导读:本文包含了二糖水解酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:里氏木霉,纤维二糖水解酶Ⅰ,碳源诱导,糖基化
二糖水解酶论文文献综述
马亚楠[1]（2019）在《里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅰ在不同碳源诱导下的糖基化》一文中研究指出当前,石油等不可再生能源日益匮乏,化石燃料燃烧所带来的环境问题也日益严重,开发清洁的可再生能源已成为当下最紧迫的任务之一。木质纤维素的储存量十分庞大,而且价格低廉。将木质纤维素转化为液体燃料纤维素乙醇,既可以有效地缓解能源危机,又能保护生态环境,还能使潜在的资源被充分挖掘利用。在这一生物炼制过程中,纤维素酶的作用尤为突出。纤维素酶是高度糖基化的,通过改造纤维素酶的糖基化修饰来提高酶的活性,进而提高纤维素的水解效率是一个新的突破口。而如果想对纤维素酶的糖基化进行改造,需要首先对纤维素酶糖基化的位点和糖链的结构进行系统的了解。本文以纤维素酶高产菌株Trichodermareesei RutC-30和纤维素酶低产菌株Trichodermareesei QM9414为研究对象,系统的研究了里氏木霉纤维二糖水解酶I(以下简称TrCBHI)在乳糖、纤维二糖和丰富培养基诱导下的糖基化修饰情况。将六种目的蛋白分离纯化,然后通过混合酶解(gluC+trypsin和chymotrypsin)的方法分别处理目的蛋白,将获得的肽段用ZIC-HILIC色谱柱进行分离,收集糖肽后分别采用碰撞诱导裂解(CID)和电子转移裂解(ETD)这两种破碎方式使糖肽解离,最后用LC-MS/MS进行分析。质谱数据分析结果显示(1)发现N64上有高甘露糖型的N-糖链修饰。在T.reesei RutC-30和T.reesei QM9414的TrCBH I中均鉴定到了N64上有糖基化修饰,且糖链形式为高甘露糖型。(2)N45上除了有杂合型的糖链,还有高甘露糖型的糖链修饰。(3)TrCBH I的CD区普遍存在O-糖基化修饰。以前对TrCBH I的CD区的O-糖基化的研究很少,只有近期的一篇文献中报道其S20、S21和T24上各有一个HexNAc修饰。而在本研究中,鉴定出11个新的O-糖基化位点,如S8、T10、T232、S396等。在这些O-糖基化位点上,通常有1～4个Hex或者1～2个HexNAc修饰。(4)TrCBH I的CBM区有新的O-糖基化位点T484。以前只有一篇文献报道CBM的Thr462和Ser464上有1～3个Man修饰。本研究中,将T.reesei RutC-30在乳糖诱导下,发现其TrCBH I中484位置上的苏氨酸上有单个的Hex修饰。(5)TrCBH I的CD区的糖基化位点趋于形成糖基化簇。在TrCBH I的CD区,发现5个糖基化簇,它们分别是N270/T271/S272/S396,T232/T255,T383/N384/T389,S8/T10 和 N45/S46。其中,N45/S46和S8/T10位于催化活性位点隧道入口附近,而T383/N384/T389位于与纤维素晶体最接近的肽环上,从而暗示了这叁个糖基化簇可能与底物识别或者对底物的催化活性有关。通过横向分析来看,不同菌株在同一碳源诱导下TrCBH I的糖基化修饰情况不同,不仅如此,同一菌株在不同碳源诱导下TrCBH I的糖基化修饰情况也不同。从菌株上来看,与T.reesei QM9414相比,纤维素酶高产菌株T.reesei RutC-30的糖基化更为多样化和复杂化,且同一位点上糖链的异质性较严重。而从诱导方式上来看,乳糖诱导下的TrCBH I的糖基化位点更丰富,糖链的形式更为多样。通过对纤维素酶高产菌株T.reese/RutC-30和纤维素酶低产菌株T.reesei QM9414在不同碳源诱导下的糖基化进行系统的研究,深入挖掘出更多糖基化修饰的位点和糖链,使人们对TrCBH I的糖基化了解的更全面,为后续对糖基化进行改造进而提高纤维素酶的水解活性奠定了坚实的理论基础。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-21）
