导读:本文包含了管球反馈论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:糖尿病肾病,小管间质损伤,腺苷1型受体,蛋白尿
管球反馈论文文献综述
田东丽[1]（2019）在《腺苷1型受体在糖尿病肾病小管间质损伤中不依赖于管球反馈的机制初探》一文中研究指出研究背景糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)作为糖尿病最常见的微血管并发症之一,是导致终末期肾病(End Stage Renal Disease,ESRD)的重要原因。越来越多的证据显示肾小管间质病变是DN发生发展的独立危险因素。因此,研究糖尿病时肾小管、肾小管周毛细血管(Peritubular Capillary,PTC)及间质微环境改变的机制和效应,有助于寻找治疗DN新的干预位点。腺苷1型受体(A1 Adenosine Receptor,A1AR)在肾脏广泛表达,因其在肾脏管球反馈(Tubulo-glomerular Feedback,TGF)中的重要调控作用而受到广泛关注,我们前期研究观察到DN时,A1AR基因敲除,加重DN但与TGF无关。而在造影剂肾病和缺血再灌注动物模型中,观察到A1AR存在不依赖于管球反馈的肾脏保护作用,DN时是否存在相似的情况,具体机制并不清楚。研究目的本研究将通过DN患者、A1AR基因敲除(A1AR-/-)DN小鼠动物模型和体外细胞实验,从组织器官、细胞和分子水平观察A1AR缺失对于DN肾小管周微环境(肾小管、间质和肾小管周毛细血管)非依赖于管球反馈的损伤机制,了解激活A1AR对蛋白尿发生和肾脏纤维化机制的保护作用。1.建立A1AR缺失DN小鼠动物模型,通过肾脏mRNA基因芯片谱检测筛选差异表达基因,寻找A1AR参与DN发展的可能分子调节通路;2.在DN患者、小鼠模型中观察A1AR缺失加重肾小管周微环境损伤,保护刷状缘转运蛋白Megalin破坏和小管间质纤维化的可能机制;3.体外细胞培养验证A1AR对高糖环境下近端小管上皮细胞损伤的保护作用;进而为DN防治提供新的思路和潜在的干预位点;4.观察A1AR在DN水盐代谢相关高血压中的调节作用及可能机制。研究方法第一部分 DN模型的确立及A1AR参与DN的分子通路初筛1.纳入肾活检证实为糖尿病肾病患者,年龄性别匹配的肾小球轻微病变作为对照组,分析其临床病理特点,收集患者尿液提取外泌体进行形态、粒径及标志物的鉴定,免疫印迹法检测尿外泌体中A1AR及SGLT2蛋白;免疫荧光染色确定A1AR在DN患者肾脏的表达部位,免疫组化及半定量分析评估DN患者和动物A1AR与对照组的表达差异。2.分别在C57/BL野生型及管球反馈缺失的A1AR-/-小鼠中,通过腹腔注射链脲佐菌素120mg/kg建立1型DM动物模型,选择不同时间点,血糖试纸检测血糖、代谢笼留取24h尿标本、尾夹法监测血压;观察体重、血糖及尿量的变化,检测尿白蛋白水平;常规病理染色及透射电镜观察野生型及A1AR缺失DM小鼠肾脏小球、小管、血管及间质损伤,评估DN模型的建立。3.将野生型对照组、野生型糖尿病肾病组,A1AR-/-对照组与A1AR-/-糖尿病肾病组四组肾皮质组织,提取RNA进行mRNA基因芯片谱测序,筛选差异基因进行KEGG通路聚类分析,寻找A1AR参与DN损伤的可能分子通路。第二部分 A1AR在糖尿病肾病小管周微环境稳态中的保护作用1.透射电镜观察DN小鼠肾间质血管与周细胞的位置关系,免疫荧光染色观察DN患者血管内皮细胞(CD34)、周细胞(PDGFRβ)及A1AR表达的位置关系;免疫组化染色评估肾小管管周毛细血管与周细胞损伤;免疫印迹法评估周龄野生型和A1AR-/-DN小鼠肾皮质A1AR及A2AR的蛋白表达差异。