导读:本文包含了纤维二糖水解酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:里氏木霉,纤维二糖水解酶Ⅰ,碳源诱导,糖基化
纤维二糖水解酶论文文献综述
马亚楠[1]（2019）在《里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅰ在不同碳源诱导下的糖基化》一文中研究指出当前,石油等不可再生能源日益匮乏,化石燃料燃烧所带来的环境问题也日益严重,开发清洁的可再生能源已成为当下最紧迫的任务之一。木质纤维素的储存量十分庞大,而且价格低廉。将木质纤维素转化为液体燃料纤维素乙醇,既可以有效地缓解能源危机,又能保护生态环境,还能使潜在的资源被充分挖掘利用。在这一生物炼制过程中,纤维素酶的作用尤为突出。纤维素酶是高度糖基化的,通过改造纤维素酶的糖基化修饰来提高酶的活性,进而提高纤维素的水解效率是一个新的突破口。而如果想对纤维素酶的糖基化进行改造,需要首先对纤维素酶糖基化的位点和糖链的结构进行系统的了解。本文以纤维素酶高产菌株Trichodermareesei RutC-30和纤维素酶低产菌株Trichodermareesei QM9414为研究对象,系统的研究了里氏木霉纤维二糖水解酶I(以下简称TrCBHI)在乳糖、纤维二糖和丰富培养基诱导下的糖基化修饰情况。将六种目的蛋白分离纯化,然后通过混合酶解(gluC+trypsin和chymotrypsin)的方法分别处理目的蛋白,将获得的肽段用ZIC-HILIC色谱柱进行分离,收集糖肽后分别采用碰撞诱导裂解(CID)和电子转移裂解(ETD)这两种破碎方式使糖肽解离,最后用LC-MS/MS进行分析。质谱数据分析结果显示(1)发现N64上有高甘露糖型的N-糖链修饰。在T.reesei RutC-30和T.reesei QM9414的TrCBH I中均鉴定到了N64上有糖基化修饰,且糖链形式为高甘露糖型。(2)N45上除了有杂合型的糖链,还有高甘露糖型的糖链修饰。(3)TrCBH I的CD区普遍存在O-糖基化修饰。以前对TrCBH I的CD区的O-糖基化的研究很少,只有近期的一篇文献中报道其S20、S21和T24上各有一个HexNAc修饰。而在本研究中,鉴定出11个新的O-糖基化位点,如S8、T10、T232、S396等。在这些O-糖基化位点上,通常有1～4个Hex或者1～2个HexNAc修饰。(4)TrCBH I的CBM区有新的O-糖基化位点T484。以前只有一篇文献报道CBM的Thr462和Ser464上有1～3个Man修饰。本研究中,将T.reesei RutC-30在乳糖诱导下,发现其TrCBH I中484位置上的苏氨酸上有单个的Hex修饰。(5)TrCBH I的CD区的糖基化位点趋于形成糖基化簇。在TrCBH I的CD区,发现5个糖基化簇,它们分别是N270/T271/S272/S396,T232/T255,T383/N384/T389,S8/T10 和 N45/S46。其中,N45/S46和S8/T10位于催化活性位点隧道入口附近,而T383/N384/T389位于与纤维素晶体最接近的肽环上,从而暗示了这叁个糖基化簇可能与底物识别或者对底物的催化活性有关。通过横向分析来看,不同菌株在同一碳源诱导下TrCBH I的糖基化修饰情况不同,不仅如此,同一菌株在不同碳源诱导下TrCBH I的糖基化修饰情况也不同。从菌株上来看,与T.reesei QM9414相比,纤维素酶高产菌株T.reesei RutC-30的糖基化更为多样化和复杂化,且同一位点上糖链的异质性较严重。而从诱导方式上来看,乳糖诱导下的TrCBH I的糖基化位点更丰富,糖链的形式更为多样。通过对纤维素酶高产菌株T.reese/RutC-30和纤维素酶低产菌株T.reesei QM9414在不同碳源诱导下的糖基化进行系统的研究,深入挖掘出更多糖基化修饰的位点和糖链,使人们对TrCBH I的糖基化了解的更全面,为后续对糖基化进行改造进而提高纤维素酶的水解活性奠定了坚实的理论基础。(本文来源于《山东大学》期刊2019-05-21）
