-1mRNA表达水平影响 |
| 2.2 Western-blot检测B-cateninm、OSX、RUNX2、RAGE的表达量 |
| 2.3 茜素红染色,观察PTH预处理后AGEs对 MSCs成骨分化过程中矿化的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 1.AGEs |
| 1.1 AGEs的来源 |
| 1.2 AGE的受体 |
| 2.RAGE |
| 3.AGE和 RAGE不利的影响: |
| 3.1 非受体介导途径 |
| 3.2 受体介导的机制 |
| 4.AGEs 与骨质疏松症的关系 |
| 4.1 AGEs介导骨胶原蛋白交联 |
| 4.2 AGEs与成骨细胞 |
| 4.3 AGEs与破骨细胞 |
| 4.4 AGEs与骨髓间充质干细胞 |
| 5.RAGE异变体的产生 |
| 6.预防 AGE-RAGE 的相互作用 |
| 7.预防AGE对骨的不利影响 |
| 8.小结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）GYY4137对绝经后骨质疏松症患者BMMSC成骨分化的影响作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 人骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 一般资料 |
| 2.2.1 主要材料 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 标本采集及实验分组 |
| 2.4 h-BMMSC分离、培养、纯化及鉴定过程 |
| 2.4.1 h-BMMSC原代体外培养 |
| 2.4.2 h-BMMSC鉴定 |
| 2.5 实验结果 |
| 2.5.1 h-BMMSC分离、培养及纯化结果 |
| 2.5.2 h-BMMSC鉴定结果 |
| 第3章 外源性硫化氢对人骨髓间充质干细胞增殖能力影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 主要材料 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 第4章 外源性硫化氢对人骨髓间充质干细胞成骨分化能力影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 外源性H_2S对 h-BMMSC成骨分化的影响 |
| 4.3 外源性H_2S对 h-BMMSC成骨分化形成矿化结节量的影响 |
| 4.4 主要观察指标 |
| 4.5 统计学分析 |
| 4.6 实验结果 |
| 4.6.1 外源性H_2S对 h-BMMSC成骨分化相关基因的影响 |
| 4.6.2 外源性H_2S对 h-BMMSC成骨分化形成矿化结节量的影响 |
| 第5章 外源性硫化氢对人骨髓间充质干细胞成骨分化调控机制 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 骨形成蛋白(BMPs)/Smad通路 |
| 5.3 丝裂原激活蛋白激酶通路(MAPKs) |
| 5.4 Wnt通路 |
| 5.5 其他通路 |
| 第6章 讨论 |
| 6.1 H_2S在体内产生及变化 |
| 6.2 h-BMMSC分离、培养、纯化及鉴定 |
| 6.3 外源性H_2S(GYY4137)对h-BMMSC增殖能力影响 |
| 6.4 外源性H_2S(GYY4137)对h-BMMSC成骨分化能力影响 |
| 6.5 外源性H_2S(GYY4137)对h-BMMSC成骨分化调控机制 |
| 6.6 总结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文和参加科研情况 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附录 |
（6）明胶-羟基磷灰石支架材料促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 材料与设备 |
| 2.1.2 部分材料的配制及储存方法 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定 |
| 2.2.2 明胶-羟基磷灰石仿生支架材料的制备与表征 |
| 2.2.2.1 明胶-羟基磷灰石仿生支架材料的制备 |
| 2.2.2.2 明胶-羟基磷灰石仿生支架材料的理化检测 |
| 2.2.2.3 明胶-羟基磷灰石仿生支架材料的细胞相容性检测 |
| 2.2.3 明胶-羟基磷灰石仿生支架材料修复大鼠颅骨缺损的体内实验研究 |
| 2.2.3.1 SD大鼠颅骨缺损模型的建立 |
| 2.2.3.2 SD大鼠颅骨缺损模型的CBCT检测 |