观察A1AR缺失对PTC及细胞紧密连接蛋白表达的影响,免疫组化染色半定量分析周细胞PDGFRβ、淋巴管podoplanin与炎症巨噬细胞(F4/80)的关系。2.光镜和电镜观察DN患者和小鼠病理特点,利用免疫荧光染色对DN患者中A1AR与Megalin位置关系进行定位,观察DN患者和动物近端小管Megalin与cubilin损伤与蛋白尿的关系;评估A1AR缺失对该病变的影响;3.常规病理染色评估DN小鼠肾脏纤维化及细胞外基质沉积,利用免疫荧光双观察DN患者肾脏A1AR与胶原蛋白I的位置关系;免疫印迹法检测A1AR缺失对Caspase1/IL18焦亡及NLRP3/IL1β炎症小体信号通路蛋白的表达水平的影响,肾小管间质促纤维化因子TGFβ及胶原蛋白(I/III/IV)的表达量变化,评估A1AR缺失DN小管间质炎症反应及纤维化的作用。第叁部分 A1AR对高糖环境中近端小管上皮细胞损伤的保护机制1.DMEM/F12培养基体外培养人近端小管上皮细胞系,至细胞80-90%融合时,倒置显微镜观察其形态学特征,免疫荧光常规行细胞鉴定(CK18,Megalin);2.高糖、等渗甘露醇和低糖分别与细胞共培养24h,免疫荧光检测NLRP3,Caspase1/ICollagen1表达水平,评估高糖环境对近端小管上皮细胞的损伤作用。L18表达,评估近端小管上皮细胞炎症反应。72h收集细胞裂解液提取蛋白,western blot检测小管上皮细胞标志物Megalin、紧密连接蛋白Occludin、巨噬细胞分泌的炎症因子蛋白NLRP3/IL18、促纤维化因子TGFβ及胶原蛋白3.加入不同浓度的A1AR激动剂(CCPA)或A1AR抑制剂(DPCPX)与细胞共孵育,CCK-8及LDH释放试验方法分别检测二者细胞增殖与毒性,选择合适的浓度与高糖培养的细胞共孵育,Western blot检测CCPA与DPCPX对近端小管上皮细胞紧密连接蛋白(Occludin)、炎症因子(NLRP3/Caspase1/IL18)及胶原蛋白Collagen1水平的变化。第四部分 A1AR在DN水盐代谢异常相关高血压中的调节作用1.观察记录DN患者及小鼠中血压变化情况,免疫荧光染色确定DN患者中调节水盐平衡转运子及调节激酶SGK1的表达部位(SGK1NCCNKCC2SGLT2),免疫组化染色及半定量分析评估DN患者及小鼠肾脏各水钠转运子在DN中的表达情况;2.DN小鼠动物模型中观察A1AR-/-对血压的影响,免疫组化染色及免疫印迹法评估 A1AR 缺失对水盐转运子调节酶 SGK1及各转运子(NCCNKCC2SGLT2rENac)表达的影响。统计方法采用SPSS 14.0软件进行统计分析(SPSS,Chicago,IL),符合正态分布的计量资料以均值±标准差表示。两组间比较采用t检验,自身前后比较采用配对t检验;叁组或以上比较使用单因素或多因素变量分析,采用双侧检验的方法,P<0.05为有统计学意义。研究结果第一部分 DN模型的确立及A1AR参与DN的分子通路初筛1.本研究纳入13例DN患者,平均24h尿蛋白定量5.7±3.8g,平均血肌酐129.6±61.2umol/L,DN典型肾脏病理表现为肾小球及小管基底膜弥漫性增厚,K-W结节形成,血管壁增厚伴玻璃样变,小管间质局灶性炎细胞浸润及纤维化。成功提取尿液外泌体,电镜下呈典型双膜结构、平均直径100nm(质谱法),western blot法出检测到外泌体标志性蛋白TSG101,及小管标志物SGLT2、A1AR及NCC,提示尿液外泌体可以检测到肾小管上转运子损伤。免疫荧光观察到A1AR染色主要表达于近端小管上皮细胞。