孙宁宁[2]（2018）在《里氏木霉异源表达纤维二糖水解酶Te-Cel7A与系统分析蛋白酶Spt1功能》一文中研究指出里氏木霉(Trichoderma reesei)是目前生产纤维素酶的主要工业菌株,其分泌的纤维素酶系能够将木质纤维素水解为葡萄糖以供生物乙醇的生产。然而,在工业降解木质纤维素的过程通常需要纤维素酶具有耐热和高稳定性等特性。因此,在里氏木霉中表达热稳定纤维素酶是改良纤维素酶系的策略之一。此外,里氏木霉中的蛋白酶可能会对蛋白分泌表达产生影响,但目前对其认识仍不清晰。本论文一方面在里氏木霉中异源表达热稳定纤维素酶对里氏木霉酶系进行改良,另一方面研究里氏木霉液泡蛋白酶功能,然后利用液泡蛋白酶靶点深入改造热稳定纤维素酶异源表达的工程菌株,从而构建起纤维素酶系优化的里氏木霉工程菌。主要研究内容如下:(一)在里氏木霉中异源表达热稳定纤维二糖水解酶Te-Cel7A利用组成型强启动子Pcdna1和内源cbh1信号肽SP成功构建了Te-Cel7A的表达盒。表达盒转化里氏木霉QP4原生质体后筛选得到了一株纤维素水解能力强的转化子,命名为QTC14。在葡萄糖条件下QTC14能够分泌有活力的且酶成分单一的Te-Cel7A蛋白。对其酶学性质进行分析发现,Te-Cel7A的最适酶活温度为65℃,最适p H为5.0,与T.emersonii所分泌的天然Te-Cel7A的性质相似,说明在里氏木霉中可以异源表达热稳定纤维素酶。在产酶发酵条件下,里氏木霉QTC14的CBH酶活相较出发菌株QP4提高了28.8%,FPA酶活提高了65.2%。另外,QTC14总纤维素酶和CBH的热稳定性也高于出发菌株QP4。当QTC14的发酵酶液用于糖化不同木质纤维素底物时,QTC14对脱木素木糖渣和未脱木素木糖渣的糖化效率均高于出发菌株QP4。特别是糖化脱木素木糖渣时,QTC14的糖转化率为49.3%,与QP4的糖转化率相比提高了13.9%。这说明里氏木霉可以成功实现异源热稳定纤维素酶的表达,产生的重组纤维素酶系在生物质转化方面具有潜在的应用价值。(二)里氏木霉液泡丝氨酸蛋白酶Spt1的功能研究里氏木霉蛋白酶Spt1的蛋白序列分析发现,该蛋白酶属于枯草杆菌蛋白酶家族中的类枯草杆菌蛋白酶,具有前导肽,可能属于液泡蛋白。为探究里氏木霉Spt1的功能,我们分别构建了Spt1缺失菌株Δspt1及回补菌株Rspt1。结果显示,Spt1的缺失使得里氏木霉孢子产量显着降低,Spt1回补之后生孢性状恢复,说明Spt1参与了里氏木霉孢子的形成。同时,Δspt1在不同碳源上的生长速率不受影响,但是影响菌株对纤维素的降解能力。通过分析Δspt1和Rspt1的胞外纤维素酶活力发现,Δspt1的胞外蛋白分泌量、FPA、EG酶活、CBH酶活和BGL酶活均显着下降,而Spt1回补之后,纤维素酶活力得到恢复。上述结果说明,Spt1与里氏木霉纤维素酶的合成与分泌有关。为了确认Spt1是否位于液泡,进一步利用绿色荧光蛋白对Spt1进行细胞定位研究,结果表明里氏木霉丝氨酸蛋白酶Spt1位于液泡中。为了研究Spt1对纤维素酶系的改良作用,我们利用spt1自身启动子和组成型强启动子cdna1分别构建了Spt1过表达菌株SOE和SOD。通过分析SOE和SOD的纤维素酶活力进行发现,Spt1的过表达能够显着提高里氏木霉的纤维素酶的酶活。尤其利用组成型强启动子cdna1构建的Spt1过表达菌株SOD,与出发菌株QP4相比,其胞外蛋白量、FPA、EG酶活、CBH酶活和BGL酶活分别提高了65.9%、140%、48.8%、265%和260%。说明Spt1是改造里氏木霉酶系的有效靶点。