孙宁宁[2]（2018）在《里氏木霉异源表达纤维二糖水解酶Te-Cel7A与系统分析蛋白酶Spt1功能》一文中研究指出里氏木霉(Trichoderma reesei)是目前生产纤维素酶的主要工业菌株,其分泌的纤维素酶系能够将木质纤维素水解为葡萄糖以供生物乙醇的生产。然而,在工业降解木质纤维素的过程通常需要纤维素酶具有耐热和高稳定性等特性。因此,在里氏木霉中表达热稳定纤维素酶是改良纤维素酶系的策略之一。此外,里氏木霉中的蛋白酶可能会对蛋白分泌表达产生影响,但目前对其认识仍不清晰。本论文一方面在里氏木霉中异源表达热稳定纤维素酶对里氏木霉酶系进行改良,另一方面研究里氏木霉液泡蛋白酶功能,然后利用液泡蛋白酶靶点深入改造热稳定纤维素酶异源表达的工程菌株,从而构建起纤维素酶系优化的里氏木霉工程菌。主要研究内容如下:(一)在里氏木霉中异源表达热稳定纤维二糖水解酶Te-Cel7A利用组成型强启动子Pcdna1和内源cbh1信号肽SP成功构建了Te-Cel7A的表达盒。表达盒转化里氏木霉QP4原生质体后筛选得到了一株纤维素水解能力强的转化子,命名为QTC14。在葡萄糖条件下QTC14能够分泌有活力的且酶成分单一的Te-Cel7A蛋白。对其酶学性质进行分析发现,Te-Cel7A的最适酶活温度为65℃,最适p H为5.0,与T.emersonii所分泌的天然Te-Cel7A的性质相似,说明在里氏木霉中可以异源表达热稳定纤维素酶。在产酶发酵条件下,里氏木霉QTC14的CBH酶活相较出发菌株QP4提高了28.8%,FPA酶活提高了65.2%。另外,QTC14总纤维素酶和CBH的热稳定性也高于出发菌株QP4。当QTC14的发酵酶液用于糖化不同木质纤维素底物时,QTC14对脱木素木糖渣和未脱木素木糖渣的糖化效率均高于出发菌株QP4。特别是糖化脱木素木糖渣时,QTC14的糖转化率为49.3%,与QP4的糖转化率相比提高了13.9%。这说明里氏木霉可以成功实现异源热稳定纤维素酶的表达,产生的重组纤维素酶系在生物质转化方面具有潜在的应用价值。(二)里氏木霉液泡丝氨酸蛋白酶Spt1的功能研究里氏木霉蛋白酶Spt1的蛋白序列分析发现,该蛋白酶属于枯草杆菌蛋白酶家族中的类枯草杆菌蛋白酶,具有前导肽,可能属于液泡蛋白。为探究里氏木霉Spt1的功能,我们分别构建了Spt1缺失菌株Δspt1及回补菌株Rspt1。结果显示,Spt1的缺失使得里氏木霉孢子产量显着降低,Spt1回补之后生孢性状恢复,说明Spt1参与了里氏木霉孢子的形成。同时,Δspt1在不同碳源上的生长速率不受影响,但是影响菌株对纤维素的降解能力。通过分析Δspt1和Rspt1的胞外纤维素酶活力发现,Δspt1的胞外蛋白分泌量、FPA、EG酶活、CBH酶活和BGL酶活均显着下降,而Spt1回补之后,纤维素酶活力得到恢复。上述结果说明,Spt1与里氏木霉纤维素酶的合成与分泌有关。为了确认Spt1是否位于液泡,进一步利用绿色荧光蛋白对Spt1进行细胞定位研究,结果表明里氏木霉丝氨酸蛋白酶Spt1位于液泡中。为了研究Spt1对纤维素酶系的改良作用,我们利用spt1自身启动子和组成型强启动子cdna1分别构建了Spt1过表达菌株SOE和SOD。通过分析SOE和SOD的纤维素酶活力进行发现,Spt1的过表达能够显着提高里氏木霉的纤维素酶的酶活。尤其利用组成型强启动子cdna1构建的Spt1过表达菌株SOD,与出发菌株QP4相比,其胞外蛋白量、FPA、EG酶活、CBH酶活和BGL酶活分别提高了65.9%、140%、48.8%、265%和260%。