与GML组相比,DN患者肾小管A1AR表达增加约1.38倍。2.链脲佐菌素注射3天后检测到野生型及A1AR-/-小鼠实验组血糖显着升高,大于16.7mmol/L,持续16周,伴有多饮多食多尿,达到DM诊断标准。肾脏重量显着增加伴体重下降,24h尿白蛋白排泄率增加(129.4±12.2比16.7±2.5 μg/d,P<0.001),光镜及透射电镜可观察到肾小球与小管肥大、基底膜的显着增厚,血管壁增厚与小管间质纤维化,符合DN的特点。且A1AR-/-DN组较野生型WT-DN 组蛋白尿更多(183.8±9.7 比 129.4±12.2μg/d,P<0.001);3.WT-Control,WT-DN,A1AR-/--Control 与 KO-DN 四组小鼠肾皮质组织 mRNA基因芯片谱测序及差异基因KEGG通路富集分析结果提示:A1AR参与DN损伤主要分子机制涉及“细胞因子通路、蛋白内吞通路与细胞外基质沉积”;第二部分 A1AR在糖尿病肾病小管周微环境稳态中的保护作用1.免疫荧光共染提示周细胞标志物PDGFRβ表达在微血管内皮细胞(CD34阳性)外侧,在DN患者及小鼠动物模型中观察到周细胞与血管内皮细胞的分离,PDGFRβ表达增加(24.5±0.6%比13.2±0.5%),伴有细胞紧密连接蛋白Occludin及CD34表达下降(20.4±0.3%比27.6±0.2%)。肾小管间质可见炎症巨噬细胞浸润,提示糖尿病小管周微环境稳态破坏;2.A1AR在近端小管、血管内皮细胞及间质炎症细胞上均有表达,DN小鼠肾脏A1AR表达为对照组的1.38倍(P<0.05)。A1AR-/-DN小鼠肾脏CD34缺失和紧密连接损害较 WT-DN 更重(CD34:0.3±0.03 比 0.6±0.08 比 1.0±0.05,P<0.001;Occludin:0.4±0.06 比 0.7±0.04 比 1.0±0.03,P=009);3.免疫荧光结果提示近端小管上皮细胞上A1AR与megalin共表达,透射电镜观察到随着周龄的增加,DN小鼠近端小管刷状缘侧微绒毛结构缺失。在DN患者和小鼠中观察到megalin-cubilin损伤,与蛋白尿呈负性相关(DN患者r=-0.862,P=0002;DN小鼠r=-0.927,P<0.001),损伤程度随周龄增加而进一步加重。同样A1AR缺失进一步加重DN小鼠megalin-cubilin损伤及蛋白尿;4.光镜和电镜下可观察发现WT-DN小鼠肾小管间质大量细胞外基质沉积和微丝状结构,免疫组化TGFβ1与Collagen(I,III,IV)染色证实其胶原成分。western-blot检测到焦亡相关Caspase1/IL18表达量增加;A1AR-/--DN小鼠中Caspase1/IL18 蛋白表达量进一步增加(1.52±0.6 比 1.24±0.3 比 1.0±0.2,P=0.017;1.51±0.3 比 1.3±0.2 比 1.0±0.2,P=0.018),小管间质纤维化也进一步加重。第叁部分 A1AR对高糖环境中近端小管上皮细胞损伤的保护机制1.倒置显微镜下单个近端小管上皮为多边形或椭圆形,融合后呈鹅卵石样铺路石状,免疫荧光染色可检测到细胞CK18及megalin均呈阳性,提示所培养细胞为肾脏近端小管上皮细胞;2.高糖共培养24h后,免疫荧光染色可观察到巨噬细胞标志物CD68和NLRP3/Caspase1/IL18表达。高糖共培养72h,免疫印迹检测提示高糖组A1AR表达为对照组的1.8倍,相同渗透压的甘露醇并不增加A1AR表达。同时刷状缘Megalin(0.46±0.03 比 1.1±0.05,P=0.008)与紧密连接蛋白 Occludin(0.6±0.02 比 1.0±0.03,P=0.023)表达明显降低,而NLRP3/IL18分别为对照组的4倍与2.5倍,伴有TGFβ表达量增加2倍;3.