(叁)在里氏木霉QTC14中过表达Spt1为构建纤维素酶系更加优良的里氏木霉工程菌,我们将Spt1在异源表达热稳定性Te-CBH1的里氏木霉工程菌QTC14中进行了过表达研究,成功构建了里氏木霉工程菌STC。通过分析STC和QTC14的纤维素酶活力发现,STC与QTC14相比,其胞外蛋白量、FPA、EG酶活、CBH酶活和BGL酶活分别增长了10%、10%、22%、15%、34%。这些结果表明,以液泡蛋白酶Spt1为靶点,可以实现对里氏木霉工程菌株的进一步改良,提升纤维素酶分泌水平及纤维素酶系活力,从而有助于降低纤维素酶生产成本并促进生物乙醇工业发展。(本文来源于《山东师范大学》期刊2018-05-30）
黄厚厚[3]（2018）在《纤维二糖水解酶TrCe16A产物排出过程的研究》一文中研究指出纤维素是由葡萄糖通过β-1,4-糖苷键紧密相连构成的大分子多糖。常温下,纤维素不易溶于有机溶剂和水溶液,是植物细胞壁的主要成分,也是自然界中储量最多的一种多糖。由于构成纤维素的分子之间存在着很强的相互作用力,因而在一般条件下纤维素在自然界中很难被分解。纤维素酶是一类可以通过相互协同作用将纤维素降解为葡萄糖的酶的总称。纤维素酶总体上可以分为叁大类:内切葡聚糖酶(EG)、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。内切葡聚糖酶可以作用在纤维素分子内部的非结晶区。它能够在分子内部任意切断β-1,4-糖苷键,从而生成很多具有非还原末端的小分子纤维寡糖。外切葡聚糖酶可以附着在纤维寡糖的还原或非还原末端,随后将其进一步水解为纤维二糖。最后,纤维二糖被β-1,4-葡萄糖苷酶转化为葡萄糖。在纤维素酶的所有家族中,纤维素酶6家族占据着十分重要的地位。在纤维素酶6家族中,纤维二糖水解酶TrCe16A是一种重要的外切葡聚糖酶。在TrCe16A中,它通过Inverting水解机理将纤维低聚糖水解为纤维二糖。在这个重要的纤维二糖水解酶中,人们普遍认为存在6个结合位点,即-2到+4结合位点。但是在纤维素酶6家族同源的纤维二糖水解酶HiCe16A和CtCe16A中,实验中得到了底物占据-3和-4结合位点的结晶(PDB 1OCB和4A05)。在这两个晶体结构中,一个关键的特点就是Tyr104残基旋转了大约120°后打开了-3结合位点。通过基因序列以及结构的相似性,我们猜测在TrCe16A中可能也存在-3和-4位置。为了验证我们的猜测,我们使用了常规动力学模拟方法分别探究了产物水解前和水解后的不同的稳定构象。结果表明,当底物是没有发生水解的纤维六糖时,Tyr103在整个模拟过程中不会发生旋转。当底物是纤维六糖水解断开后形成的纤维四糖和纤维二糖时,Tyr103残基在模拟过程中会发生一定的旋转,从而导致水解后的稳定构象中会有两种不同的Tyr103构象。在其中一种稳定构象中,Tyr103残基旋转了大约110°后打开了-3底物结合位置。在本文中,我们对Tyr103旋转的原因进行了探究。随后,我们使用了拉伸分子动力学分别以这两种不同的Tyr103的稳定结构为初始构象进行了3个不同方向的产物排出过程的分子动力学模拟。拉伸分子动力学的模拟结果表明,当沿着方向1,即当Tyr103不发生旋转时,它的整个产物排出过程的所需的能量为22.3 Kcal mol~(-1)。而当Tyr103发生旋转后,它会在一定程度上扩大出口通道。为了确定Tyr103残基的作用,我们首先选择了与方向1相似的方向进行拉伸分子动力学模拟,我们称其为方向2。拉伸分子动力学的结果表明,沿着方向2的产物排出所需的能量10.3 Kcal mol~(-1)。另外,由于Tyr103旋转打开了-3结合位点,我们选择了沿着Tyr103旋转后打开的方向进行拉伸分子动力学模拟,我们称其为方向3。拉伸分子动力学的结果表明,沿着方向3的产物排出过程所需的能量14.4 Kcal mol~(-1)。通过对叁组不同状态的产物排出过程所需的能量对比,我们发现沿着方向2所需的能量最低。此外,相比于Tyr103不发生旋转,当Tyr103发生旋转后,它能够很大的程度上降低产物排出所需要的能量。因此,我们认为Tyr103旋转过程是产物排出的一个重要过程。它能够帮助降低产物排出所需的能量。这将对我们进一步提高水解效率提供理论上的帮助。(本文来源于《吉林大学》期刊2018-03-01）