说明Spt1是改造里氏木霉酶系的有效靶点。(叁)在里氏木霉QTC14中过表达Spt1为构建纤维素酶系更加优良的里氏木霉工程菌,我们将Spt1在异源表达热稳定性Te-CBH1的里氏木霉工程菌QTC14中进行了过表达研究,成功构建了里氏木霉工程菌STC。通过分析STC和QTC14的纤维素酶活力发现,STC与QTC14相比,其胞外蛋白量、FPA、EG酶活、CBH酶活和BGL酶活分别增长了10%、10%、22%、15%、34%。这些结果表明,以液泡蛋白酶Spt1为靶点,可以实现对里氏木霉工程菌株的进一步改良,提升纤维素酶分泌水平及纤维素酶系活力,从而有助于降低纤维素酶生产成本并促进生物乙醇工业发展。(本文来源于《山东师范大学》期刊2018-05-30）
黄厚厚[3]（2018）在《纤维二糖水解酶TrCe16A产物排出过程的研究》一文中研究指出纤维素是由葡萄糖通过β-1,4-糖苷键紧密相连构成的大分子多糖。常温下,纤维素不易溶于有机溶剂和水溶液,是植物细胞壁的主要成分,也是自然界中储量最多的一种多糖。由于构成纤维素的分子之间存在着很强的相互作用力,因而在一般条件下纤维素在自然界中很难被分解。纤维素酶是一类可以通过相互协同作用将纤维素降解为葡萄糖的酶的总称。纤维素酶总体上可以分为叁大类:内切葡聚糖酶(EG)、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。内切葡聚糖酶可以作用在纤维素分子内部的非结晶区。它能够在分子内部任意切断β-1,4-糖苷键,从而生成很多具有非还原末端的小分子纤维寡糖。外切葡聚糖酶可以附着在纤维寡糖的还原或非还原末端,随后将其进一步水解为纤维二糖。最后,纤维二糖被β-1,4-葡萄糖苷酶转化为葡萄糖。在纤维素酶的所有家族中,纤维素酶6家族占据着十分重要的地位。在纤维素酶6家族中,纤维二糖水解酶TrCe16A是一种重要的外切葡聚糖酶。在TrCe16A中,它通过Inverting水解机理将纤维低聚糖水解为纤维二糖。在这个重要的纤维二糖水解酶中,人们普遍认为存在6个结合位点,即-2到+4结合位点。但是在纤维素酶6家族同源的纤维二糖水解酶HiCe16A和CtCe16A中,实验中得到了底物占据-3和-4结合位点的结晶(PDB 1OCB和4A05)。在这两个晶体结构中,一个关键的特点就是Tyr104残基旋转了大约120°后打开了-3结合位点。通过基因序列以及结构的相似性,我们猜测在TrCe16A中可能也存在-3和-4位置。为了验证我们的猜测,我们使用了常规动力学模拟方法分别探究了产物水解前和水解后的不同的稳定构象。结果表明,当底物是没有发生水解的纤维六糖时,Tyr103在整个模拟过程中不会发生旋转。当底物是纤维六糖水解断开后形成的纤维四糖和纤维二糖时,Tyr103残基在模拟过程中会发生一定的旋转,从而导致水解后的稳定构象中会有两种不同的Tyr103构象。在其中一种稳定构象中,Tyr103残基旋转了大约110°后打开了-3底物结合位置。在本文中,我们对Tyr103旋转的原因进行了探究。随后,我们使用了拉伸分子动力学分别以这两种不同的Tyr103的稳定结构为初始构象进行了3个不同方向的产物排出过程的分子动力学模拟。拉伸分子动力学的模拟结果表明,当沿着方向1,即当Tyr103不发生旋转时,它的整个产物排出过程的所需的能量为22.3 Kcal mol~(-1)。而当Tyr103发生旋转后,它会在一定程度上扩大出口通道。为了确定Tyr103残基的作用,我们首先选择了与方向1相似的方向进行拉伸分子动力学模拟,我们称其为方向2。拉伸分子动力学的结果表明,沿着方向2的产物排出所需的能量10.3 Kcal mol~(-1)。