根据细胞增殖、毒性试验结果,选择0.1ummol/L的CCPA(A1AR激动剂)与0.1umol/L的DPCPX(A1AR抑制剂)分别与小管上皮细胞共孵育24h,western blot法证实CCPA可明显抑制高糖环境诱导的炎症因子NLRP3(0.4±0.03比1.0±0.06,P=0.032);Caspase-1(0.6±0.02 比 1.0±0.01,P=0.007),IL 18(0.7 ± 0.05 vs 1.0±0.04,P=0.045)水平,上调胶原蛋白 Collagenl(0.6±0.02 比 1.0±0.02,P=0.024)的表达。与此相反,A1AR抑制剂DPCPX可进一步加重上述损伤。第四部分A1AR在DN水盐代谢异常相关高血压中的调节作用1.本研究纳入的DN患者及DN小鼠均伴有高血压的发生,免疫荧光显示DN患者中肾脏NCC、NKCC2、SGLT2与rENac均表达于肾小管刷状缘侧,免疫组化染色及半定量分析结果显示与GML组相比,DN组NKCC2(1.6±0.3比1.0±0.2,P<0.001)与 SGLT2(1.3±0.3 比 1.0±0.2,P=0.042)表达显着增加,伴有调节激酶SGK1表达增加(1.32±0.2比1.0±0.3,P=0.041),而NCC表达无明显差异;2.A1AR-/--DN 小鼠血压更重(127±9.4 比 118±6.0 比 106±8.5 mmmHg,P<0.001),免疫组化染色及western blot结果显示A1AR缺失加重NCC(38 ±4.5比20±2.0 比 10±0.6%,P<0.001)、NKCC2(36±5.2 比 20±2.3 比 16±0.8%,P<0.001)与 rENac(1.32±0.1 比 0.8±0.3 比 1.0±0.1,P=0.02)表达上调,而A1AR缺失后水盐转运子调节酶SGK1表达量无明显变化。结论本研究条件下1.A1AR在糖尿病肾小管、小管周毛细血管-周细胞及间质组成的肾小管周微环境稳态损伤中具有保护作用;2.A1AR缺失导致局部巨噬细胞浸润相关的炎症反应(Caspase1/IL18),加重肾小管megalin损伤相关蛋白尿,以及周细胞与血管内皮细胞分离诱导的小管间质纤维化;3.A1AR激动剂有助于改善该微环境稳态和炎症反应,减轻上述病理生理过程,与之相反A1AR抑制剂会进一步加重此损伤;4.DN及小鼠血压升高与肾脏水盐转运子表达异常相关,A1AR缺失小鼠血压更高,A1AR主要通过调节管球反馈参与水钠平衡及血压的调节,与SGK1无关。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2019-04-01）
彭晓艳[2]（2018）在《肾脏远端小管钠氯共转运子维持水盐血压平衡及参与管球反馈的机制初探》一文中研究指出背景与目的:机体维持水盐电解质和血压的平衡依赖于肾脏小球和小管结构的完整性和正常的管球反馈(tubuloglomerular feedback,TGF)。远端小管上的钠氯共转运子(NCC)是由SLC12A3基因编码的跨膜蛋白,它与近端小管髓攀升支粗段和致密斑的钠钾氯共转运子(NKCC2)、集合管的上皮钠通道(ENaC)共同组成了肾脏的水盐电解质平衡的重要防线,其中NKCC2和ENaC是致密斑和集合管管球反馈的重要感应子,而NCC与TGF的关系并不明确。SLC12A3基因失活突变导致NCC功能障碍即Gitelman综合征(GS),是一种罕见的失盐性肾病,是研究NCC功能的天然疾病模型,但相关病理生理机制的研究不多,缺乏评价临床严重程度、可指导治疗的生物标志物和功能影像学方法。