孙逊,钱梦丹,张浩,王嵩[4]（2016）在《分子动力学模拟方法对过程性纤维二糖水解酶Cel7A中的“选择性供水机制”的研究》一文中研究指出纤维素是高等植物细胞壁的主要成分,是自然界中数量最大的可再生性的碳水化合物。对其合理利用开发最关键的问题是具有很高化学稳定性的纤维素的降解,其中最高效的方法是使用纤维素酶。文章对一种过程性纤维素二糖水解酶Cel7A进行分子动力学模拟,提出一种新型的选择性供水机制,即通过间隔供水使水解产物是纤维二糖而不是单糖。在该机制中,His225,Glu209和Asp211共同构成供水控制开关。此外,还通过MM/PBSA自由能计算分析了水解过程中底物周围的残基与底物之间相互作用,其中氢键作用主要与酶中特定底物结合位置相关,而Trp38,Trp40,Trp371和Trp380等疏水残基,不仅降低底物滑动势垒,而且其疏水作用同时也阻止了外部的水分子通过水控制开关以外的空隙进入到水解位置。结合之前我们发现Cel48F中也存在类似的"选择性供水机制",可以猜测该机制很可能普遍存在于过程性纤维二糖水解酶中。(本文来源于《中国化学会第30届学术年会摘要集-第十九分会：化学中的量子与经典动力学》期刊2016-07-01）
王翠艳,王玉华,朴春红,刘俊梅,胡耀辉[5]（2016）在《绿色木霉纤维二糖水解酶基因的克隆及其在乳酸菌中的表达与鉴定》一文中研究指出采用乳酸菌表达系统进行绿色木霉纤维二糖水解酶基因cbhⅡ的表达研究。参照Gen Bank上发表的绿色木霉(Trichoderma viride)cbhⅡ基因(Gen Bank登录号:M55080)设计引物并通过聚合酶链式反应克隆获得其c DNA序列长1 441 bp。为了达到表达分泌该酶的目的,在其基因上游序列前添加了大小为80 bp的信号肽序列。进一步通过生物信息学方法将密码子按照乳酸菌的偏好性进行了优化,通过全基因合成获得了优化后的cbhⅡ基因。将该基因与穿梭表达载体p MG36e连接,构建原核表达载体p MG36e-S-cbhⅡ;利用电转化方法将其转入乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞中构建重组乳酸菌,纯化的重组菌蛋白通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,得到一条约为53 k D的目的蛋白条带,与预期大小相符;利用3,5-二硝基水杨酸法测定培养基上清液中水解纤维素酶的活力达到16.7 U/m L,菌体裂解液上清液和菌体沉淀几乎没有酶活力。结果表明,纤维二糖水解酶基因信号肽序列被乳酸乳球菌正确识别,并成功实现了胞外表达。(本文来源于《食品科学》期刊2016年19期）
王翠艳[6]（2016）在《高表达纤维二糖水解酶Ⅱ工程菌构建及其发酵豆渣理化特性研究》一文中研究指出大豆副产品—豆渣是非常优秀的植物蛋白碳水化合物原料,其中纤维素含量高达52%左右,并且含有多种营养成分。将豆渣水解将提高其利用率,本研究通过生物技术手段构建了能水解豆渣的工程菌,该工程菌为豆渣中可溶性膳食纤维、低聚糖及大豆异黄酮的产率提高奠定基础,为提高豆渣附加值提供了新途径。提高豆渣中可溶性物质含量关键在于提高其纤维素的利用率,而纤维素酶纤维二糖水解酶在纤维素酶系中至关重要,它是唯一可以水解纤维素结晶区的酶组分。因此,本研究构建了过表达纤维二糖水解酶的重组乳酸菌工程菌,并采用该菌株对豆渣进行了发酵,同时对其发酵豆渣的理化成分进行了分析研究。