| 2.2.3.3 SD大鼠颅骨缺损模型的HE染色和Masson染色 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 SD大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养 |
| 3.2 SD大鼠骨髓间充质干细胞表面特定抗原的鉴定 |
| 3.3 SD大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化潜能的鉴定 |
| 3.4 成功制备明胶-羟基磷灰石仿生支架材料 |
| 3.5 明胶-羟基磷灰石仿生支架材料的形貌特征与理化特性 |
| 3.6 明胶-羟基磷灰石仿生支架材料的生物相容性评价 |
| 3.7 成功建立SD大鼠颅骨缺损模型 |
| 3.8 CBCT 检测 |
| 3.9 HE 染色和 Masson 染色 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 层层自组装技术在组织工程领域的研究进展 |
| 参考文献 |
（7）hsa-miRNA-223-3p对人骨髓间充质干细胞成骨分化细胞影响的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 分离人骨髓间充质干细胞,并进行免疫细胞化学检测鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 hsa-miR-223-3p对人骨髓间充质干细胞成骨分化细胞的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 验证hsa-miR-223-3p与Wnt5a的靶定关系 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文结论 |
| 文章的不足之处 |
| 参考文献 |
| 英汉缩略词对照表 |
| miRNA与Wnt信号通路调控成骨分化的研究进展(综述) |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（8）CRISPR系统对脂肪间充质干细胞成骨分化的调控作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| summary |
| 主要英文缩略词对照表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 问题的提出 |
| 1.2 选题背景及意义 |
| 1.3 文献综述 |
| 1.3.1 间充质干细胞的来源与定义 |
| 1.3.2 间充质干细胞的体外分化能力 |
| 1.3.3 间充质干细胞成骨分化的基因调控网络 |
| 1.3.4 CRISPR/Cas9 系统 |
| 1.4 技术路线 |
| 1.5 论文结构 |
| 第2章 脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 间充质干细胞的分离与培养 |
| 2.2.2 小鼠脂肪间充质干细胞的传代培养 |
| 2.2.3 脂肪间充质干细胞的冻存 |
| 2.2.4 脂肪间充质干细胞的复苏 |
| 2.2.5 脂肪间充质干细胞表面标识物鉴定 |
| 2.2.6 脂肪间充质干细胞克隆形成能力实验及结晶紫染色 |
| 2.2.7 脂肪间充质干细胞生长曲线的测定 |
| 2.2.8 脂肪间充质干细胞细胞周期检测 |
| 2.2.9 脂肪间充质干细胞的成脂诱导分化及油红O染色 |
| 2.2.10 脂肪间充质干细胞的成软骨诱导分化及阿利新蓝染色 |
| 2.2.11 脂肪间充质干细胞成骨诱导分化及茜素红染色 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 酶解法对小鼠脂肪间充质干细胞的分离和培养 |
| 2.3.2 酶解法ASCs表面标志物的鉴定 |
| 2.3.3 酶解法ASCs生长曲线检测 |
| 2.3.4 酶解法ASCs多向分化潜能的鉴定 |
| 2.3.5 优化的组织贴壁法分离脂肪间充质干细胞 |
| 2.3.6 组织法ASCs表面标志物的鉴定 |
| 2.3.7 组织法ASCs的细胞周期检测 |
| 2.3.8 两种分离方法的克隆形成(CFU)能力对比 |
| 2.3.9 两种分离方法的三系分化能力对比 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第3章 CRISPR系统介导脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 sgRNA的设计 |
| 3.2.2 分子克隆与质粒构建 |
| 3.2.3 脂肪间充质干细胞的转染 |
| 3.2.4 细胞全RNA的提取、反转录及荧光实时定量PCR(RT-qPCR) |
| 3.2.5 脂肪间充质干细胞成骨诱导分化及茜素红染色 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 sgRNA的验证 |