本研究拟观察较大样本量的GS患者临床病理特点、生活质量和性别差异,比较NCC生理功能试验对GS的临床诊断价值;观察尿液PGE2及其代谢产物水平与临床的相关性,初步探索外泌体及功能核磁在GS中的应用价值。建立两种不同的盐敏感高血压小鼠模型:高盐-高醛固酮-低肾素模型(DS)和轻中度高尿酸导致的早期高血压模型(HUA),探索NCC在高血压发生和肾损害中可能的作用,并在腺苷1型受体基因敲除(A1AR-/-)的模型中探讨管球反馈与NCC的相关性。方法:第一部分:先天NCC功能障碍的GS患者临床特点及生物影像标志物探索1.纳入临床疑诊为失盐性肾病的患者,提取外周血DNA、PCR扩增后行SLC12A3基因测序进行基因诊断,作为诊断的金标准,采用氢氯噻嗪试验阻断NCC以评价其体内功能,分析比较该功能试验与经典的GS临床指标在诊断试验中的敏感性、特异性差异;2.搜集GS患者临床资料,观察患者血压和水盐代谢的特点;留取患者血浆和24h尿标本ELISA法测定PGE2及其代谢产物PGEM的水平,分析其与临床资料及NCC功能的相关性;采用SF-36量表分析其生活质量,并与性别年龄匹配的健康受试者比较。比较GS患者以上资料的性别差异。收集女性患者的妊娠资料,观察妊娠期间血电解质水平的变化及妊娠相关并发症。3.总结本中心肾活检的GS患者肾脏病理资料,免疫组化半定量分析肾脏皮质COX-2的表达与对照(肾小球轻微病变患者)的差异。提取尿液外泌体并进行形态、粒径和标志物的鉴定,免疫印迹法检测患者NCC、COX-2、COX-1蛋白表达水平。采用轴位IVIM(体内不相干运动成像)和DKI(弥散峰度成功能核磁)显像的方法,探索GS患者肾脏潜在的功能改变,分析其功能影像学参数与临床资料的相关性。第二部分:盐敏感高血压小鼠模型的建立及NCC相关生理的改变1.分别建立C57b1背景下的单肾切除-高盐-高醛固酮的盐敏感高血压(DS)小鼠模型(肾素抑制)和轻度高尿酸血症(HUA)诱导的早期盐敏感高血压(高肾素型)小鼠模型,尾夹法监测血压变化,观察血压及水盐代谢的变化;评价血压与饮食中盐含量的关系;病理染色观察肾脏病变特点、评价小管间质损害。2.在两种模型中分别检测肾组织3种钠离子转运通道(NCC/NKCC-2/γ ENaC)蛋白和mRNA水平。定量上游的调控激酶SGK-1的蛋白表达,检测炎症焦亡信号caspase-1/IL18/IL1 β及相关指标的异常。3.放免法观察调节血压和出球小动脉收缩的肾素、血管紧张素Ⅱ和醛固酮水平,免疫组化进行球旁器肾素定位,免疫印迹法观察与管球反馈和入球动脉舒缩功能相关的腺苷受体表达水平。第叁部分:NCC在管球反馈缺失后对血压和水盐代谢的可能作用1.在GS患者和非GS患者中进行速尿试验,计算试验前后的肌酐清除率以推测管球反馈的状态,比较GS患者和非GS患者肌酐清除率的变化,初步推测体内管球反馈的活化程度。2.在管球反馈缺失的A1AR-/-小鼠中,分别观察DS模型和HUA模型的血压及水盐代谢变化,评价肾脏病变特点;免疫印迹法检测3种钠离子转运蛋白(NCC/NKCC-2/γENaC)和炎症焦亡信号 caspase-1/IL18/IL1β 的水平;比较A1AR敲除后其他类型腺苷受体的变化。3.分离野生型和A1AR-/-小鼠肾小球的入球动脉,显微灌注观察不同尿酸水平对入球动脉的急性刺激作用;免疫组化半定量评估尿酸对野生型和A1AR-/-小鼠入球动脉的慢性重塑作用。结果:第一部分:先天NCC功能障碍GS患者临床特点及生物影像标志物1.105例低血钾患者检测到SLC12A3基因突变,共携带69种突变,平均血压为110.0±12.4/72.1±9.8mmHg,并伴有不同程度的肾素、血管紧张素Ⅱ、醛固酮活化;氢氯噻嗪实验提示患者NCC不同程度受损。