参照GenBank上发表的绿色木霉(T.reesei)CBH II基因(GenBank登录号:M55080)设计引物并通过PCR方法克隆得到其cDNA序列长1440 bp,进一步通过生物信息学方法按照乳酸菌的偏好性进行了优化后,通过全基因合成获得了优化后的CBH II基因;将该基因与穿梭表达载体pMG36e连接,得到重组表达载体pMG36e-CBH II,然后采用大肠杆菌表达系统进行绿色木霉纤维二糖水解酶CBH II基因的表达特性研究:将构建pMG36e-CBH II载体利用热击的方法导入BL21大肠杆菌感受态细胞中得到重组大肠杆菌,培养重组菌提取蛋白,通过SDS-PAGE电泳检测,在约为53 kD处得到一条符合预期的目的蛋白条带。采用DNS法测定菌体超声破碎后的菌体裂解液上清的酶活性,测得在培养16 h,酶活最大为16.4 U/mL,裂解液菌体沉淀几乎没有酶活,结果表明,纤维二糖水解酶基因CBH II在大肠杆菌中成功获得表达。本文进一步采用乳酸乳球菌表达系统进行绿色木霉的纤维二糖水解酶CBH II基因的表达研究,为了达到分泌表达的目的在该基因上游序列前添加了大小为81 bp的信号肽,进一步通过生物信息学方法按照乳酸菌的偏好性进行了优化后,通过全基因合成获得了优化后的CBH II基因,将该基因与pMG36e穿梭表达载体连接,构建pMG36e-S-CBH II表达载体,利用电转化方法将其转入乳酸乳球菌NZ3900感受态细胞中构建重组乳酸乳球菌,提取的重组菌蛋白通过SDS-PAGE电泳检测,在约为53 kD处得到一条符合预期的目的蛋白条带。利用DNS法测定其重组离心菌体上清中纤维素酶活性大小,测得当重组菌培养到20 h时,在最适宜温度和pH分别为50℃、5的条件下,酶活力达到16.7 U/mL,菌体裂解液上清和菌体裂解沉淀几乎没有酶活。因此,研究结果表明,纤维二糖水解酶基因信号肽序列被乳酸乳球菌正确识别,并成功实现了胞外表达,这对进一步的实验研究奠定了基础。又利用乳酸菌工程菌在30℃,自然pH条件下发酵豆渣,对发酵豆渣进行水溶性物质测定,利用SPSS 21.0统计分析软件对数据进行分析,采用独立样本t检验对重组菌发酵后豆渣及未经重组菌发酵豆渣的水溶性物质含量进行分析结果表明差异显着(P<0.05)。分析结果显示可溶性物质中粗脂肪增加了17.43%,总氨基酸增加了1225%,可溶性总糖增加63.9%,可溶性膳食纤维增加了138.05%。因此试验结果表明,构建的乳酸乳球菌工程菌可以达到发酵豆渣并提高其可溶性物质含量的目的。(本文来源于《吉林农业大学》期刊2016-04-01）
李叶[7]（2015）在《草酸青霉纤维二糖水解酶基因cbhI的克隆及表达》一文中研究指出纤维素是自然界中含量十分丰富的有机物,其完全降解过程需要几种酶的共同参与、协调配合。纤维素酶具有催化效率高、安全性好等优点,在纺织、洗涤、动物饲料添加剂等方面应用广泛。本实验室选育的纤维素酶产生菌草酸青霉(Penicillium oxalicum)X10-279,遗传性状稳定,滤纸酶活为16.70 IU/m L。在纤维素酶的共同参与下,纤维素降解生成葡萄糖,纤维二糖水解酶(CBH?)是纤维素酶系中唯一可以作用于结晶纤维素的组分,在纤维素降解过程中起重要作用。本研究克隆并在大肠杆菌中表达草酸青霉X10-279纤维二糖水解酶基因cbh?,希望能够获得高纤维素活性的重组菌,从而提高纤维素的降解效率。根据Gen Bank中已发表的青霉属来源的纤维二糖水解酶基因cbh?,分别设计含有Eco R?和Not?限制性酶切位点的正向引物和反向引物。以草酸青霉X10-279基因组DNA为模板,进行PCR,将回收得到的PCR产物与克隆载体p MD18-T连接,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)Top 10感受态细胞中,将重组菌进行测序,重组质粒命名为p MD18-T-cbh?。