另外,由于Tyr103旋转打开了-3结合位点,我们选择了沿着Tyr103旋转后打开的方向进行拉伸分子动力学模拟,我们称其为方向3。拉伸分子动力学的结果表明,沿着方向3的产物排出过程所需的能量14.4 Kcal mol~(-1)。通过对叁组不同状态的产物排出过程所需的能量对比,我们发现沿着方向2所需的能量最低。此外,相比于Tyr103不发生旋转,当Tyr103发生旋转后,它能够很大的程度上降低产物排出所需要的能量。因此,我们认为Tyr103旋转过程是产物排出的一个重要过程。它能够帮助降低产物排出所需的能量。这将对我们进一步提高水解效率提供理论上的帮助。(本文来源于《吉林大学》期刊2018-03-01）
秦慧彬,李梦菲,杨洪江[4]（2017）在《黑曲霉纤维二糖水解酶基因cbhA在毕赤酵母中异源表达》一文中研究指出[目的]对黑曲霉纤维二糖水解酶cbhA基因进行了克隆和在毕赤酵母中的真核表达。[方法]采用PCR方法扩增黑曲霉纤维二糖水解酶A(Cellobiohydrolase A,CBHA)基因,获得的DNA序列与cbhA基因表现出高度相似,推导出的氨基酸序列与真菌CBHA酶也高度相似,属于糖基水解酶第7家族。将扩增得到的cbhA基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K上,与α-因子信号肽序列形成融合蛋白,进一步通过电转化方法将线性化质粒p PIC9K-cbhA转化至毕赤酵母GS115菌株进行表达。[结果]在甲醇诱导下,重组菌株CMC比酶活力是对照的2.5倍,SDS-PAGE分析结果也确认了cbhA基因在重组菌株GS115/p PIC9K-cbhA中的表达。对该酶性质的分析表明,重组CBHA酶水解CMC底物最适p H值为5.0,最适温度为55℃。[结论]黑曲霉纤维二糖水解酶基因cbhA的克隆和其真核表达工程菌株的构建,为获得纤维二糖水解酶A高产菌株,实现纤维素酶多组分的人工组装奠定了基础。(本文来源于《生物技术》期刊2017年04期）
袁茂翼,叶发银,雷琳,赵国华[5]（2017）在《纤维二糖水解酶的研究进展》一文中研究指出纤维素是世界上最丰富的可再生资源,将其降解为小分子糖并转化为燃料或精细化学品一直是研究的难点和热点。纤维二糖水解酶是生物降解纤维素的关键酶之一,它属于外切酶,作用于结晶纤维素的链末端依次切开相隔的β-1,4-糖苷键,释放纤维二糖。论文对纤维二糖水解酶的来源、分类、结构,对纤维素的作用机理、酶学性质、分子进化、商业酶制剂生产情况及其应用特性进行了总结,同时对该研究进行了展望。(本文来源于《食品与发酵工业》期刊2017年10期）
孙逊,钱梦丹,张浩,王嵩[6]（2016）在《分子动力学模拟方法对过程性纤维二糖水解酶Cel7A中的“选择性供水机制”的研究》一文中研究指出纤维素是高等植物细胞壁的主要成分,是自然界中数量最大的可再生性的碳水化合物。对其合理利用开发最关键的问题是具有很高化学稳定性的纤维素的降解,其中最高效的方法是使用纤维素酶。文章对一种过程性纤维素二糖水解酶Cel7A进行分子动力学模拟,提出一种新型的选择性供水机制,即通过间隔供水使水解产物是纤维二糖而不是单糖。在该机制中,His225,Glu209和Asp211共同构成供水控制开关。此外,还通过MM/PBSA自由能计算分析了水解过程中底物周围的残基与底物之间相互作用,其中氢键作用主要与酶中特定底物结合位置相关,而Trp38,Trp40,Trp371和Trp380等疏水残基,不仅降低底物滑动势垒,而且其疏水作用同时也阻止了外部的水分子通过水控制开关以外的空隙进入到水解位置。结合之前我们发现Cel48F中也存在类似的"选择性供水机制",可以猜测该机制很可能普遍存在于过程性纤维二糖水解酶中。(本文来源于《中国化学会第30届学术年会摘要集-第十九分会：化学中的量子与经典动力学》期刊2016-07-01）