| 3.3.2 CRISPR/dCas9 系统介导成骨前体相关基因内源性过表达 |
| 3.3.3 CRISPR/dCas9 系统激活内源性成骨前体基因对成骨诱导能力的影响 |
| 3.3.4 CRISPR系统对成骨分化相关基因的影响 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第4章 CRISPR系统促进成骨分化与抑制成脂分化的研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 sgRNA的设计 |
| 4.2.2 脂肪间充质干细胞表面标识物鉴定 |
| 4.2.3 脂肪间充质干细胞克隆形成能力实验及结晶紫染色 |
| 4.2.4 脂肪间充质干细胞成骨诱导分化及茜素红染色 |
| 4.2.5 脂肪间充质干细胞的成脂诱导分化及油红O染色 |
| 4.2.6 细胞全RNA的提取、反转录及荧光实时定量PCR(RT-qPCR) |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 CRISPR-d Cas9 介导的过表达没有改变小鼠脂肪间充质干细胞的特性 |
| 4.3.2 CRISPR系统促进成骨诱导分化 |
| 4.3.3 CRISPR系统促进成骨分化的同时抑制成脂诱导分化 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 个人简历及博士期间发表的学术论文 |
（9）基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨骨碎补治疗激素性股骨头坏死实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩写词表 |
| 引言 |
| 第一部分 临床实验研究 |
| 实验一 基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨激素性股骨头坏死可能的发病机制 |
| 一、研究对象 |
| 二、主要试剂耗材与仪器设备 |
| 三、实验方法 |
| 1.hBMSCs获取 |
| 2.传代 |
| 3.细胞冻存 |
| 4.两组 hBMSCs 流式细胞仪细胞表面抗原检测 |
| 5.两组 hBMSCs 细胞增殖率检测(CCK-8 法) |
| 6.两组 hBMSCs 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 7.两组 hBMSCs 成骨能力检测——茜素红染色及定量 |
| 8.两组 hBMSCs 成脂能力检测——油红O染色及定量 |
| 9.RT-PCR |
| 10.Western Blot实验 |
| 四、统计学分析 |
| 五、结果 |
| 1.两组 h BMSCs 细胞培养结果 |
| 2. 两组 h BMSCs 细胞表面抗原鉴定结果 |
| 3.细胞增殖检测结果--CCK-8 法 |
| 4.细胞周期检测结果--流式细胞仪 |
| 5.两组 h BMSCs 成骨定向诱导后茜素红染色及定量结果 |
| 6.两组 h BMSCs 成脂定向诱导后油红 O 染色及定量结果 |
| 7.RT-PCR结果 |
| 8.Wstern blot结果 |
| 实验二 基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨骨碎补总黄酮对激素性股骨头坏死患者BMSCs增殖、成骨-成脂分化的影响 |
| 一、主要实验试剂、耗材及仪器 |
| 二、实验方法及步骤 |
| 1. 激素性股骨头坏死患者 h BMSCs 获取、培养、传代方法(同实验一) |
| 2. 干预分组方法 |
| 3. ALP 活性定量检测 |
| 4. 茜素红染色及定量(方法同实验一) |
| 5.RT-PCR 检测 |
| 6.Western blot 检测 |
| 三、统计学分析 |
| 四、结果 |
| 1.不同浓度骨碎补总黄酮干预SONFH患者hBMSCs细胞增殖结果 |
| 2.ALP活性检测结果 |
| 3.茜素红染色及定量检测结果 |
| 4.RT-PCR结果 |
| 5.WB 结果 |
| 讨论 |
| 一、激素性股骨头坏死基于“髓枯骨痿”理论的中医认识 |
| 二、骨髓间充质干细胞与激素性股骨头坏死 |
| 1.骨髓间充质干细胞的分离、培养、纯化及鉴定 |
| 2.两组骨髓间充质干细胞增殖活性的改变 |
| 3.两组骨髓间充质干细胞成骨-成脂活性的改变 |
| 三、激素性股骨头坏死基于Wnt/β-Catenin信号通路的现代研究 |
| 1.Wnt/β-Catenin信号通路与激素性股骨头坏死 |
| 2.Wnt/β-Catenin信号通路下游调控蛋白Cyclin D1、Runx2、Osterix、PPAR-γ功能及在激素性股骨头坏死中的作用机理 |
| 四、基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨骨碎补治疗激素性股骨头坏死疗效 |