生物信息学分析表明:克隆得到的X10-279纤维二糖水解酶基因cbh?(Gen Bank,获得基因登录号KR269867,蛋白登录号AKI32221)全长1632 bp,无内含子,编码543个氨基酸和一个终止密码子。与斜卧青霉(Penicillium decumbens)CBH?(Gen Bank登陆号ACV95805)的同源性最高,氨基酸序列同源性达98.70%。蛋白理论分子量为56.66 k D,理论等电点为4.79,属于糖基化水解酶第7家族。重组质粒p MD 18-T-cbh?双酶切获得的cbh?与表达载体p ET-28a(+)连接,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,成功构建了重组菌p ET-28a(+)-cbh?/BL21。目的蛋白在宿主中实现了大量表达,但主要以包涵体的形式存在。对诱导条件进行优化,确定最佳诱导条件为:当OD600达到0.3~0.4时,加入IPTG至终浓度为0.8 mmol/L,在37℃诱导5 h,目的蛋白的表达量达到15.14 mg/L,比优化前提高了50.49%。利用Ni柱对包涵体进行纯化,纯化后蛋白的表达量为3.29μg/m L,收率为21.35%。对目的蛋白进行复性,复性后蛋白的p NPC酶活为10.3 U/L,比活力为94.3 U/mg,最适p H为5.0,最适温度为55℃,且具有较好的温度适应性。(本文来源于《河北大学》期刊2015-06-01）
陈小玲,张穗生,黄俊,雷富,陈东[8]（2014）在《里氏木霉纤维二糖水解酶基因cbh1的分子改造》一文中研究指出【目的】用分子改造的方法改造里氏木霉(Trichoderma reesei)的纤维二糖水解酶基因cbh1,提高其纤维素酶活力,为工业化生产纤维素酶提供参考。【方法】用DNase I消化里氏木霉cbh1,回收100 bp左右的片段后用T4 DNA连接酶连接,以连接产物作为模板进行PCR扩增,将PCR改造的cbh1基因转化里氏木霉原生质体,使改造的cbh1基因与里氏木霉原有的cbh1基因发生同源重组。通过比较滤纸酶活力的方法筛选纤维素酶活力提高的突变菌株,在NCBI上比对分析突变菌株的cbh1序列。【结果】经克隆测序获得基因片段大小为637 bp,与里氏木霉同属菌株cbh1基因的相似性在88%~98%,确定为里氏木霉cbh1的基因片段。经DNase I消化15 min、T4 DNA连接酶连接、经PCR扩增获得改造后的cbh1基因。将改造cbh1基因片段转化里氏木霉原生质体,得到cbh1基因突变体库。从cbh1基因突变体库中筛选获得1株纤维素酶滤纸酶活比出发菌株高1.7518倍的突变菌株E2-1。序列比对分析发现,与出发菌株相比,突变菌株E2-1的cbh1基因有14个碱基发生了突变,其中5个碱基为置换突变,8个碱基为缺失突变,1个碱基为插入突变,分布于cbh1基因的9个位置。【结论】改造后的cbhl基因能与里氏木霉的染色体DNA发生同源重组,进而提高突变菌株的纤维素滤纸酶活力。(本文来源于《南方农业学报》期刊2014年10期）
方浩[9]（2014）在《里氏木霉纤维二糖水解酶II基因的克隆与表达》一文中研究指出纤维二糖水解酶是能够高效降解木质纤维素的里氏木霉纤维素酶的重要组分之一,是纤维素酶催化水解结晶区纤维素的关键。本文从里氏木霉(Trichoderma reesei) ZU-02中克隆出了cbh2基因,并研究其在大肠杆菌、毕赤酵母、里氏木霉中的表达。采用反转录PCR获得里氏木霉cbh2基因,用其构建重组载体,转入大肠杆菌。IPTG诱导产酶结果表明：里氏木霉cbh2基因已在大肠杆菌中成功实现胞内表达。分别采用里氏木霉cbh2基因和经过密码子优化的cbh2s基因构建重组载体,并在毕赤酵母中进行表达。筛选获得2株优良转化子,分别包含cbh2 (PC-1)和cbh2s (PC-2).