王翠艳,王玉华,朴春红,刘俊梅,胡耀辉[7]（2016）在《绿色木霉纤维二糖水解酶基因的克隆及其在乳酸菌中的表达与鉴定》一文中研究指出采用乳酸菌表达系统进行绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的表达研究。参照Gen Bank上发表的绿色木霉(Trichoderma viride)cbhⅡ基因(Gen Bank登录号:M55080)设计引物并通过聚合酶链式反应克隆获得其c DNA序列长1 441 bp。为了达到表达分泌该酶的目的,在其基因上游序列前添加了大小为80 bp的信号肽序列。进一步通过生物信息学方法将密码子按照乳酸菌的偏好性进行了优化,通过全基因合成获得了优化后的cbhⅡ基因。将该基因与穿梭表达载体p MG36e连接,构建原核表达载体p MG36e-S-cbhⅡ;利用电转化方法将其转入乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞中构建重组乳酸菌,纯化的重组菌蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,得到一条约为53 k D的目的蛋白条带,与预期大小相符;利用3,5-二硝基水杨酸法测定培养基上清液中水解纤维素酶的活力达到16.7 U/m L,菌体裂解液上清液和菌体沉淀几乎没有酶活力。结果表明,纤维二糖水解酶基因信号肽序列被乳酸乳球菌正确识别,并成功实现了胞外表达。(本文来源于《食品科学》期刊2016年19期）
王翠艳[8]（2016）在《高表达纤维二糖水解酶Ⅱ工程菌构建及其发酵豆渣理化特性研究》一文中研究指出大豆副产品—豆渣是非常优秀的植物蛋白碳水化合物原料,其中纤维素含量高达52%左右,并且含有多种营养成分。将豆渣水解将提高其利用率,本研究通过生物技术手段构建了能水解豆渣的工程菌,该工程菌为豆渣中可溶性膳食纤维、低聚糖及大豆异黄酮的产率提高奠定基础,为提高豆渣附加值提供了新途径。提高豆渣中可溶性物质含量关键在于提高其纤维素的利用率,而纤维素酶纤维二糖水解酶在纤维素酶系中至关重要,它是唯一可以水解纤维素结晶区的酶组分。因此,本研究构建了过表达纤维二糖水解酶的重组乳酸菌工程菌,并采用该菌株对豆渣进行了发酵,同时对其发酵豆渣的理化成分进行了分析研究。参照GenBank上发表的绿色木霉(T.reesei)CBH II基因(GenBank登录号:M55080)设计引物并通过PCR方法克隆得到其cDNA序列长1440 bp,进一步通过生物信息学方法按照乳酸菌的偏好性进行了优化后,通过全基因合成获得了优化后的CBH II基因;将该基因与穿梭表达载体pMG36e连接,得到重组表达载体pMG36e-CBH II,然后采用大肠杆菌表达系统进行绿色木霉纤维二糖水解酶CBH II基因的表达特性研究:将构建pMG36e-CBH II载体利用热击的方法导入BL21大肠杆菌感受态细胞中得到重组大肠杆菌,培养重组菌提取蛋白,通过SDS-PAGE电泳检测,在约为53 kD处得到一条符合预期的目的蛋白条带。采用DNS法测定菌体超声破碎后的菌体裂解液上清的酶活性,测得在培养16 h,酶活最大为16.4 U/mL,裂解液菌体沉淀几乎没有酶活,结果表明,纤维二糖水解酶基因CBH II在大肠杆菌中成功获得表达。本文进一步采用乳酸乳球菌表达系统进行绿色木霉的纤维二糖水解酶CBH II基因的表达研究,为了达到分泌表达的目的在该基因上游序列前添加了大小为81 bp的信号肽,进一步通过生物信息学方法按照乳酸菌的偏好性进行了优化后,通过全基因合成获得了优化后的CBH II基因,将该基因与pMG36e穿梭表达载体连接,构建pMG36e-S-CBH II表达载体,利用电转化方法将其转入乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞中构建重组乳酸乳球菌,提取的重组菌蛋白通过SDS-PAGE电泳检测,在约为53 kD处得到一条符合预期的目的蛋白条带。