| 1.补肾与激素性股骨头坏死 |
| 2.骨碎补药理学研究 |
| 3.骨碎补基于Wnt/β-catenin信号通路治疗SONFH |
| 结论 |
| 第二部分 动物实验研究 基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨大鼠SONFH可能机制及骨碎补对r BMSCs增殖、成骨-成脂分化影响的研究 |
| 一、实验材料 |
| (一)实验动物及药物 |
| (二)主要实验试剂、仪器及主要溶液配制 |
| 二、试验方法 |
| (一)分组和造模 |
| (二)各组SD大鼠股骨头组织获取及HE染色 |
| (三)各组SD大鼠股骨头生物力学测试 |
| (四)各组rBMSCs增殖情况 |
| (五)各组rBMSCs成骨-成脂分化功能改变 |
| 三、统计学分析 |
| 四、结果 |
| 1.五组大鼠基本情况 |
| 2.各组股骨头组织及HE染色结果 |
| 3.各组SD大鼠生物力学测试结果 |
| 4.各组P3代r BMSCs生长情况 |
| 5.各组rBMSCs增殖情况(CCK-8 法) |
| 6.成骨功能改变 |
| 1 )I型胶原SP染色及定量检测结果 |
| 2 )茜素红染色及定量结果 |
| 3 )ALP定量检测结果 |
| 4 )RT-PCR结果 |
| 5 )WB结果 |
| 7.成脂功能改变 |
| 1 )油红O染色及定量检测结果 |
| 2RT-PCR 结果(Wnt10b β-Catenin PPAR-γ) |
| 3 )WB结果 |
| 讨论 |
| 一、激素性股骨头坏死动物模型的建立 |
| (一)造模动物的选择 |
| (二)造模方法的选择 |
| (三)动物模型造模鉴定及疗效评价 |
| 二、基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨骨碎补对SD大鼠激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞增殖、成骨-成脂分化的影响 |
| (一)不同梯度的骨碎补对SD大鼠激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞增殖的影响 |
| (二)基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨骨碎补对SD大鼠激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞成骨-成脂分化的影响 |
| 结论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述 激素性股骨头坏死的机制探讨与治疗选择 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 发表论文 |
（10）基于Wnt/β-Catenin信号通路的补肾活血胶囊治疗激素性股骨头坏死临床与实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 本文主要英文缩略词索引 |
| 引言 |
| 临床研究 |
| 一、临床资料 |
| (一)一般资料 |
| (二)诊断标准 |
| (三)分期标准 |
| (四)病例纳入标准及排除标准 |
| 二、研究方法 |
| (一)分组情况 |
| (二)随访时间 |
| (三)疗效及安全性评价方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 动物实验研究 |
| 第一部分 补肾活血方基于Wnt/β-Catenin 信号通路对SD大鼠激素性股骨头坏死骨修复机制在体研究 |
| 实验一 补肾活血方基于Wnt/β-Catenin通路对SD大鼠激素性股骨头坏死骨组织修复机制研究 |
| 一、实验材料 |
| (一)实验动物及药物 |
| (二)主要实验试剂、仪器及主要溶液配制 |
| 二、试验方法 |
| (一)分组和造模 |
| (二)血清学指标检测 |
| (三)股骨头组织获取及HE染色 |
| (四)实时定量RT-PCR |
| (五)Western Blot实验 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| (一)三组大鼠基本情况 |
| (二)股骨头大体形态及质地 |
| (三)血生化指标检测结果 |
| (四)HE染色结果 |
| (五)RT-PCR结果 |
| (六)Western Blot结果 |
| 实验二 补肾活血方基于Wnt/β-Catenin通路对SD大鼠激素性股骨头坏死体内BMSCs功能影响机制研究 |
| 一、实验材料 |
| (一)实验动物及药物 |
| (二)主要实验试剂、仪器及主要溶液配制 |
| 二、试验方法 |
| (一)分组和造模 |
| (二)三组大鼠BMSCs体外分离、培养、纯化与鉴定 |