发酵液SDS-PAGE结果显示在约58 kDa处有单一明显条带,为重组CBH Ⅱ,即cbh2基因在毕赤酵母中的表达产物,其中包含了约5 kDa的糖基化。对转化子PC-1和PC-2的产酶性能进行了比较实验,诱导发酵96h,PC-2的纤维二糖水解酶活力是PC-1的2.02倍,PC-2的可溶性蛋白是PC-1的1.66倍。研究结果表明：密码子优化策略促进了里氏木霉cbh2基因在毕赤酵母中的异源表达。研究了重组毕赤酵母所产CBH Ⅱ的最适pH与最适温度,分别是5.0和50℃。模拟了CBH Ⅱ的CBD和CD区域的叁维模型。为了提高里氏木霉纤维素酶的协同降解能力,将cbh2基因置于里氏木霉的强启动子Pcbh1及其信号肽下游,并进一步以pCAMBIA1300为载体骨架,构建成含潮霉素B抗性标记的重组质粒pCAMBIA1300-hph-PsCT。采用根瘤农杆菌介导转化技术将重组质粒转入里氏木霉宿主细胞。优化了影响农杆菌介导里氏木霉转化的诸因素,使得转化率大幅提高。针对筛选里氏木霉高产纤维二糖水解酶转化子的特殊要求,采用潮霉素抗性筛选与菌落在微晶纤维素平板上的生长速率筛选相结合的两步法筛选,从326个里氏木霉转化子中筛选出10个优良转化子。对重组里氏木霉转化子(C10)的产酶性能进行了研究,采用优化后的培养基和产酶条件。摇瓶条件下发酵120 h,重组里氏木霉的内切葡聚糖酶活力和纤维二糖酶活力与初始菌株相比没有明显变化,但其纤维二糖水解酶活力为122.44 U／mL,是初始菌株的5.4倍。由于重组里氏木霉纤维素酶系组成中纤维二糖水解酶活力明显提高,其纤维素酶总活力(滤纸酶活力)也提高到初始菌株的4.3倍。对重组纤维素酶在木质纤维素降解中的应用性能进行了研究。以初始菌株ZU-02纤维素酶为参照,在同等条件下,重组纤维素酶对玉米秸秆的酶解得率高达93.8%,而ZU-02纤维素酶的酶解得率为81.1%。本文的研究成果对于纤维素酶的定向进化以及纤维素资源的转化与利用具有重要的促进作用。(本文来源于《浙江大学》期刊2014-10-01）
方浩,夏黎明[10]（2014）在《里氏木霉纤维二糖水解酶Ⅱ基因的高表达》一文中研究指出纤维二糖水解酶II(CBH II)是纤维素酶的重要组分之一,对纤维素酶的水解性能有着重大影响,而里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶制剂中纤维二糖水解酶II明显不足,为了优化其酶系结构,采用了基因重组技术构建CBH II高产菌株:将里氏木霉CBH II基因置于里氏木霉强启动子Pcbh1(及其信号肽)和终止子Tcbh1之间,并进一步以pCAMBIA1300为载体骨架,构建成含潮霉素B抗性标记的重组质粒pCAMBIA1300-hph-PsCT。以里氏木霉ZU-02为宿主,采用根瘤农杆菌介导转化技术将重组质粒转入宿主分生孢子。以潮霉素B为抗性标记初筛到324个阳性转化子,进一步通过复筛,在以微晶纤维素为唯一碳源的筛选培养基上获得8个生长较快的优良转化子。在摇瓶条件下,分别对8个转化子进行产酶试验,培养48 h时,纤维二糖水解酶活力最高可达18.24 U·mL-1,是出发菌株的2.51倍。本结果对于里氏木霉纤维素酶的定向进化、提高其对纤维素的协同糖化效率具有重要意义。(本文来源于《高校化学工程学报》期刊2014年04期）
纤维二糖水解酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