利用DNS法测定其重组离心菌体上清中纤维素酶活性大小,测得当重组菌培养到20 h时,在最适宜温度和pH分别为50℃、5的条件下,酶活力达到16.7 U/mL,菌体裂解液上清和菌体裂解沉淀几乎没有酶活。因此,研究结果表明,纤维二糖水解酶基因信号肽序列被乳酸乳球菌正确识别,并成功实现了胞外表达,这对进一步的实验研究奠定了基础。又利用乳酸菌工程菌在30℃,自然pH条件下发酵豆渣,对发酵豆渣进行水溶性物质测定,利用SPSS 21.0统计分析软件对数据进行分析,采用独立样本t检验对重组菌发酵后豆渣及未经重组菌发酵豆渣的水溶性物质含量进行分析结果表明差异显着(P<0.05)。分析结果显示可溶性物质中粗脂肪增加了17.43%,总氨基酸增加了1225%,可溶性总糖增加63.9%,可溶性膳食纤维增加了138.05%。因此试验结果表明,构建的乳酸乳球菌工程菌可以达到发酵豆渣并提高其可溶性物质含量的目的。(本文来源于《吉林农业大学》期刊2016-04-01）
穆大帅,许振兴,慕欣,杜宗军,陈冠军[9]（2015）在《海洋噬琼胶菌HQM9新琼二糖水解酶系基因的鉴定及特性研究》一文中研究指出目前海藻多糖降解主要依赖物理化学的方法,且产生的相当部分寡糖很难被现有的工业微生物菌株降解和利用,阻碍了海藻生物质转化技术的发展,因此解析微生物降解利用海藻多糖的机制有助于海藻生物质能源的转化。琼胶是最为丰富的海藻多糖之一,其完全生物降解依赖于新琼二糖水解酶(α-neoagarobiose hydrolase,NABH)的参与。本文以新分离鉴定并进行基因组测序的一株海洋噬琼胶菌HQM9(Aquimarina agarlyticus HQM9)为研究对象,对其新琼二糖水解酶基因及其酶学特性进行研究。基因组信息分析发现该菌含有28个可能的琼胶酶基因,且编码酶均属于β-琼胶酶。利用生物信息学分析,HQM9中含有6个潜在的编码新琼二糖水解酶(AaNABH)基因,与已知的NABH相似性36%-70%,且均具有典型的催化结构域。研究中基于PET表达系统对这6个基因进行克隆和异源表达,系统地鉴定其功能、酶学特性。进而推测4aNabh在HQM9降解利用琼胶过程中的作用。研究结果将有助于进一步加深对琼胶降解机制的了解,为今后琼胶代谢工程菌株的改造及海藻生物能源的转化提供理论依据。(本文来源于《2015中国酶工程与糖生物工程学术研讨会论文摘要集》期刊2015-08-21）
杨孟[10]（2015）在《β-琼胶酶的纯化及新琼二糖水解酶AgWH117A结构的研究》一文中研究指出琼胶酶是一类能够降解琼胶生成琼胶寡糖的酶。根据断裂方式的不同可分为a-琼胶酶和p-琼胶酶。琼胶酶的应用非常广泛：可作为工具酶分离海藻中的原生质体;回收琼脂糖凝胶中DNA和分析海藻细胞壁中多糖成分。另外琼胶酶降解琼脂产生的琼胶寡糖由于其显着的生物学活性,在食品和医药领域也有广泛的应用。本文从青岛近海的红藻中筛选得到一株高产琼胶酶菌株,并通过发酵优化之后,分离纯化得到2种功能良好的p-琼胶酶：同时对本课题组表达成功的新琼二糖水解酶AgWH117A进行了结晶以及结构解析。主要研究内容及结论如下：(1)从青岛近海红藻类以及印尼海泥中筛选得到了6株海洋产琼胶酶菌株。经过16S rRNA测序鉴定,确定其分别属于Pseudoalteromonas sp.、Agarivorans albus.、Vibrio lentus和 Microbulbifer sp.,并对其中产琼胶酶活性高的菌株进行了菌株鉴定其为Agarivorans albus,并命名其为Agarivorans albus OAY2。