| (三)三组大鼠BMSCs细胞增殖功能改变 |
| (四)三组大鼠BMSCs细胞成骨分化功能改变 |
| (五)三组大鼠BMSCs细胞成脂分化功能改变 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| (一)三组大鼠BMSCs细胞培养结果 |
| (二)三组大鼠BMSCs细胞表面抗原鉴定结果 |
| (三)三组大鼠BMSCs细胞增殖检测结果 |
| (四)三组大鼠BMSCs细胞成骨能力检测结果 |
| (五)三组大鼠BMSCs细胞成脂能力检测结果 |
| 讨论 |
| 一、补肾活血胶囊的中医理论基础及药理作用 |
| 二、SD大鼠SONFH模型的建立与补肾活血方疗效 |
| (一)造模实验动物的选择 |
| (二)SONFH模型建立方法的选择 |
| (三)补肾活血方治疗SD大鼠SONFH疗效 |
| 三、补肾活血方基于Wnt/β-Catenin通路治疗激素性股骨头坏死骨修复机制探讨 |
| (一)关于Wnt/β-Catenin通路作用研究 |
| (二)补肾活血方对SONFH特异性转录因子表达影响 |
| 四、补肾活血方基于Wnt/β-Catenin通路对激素性股骨头坏死体内BMSCs功能改变机制探讨 |
| (一)三组大鼠BMSCs分离、培养、纯化及鉴定方法选择 |
| (二)三组大鼠BMSCs增殖活性改变及机制探讨 |
| (三)三组大鼠BMSCs成骨-成脂分化功能改变及机制探讨 |
| 结论 |
| 第二部分 补肾活血方含药血清基于Wnt/β-Catenin信号通路对激素干预骨髓间充质干细胞功能影响离体研究 |
| 一、实验材料 |
| (一)实验动物及药物 |
| (二)主要实验试剂、仪器及主要溶液配制 |
| 二、试验方法 |
| (一)SD大鼠BMSCs体外分离培养与鉴定 |
| (二)补肾活血胶囊含药血清制备 |
| (三)体外激素干预浓度选择 |
| (四)实验分组 |
| (五)CCK-8 测细胞增殖率 |
| (六)茜素红染色及定量 |
| (七)ALP定量检测 |
| (八)RT-PCR实验 |
| (九)Western Blot实验 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| (一)细胞形态学观察结果 |
| (二)表型鉴定结果 |
| (三)增殖率检测结果 |
| (四)茜素红染色及定量检测结果 |
| (五)ALP定量检测结果 |
| (六)RT-PCR结果 |
| (七)Western Blot实验结果 |
| 讨论 |
| 一、补肾活血方含药血清的制备 |
| 二、地塞米松对体外BMSCs成骨-成脂分化调控作用 |
| 三、不同浓度的补肾活血方含药血清对体外激素干预的BMSCs细胞增殖影响 |
| 四、基于Wnt/β-Catenin通路探讨不同梯度补肾活血方含药血清对激素干预的rBMSCs体外成骨-成脂分化的影响 |
| 结论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 查新报告 |
| 论文着作 |
四、人骨髓间充质干细胞的分离培养及向成骨细胞定向分化的实验研究（论文参考文献）
- [1]gga-let-7a-5p通过靶向GDF6调节鸡骨髓间充质干细胞多向分化[D]. 肖艳宇. 广西大学, 2021(12)
- [2]新型镁合金对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响及机制研究[D]. 李强强. 兰州大学, 2021(09)
- [3]SEMA3B调控miR-214信号通路对老年性骨质疏松患者BMMSC成骨分化的影响研究[D]. 吴博. 河北工程大学, 2021(08)
- [4]AGEs通过Wnt/β-catenin通路抑制BMSCs成骨分化及PTH的干预作用[D]. 高飞. 山西医科大学, 2020(11)
- [5]GYY4137对绝经后骨质疏松症患者BMMSC成骨分化的影响作用[D]. 杨云飞. 河北工程大学, 2020(07)
- [6]明胶-羟基磷灰石支架材料促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化[D]. 郭雨晴. 安徽医科大学, 2020
- [7]hsa-miRNA-223-3p对人骨髓间充质干细胞成骨分化细胞影响的实验研究[D]. 耿瑶. 西南医科大学, 2020(10)
- [8]CRISPR系统对脂肪间充质干细胞成骨分化的调控作用研究[D]. 杨馥如. 甘肃农业大学, 2019(01)
- [9]基于Wnt/β-Catenin信号通路探讨骨碎补治疗激素性股骨头坏死实验研究[D]. 杨清毅. 山东中医药大学, 2019(05)
- [10]基于Wnt/β-Catenin信号通路的补肾活血胶囊治疗激素性股骨头坏死临床与实验研究[D]. 刘金豹. 山东中医药大学, 2018(01)
标签：干细胞论文; 诱导多能干细胞论文; wnt信号通路论文; 细胞分化论文; β-catenin论文;