里氏木霉(Trichoderma reesei)是目前生产纤维素酶的主要工业菌株,其分泌的纤维素酶系能够将木质纤维素水解为葡萄糖以供生物乙醇的生产。然而,在工业降解木质纤维素的过程通常需要纤维素酶具有耐热和高稳定性等特性。因此,在里氏木霉中表达热稳定纤维素酶是改良纤维素酶系的策略之一。此外,里氏木霉中的蛋白酶可能会对蛋白分泌表达产生影响,但目前对其认识仍不清晰。本论文一方面在里氏木霉中异源表达热稳定纤维素酶对里氏木霉酶系进行改良,另一方面研究里氏木霉液泡蛋白酶功能,然后利用液泡蛋白酶靶点深入改造热稳定纤维素酶异源表达的工程菌株,从而构建起纤维素酶系优化的里氏木霉工程菌。主要研究内容如下:(一)在里氏木霉中异源表达热稳定纤维二糖水解酶Te-Cel7A利用组成型强启动子Pcdna1和内源cbh1信号肽SP成功构建了Te-Cel7A的表达盒。表达盒转化里氏木霉QP4原生质体后筛选得到了一株纤维素水解能力强的转化子,命名为QTC14。在葡萄糖条件下QTC14能够分泌有活力的且酶成分单一的Te-Cel7A蛋白。对其酶学性质进行分析发现,Te-Cel7A的最适酶活温度为65℃,最适p H为5.0,与T.emersonii所分泌的天然Te-Cel7A的性质相似,说明在里氏木霉中可以异源表达热稳定纤维素酶。在产酶发酵条件下,里氏木霉QTC14的CBH酶活相较出发菌株QP4提高了28.8%,FPA酶活提高了65.2%。另外,QTC14总纤维素酶和CBH的热稳定性也高于出发菌株QP4。当QTC14的发酵酶液用于糖化不同木质纤维素底物时,QTC14对脱木素木糖渣和未脱木素木糖渣的糖化效率均高于出发菌株QP4。特别是糖化脱木素木糖渣时,QTC14的糖转化率为49.3%,与QP4的糖转化率相比提高了13.9%。这说明里氏木霉可以成功实现异源热稳定纤维素酶的表达,产生的重组纤维素酶系在生物质转化方面具有潜在的应用价值。(二)里氏木霉液泡丝氨酸蛋白酶Spt1的功能研究里氏木霉蛋白酶Spt1的蛋白序列分析发现,该蛋白酶属于枯草杆菌蛋白酶家族中的类枯草杆菌蛋白酶,具有前导肽,可能属于液泡蛋白。为探究里氏木霉Spt1的功能,我们分别构建了Spt1缺失菌株Δspt1及回补菌株Rspt1。结果显示,Spt1的缺失使得里氏木霉孢子产量显着降低,Spt1回补之后生孢性状恢复,说明Spt1参与了里氏木霉孢子的形成。同时,Δspt1在不同碳源上的生长速率不受影响,但是影响菌株对纤维素的降解能力。通过分析Δspt1和Rspt1的胞外纤维素酶活力发现,Δspt1的胞外蛋白分泌量、FPA、EG酶活、CBH酶活和BGL酶活均显着下降,而Spt1回补之后,纤维素酶活力得到恢复。上述结果说明,Spt1与里氏木霉纤维素酶的合成与分泌有关。为了确认Spt1是否位于液泡,进一步利用绿色荧光蛋白对Spt1进行细胞定位研究,结果表明里氏木霉丝氨酸蛋白酶Spt1位于液泡中。为了研究Spt1对纤维素酶系的改良作用,我们利用spt1自身启动子和组成型强启动子cdna1分别构建了Spt1过表达菌株SOE和SOD。通过分析SOE和SOD的纤维素酶活力进行发现,Spt1的过表达能够显着提高里氏木霉的纤维素酶的酶活。尤其利用组成型强启动子cdna1构建的Spt1过表达菌株SOD,与出发菌株QP4相比,其胞外蛋白量、FPA、EG酶活、CBH酶活和BGL酶活分别提高了65.9%、140%、48.8%、265%和260%。说明Spt1是改造里氏木霉酶系的有效靶点。(叁)在里氏木霉QTC14中过表达Spt1为构建纤维素酶系更加优良的里氏木霉工程菌,我们将Spt1在异源表达热稳定性Te-CBH1的里氏木霉工程菌QTC14中进行了过表达研究,成功构建了里氏木霉工程菌STC。通过分析STC和QTC14的纤维素酶活力发现,STC与QTC14相比,其胞外蛋白量、FPA、EG酶活、CBH酶活和BGL酶活分别增长了10%、10%、22%、15%、34%。这些结果表明,以液泡蛋白酶Spt1为靶点,可以实现对里氏木霉工程菌株的进一步改良,提升纤维素酶分泌水平及纤维素酶系活力,从而有助于降低纤维素酶生产成本并促进生物乙醇工业发展。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
纤维二糖水解酶论文参考文献
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