为提高OAY2菌株的产酶量,对发酵培养基进行了优化。确定其最佳优化条件为蛋白胨0.49 g/L,酵母粉1.08g/L, pH9.85。酶活由原来的1.06 U/mL提高到2.65 U/mL。(2)从Agarivorans albus OAY2发酵液中,纯化得到了2个p-琼胶酶,分别命名为琼胶酶a和琼胶酶b。发酵液经硫酸铵分级沉淀,硫酸铵饱和度为60%时,酶获得最佳比活。优化蛋白纯化条件,发现琼胶酶a在20mM, pH6.0的磷酸盐缓冲液中经DEAE柱子可以得到纯度较高的蛋白；琼胶酶b在20mM,pH7.0的Tris-Hcl缓冲液中经强阴离子交换柱Q柱,可以达到纯度较高的蛋白。琼胶酶a和b纯化之后的回收率分别为0.16%和0.09%,比活由原来的25.26 U/mg分别提高到了2715 U/mg和1338 U/mg。琼胶酶a,b的分子量分别为50 kDa和107 kDa。琼胶酶a的最适温度与pH分别为40℃和9.0,琼胶酶b的最合温度与pH为50℃和9.0。Cu2+, Co2+,Mn2+对琼胶酶a,b有很大的抑制作用,而DTT对这两个酶有很大的促进作用。13C-NMR和TLC结果显示琼胶酶a的主要产物是新琼二糖(NA2),新琼四糖(NA4)和新琼六糖(NA6)。琼胶酶b的只要产物是八糖以上的糖,但是它也可长时间反应生成NA2。根据基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF/MS)结果显示,琼胶酶a属于糖苷水解酶(GH)118家族,琼胶酶b属于GH50家族。(3)新琼二糖水解酶AgWH117A能够降解新琼寡糖生成琼寡糖和内醚半乳糖,是微生物代谢琼脂的关键酶之一,也是生产奇数琼寡糖和内醚半乳糖的重要工具酶。经过X-射线衍射得到新琼二糖水解酶AgWH117A的叁维结构。对比NCBI数据库中有结品的蛋白质氨基酸序列为α-NABH(Saccharophagus Degradans2-40)其相似性最高的为74%。活性位点关键氨基酸其同为广义碱Asp52-Asp207和广义酸Glu207。在AgWH117A的叁维结构中,一个不对称单元有两个分子,空间位置是p21位,推测其催化机制是保留机制。利用“TK-SA "模型探索影响AgWH117A酶活热稳定性氨基酸位点。"TK-SA"模型是以氨基酸之间的相互作用力为依据,计算出分子间斥力,排除斥力较大的氨基酸.活性位点的氨基酸以及loop环上的氨基酸。通过11个位点的丙氨酸扫描之后,发现能够提高AgWH117A酶活热稳定性的突变体。(4)本研究纯化得到的琼胶酶a,b在较广泛的温度与pH范围内具有很高的活性。较好的热稳定性及pH稳定性增加了其在工业当中的应用。酶a与酶b的产物丰富,包括NA2、NA4、NA6、NA8等糖。不仅这两个酶,这个菌株Agarivorans albus OAY02也值得我们进一步研究。通过蛋白质结晶获得了在琼胶酶降解菌中关键酶之一,AgWH117A的晶体结构。晶体结构的获得,能够更好的阐述其作用机制,并为改造酶提供更加科学的依据。(本文来源于《中国海洋大学》期刊2015-06-01）
二糖水解酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
里氏木霉(Trichoderma reesei)是目前生产纤维素酶的主要工业菌株,其分泌的纤维素酶系能够将木质纤维素水解为葡萄糖以供生物乙醇的生产。然而,在工业降解木质纤维素的过程通常需要纤维素酶具有耐热和高稳定性等特性。因此,在里氏木霉中表达热稳定纤维素酶是改良纤维素酶系的策略之一。此外,里氏木霉中的蛋白酶可能会对蛋白分泌表达产生影响,但目前对其认识仍不清晰。本论文一方面在里氏木霉中异源表达热稳定纤维素酶对里氏木霉酶系进行改良,另一方面研究里氏木霉液泡蛋白酶功能,然后利用液泡蛋白酶靶点深入改造热稳定纤维素酶异源表达的工程菌株,从而构建起纤维素酶系优化的里氏木霉工程菌。主要研究内容如下:(一)在里氏木霉中异源表达热稳定纤维二糖水解酶Te-Cel7A利用组成型强启动子Pcdna1和内源cbh1信号肽SP成功构建了Te-Cel7A的表达盒。表达盒转化里氏木霉QP4原生质体后筛选得到了一株纤维素水解能力强的转化子,命名为QTC14。在葡萄糖条件下QTC14能够分泌有活力的且酶成分单一的Te-Cel7A蛋白。对其酶学性质进行分析发现,Te-Cel7A的最适酶活温度为65℃,最适p H为5.0,与T.emersonii所分泌的天然Te-Cel7A的性质相似,说明在里氏木霉中可以异源表达热稳定纤维素酶。在产酶发酵条件下,里氏木霉QTC14的CBH酶活相较出发菌株QP4提高了28.8%,FPA酶活提高了65.2%。另外,QTC14总纤维素酶和CBH的热稳定性也高于出发菌株QP4。当QTC14的发酵酶液用于糖化不同木质纤维素底物时,QTC14对脱木素木糖渣和未脱木素木糖渣的糖化效率均高于出发菌株QP4。特别是糖化脱木素木糖渣时,QTC14的糖转化率为49.3%,与QP4的糖转化率相比提高了13.9%。这说明里氏木霉可以成功实现异源热稳定纤维素酶的表达,产生的重组纤维素酶系在生物质转化方面具有潜在的应用价值。(二)里氏木霉液泡丝氨酸蛋白酶Spt1的功能研究里氏木霉蛋白酶Spt1的蛋白序列分析发现,该蛋白酶属于枯草杆菌蛋白酶家族中的类枯草杆菌蛋白酶,具有前导肽,可能属于液泡蛋白。为探究里氏木霉Spt1的功能,我们分别构建了Spt1缺失菌株Δspt1及回补菌株Rspt1。结果显示,Spt1的缺失使得里氏木霉孢子产量显着降低,Spt1回补之后生孢性状恢复,说明Spt1参与了里氏木霉孢子的形成。同时,Δspt1在不同碳源上的生长速率不受影响,但是影响菌株对纤维素的降解能力。通过分析Δspt1和Rspt1的胞外纤维素酶活力发现,Δspt1的胞外蛋白分泌量、FPA、EG酶活、CBH酶活和BGL酶活均显着下降,而Spt1回补之后,纤维素酶活力得到恢复。上述结果说明,Spt1与里氏木霉纤维素酶的合成与分泌有关。为了确认Spt1是否位于液泡,进一步利用绿色荧光蛋白对Spt1进行细胞定位研究,结果表明里氏木霉丝氨酸蛋白酶Spt1位于液泡中。为了研究Spt1对纤维素酶系的改良作用,我们利用spt1自身启动子和组成型强启动子cdna1分别构建了Spt1过表达菌株SOE和SOD。通过分析SOE和SOD的纤维素酶活力进行发现,Spt1的过表达能够显着提高里氏木霉的纤维素酶的酶活。尤其利用组成型强启动子cdna1构建的Spt1过表达菌株SOD,与出发菌株QP4相比,其胞外蛋白量、FPA、EG酶活、CBH酶活和BGL酶活分别提高了65.9%、140%、48.8%、265%和260%。说明Spt1是改造里氏木霉酶系的有效靶点。(叁)在里氏木霉QTC14中过表达Spt1为构建纤维素酶系更加优良的里氏木霉工程菌,我们将Spt1在异源表达热稳定性Te-CBH1的里氏木霉工程菌QTC14中进行了过表达研究,成功构建了里氏木霉工程菌STC。通过分析STC和QTC14的纤维素酶活力发现,STC与QTC14相比,其胞外蛋白量、FPA、EG酶活、CBH酶活和BGL酶活分别增长了10%、10%、22%、15%、34%。这些结果表明,以液泡蛋白酶Spt1为靶点,可以实现对里氏木霉工程菌株的进一步改良,提升纤维素酶分泌水平及纤维素酶系活力,从而有助于降低纤维素酶生产成本并促进生物乙醇工业发展。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
二糖水解酶论文参考文献
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