以基因诊断为金标准,氢氯噻嗪功能试验的敏感性和特异性分别为93.1%和88.9%,曲线下面积为0.989(95%CI 0.961-1.000),均优于低血镁和低尿钙单个指标或联用的临床诊断价值;2.男性患者较女性发病早、血钾低、血压高、多尿更显着,但生活质量无差异。5例妊娠患者孕期前3月血钾水平较妊娠前显着下降,对症处理后,妊娠过程平稳、结局良好。男性尿PGE2及其代谢产物(PGEM)水平显着高于女性,且GS患者显着高于同性别的对照,并观察到升高的PGE2与更严重的NCC功能障碍(氢氯噻嗪试验)、代谢性碱中毒和电解质紊乱相关。肾皮质的COX-2蛋白表达显着低于对照。尿液外泌体蛋白定量检测到GS患者NCC表达显着减低,COX-2和COX-1的表达均增加。3.GS患者肾脏病理以球旁器增生为主,可伴有肾小球肾炎和间质小管损伤。常规核磁显示GS患者肾脏无异常,功能成像中,弥散峰度成像的K值和D值均与血Cl和HCO3-相关性良好,而IVIM的D值和DP值则与NCC体内功能损害程度相关。第二部分:盐敏感高血压小鼠模型的建立及NCC相关生理的改变1.成功建立高盐高醛固酮的DOCA盐敏感高血压小鼠,表现为收缩压和舒张压持续升高,并伴有尿量增加、尿钠排出量增加和尿渗透压下降;肾脏显着增大,较早(4w)出现小管间质损害和不同程度的间质纤维化,伴有NCC/NKCC-2的表达上调和Casepase-1/IL-1β的激活、COX2高表达。2.氧嗪酸钾(250mg/kg/d)灌胃及0.1%尿酸水饲养成功诱导小鼠轻中度高尿酸血症,并引起血压轻度升高,不伴有尿酸肾病的间质小管改变。小鼠血压与饮食中盐浓度相关,符合盐敏感型高血压的特点,即血压随饮食中盐浓度升高而升高,但其肾组织NCC/NKCC-2/ENaC和炎症焦亡分子的表达量均无显着变化。3.高盐高醛固酮小鼠肾素水平降低,管球反馈相关的A1AR受体无显着差异,A2aR显着降低;高尿酸盐敏感高血压模型中,球旁器肾素表达增加,肾素管球反馈相关的A1AR表达显着升高,而A2aR的表达降低,同时存在RAS系统和管球反馈活化。第叁部分:NCC在管球反馈缺失后对血压和水盐代谢的可能作用1.速尿阻断致密斑NKCC2后,GS患者Ccr显着降低,降低的幅度超过NCC功能正常的非GS患者。2.管球反馈缺失的A1AR-/-小鼠,建立DOCA高血压模型后,肾脏纤维化提前发生,伴随A1AR-/-时上调的A2bR恢复到野生型水平;单肾切除后,A1AR-/-小鼠血压轻度升高,NCC表达上调;高盐高醛固酮刺激不能进一步上调NCC,但可以通过上调NKCC-2促进水和盐的排泄,维持血压与WT-DS小鼠相似。3.管球反馈缺失的高尿酸模型中血压恢复正常,入球动脉慢性重塑消失,伴有A2bR上调;急性尿酸直接刺激入球动脉收缩,并呈剂量依赖性。敲除A1AR后该效应消失,且扩张入球动脉。结论:1.先天性NCC功能障碍的GS患者表现为正常或低血压、低血钾,尿钾、钠、氯排泄增加,以基因诊断为金标准,采用NCC功能试验(氢氯噻嗪试验)临床诊断GS的敏感性和特异性均优于传统的临床诊断标准(低血镁和低尿钙)。2.尿液PGE2水平升高有助于评价临床表现严重程度和NCC功能缺失程度,是潜在的治疗位点;外泌体COX-1和COX-2表达的增加可能是PGE2升高的机制,也可能与活化的管球反馈相关。功能核磁DKI和IVIM参数与NCC功能相关,需要进一步的研究证实。3.低肾素的盐敏感高血压DS模型存在NCC和NKCC2表达上调,炎症可能为高滤过晚期的继发表现;管球反馈缺失后NCC可能与维持正常状态下的血压和电解质平衡相关,在醛固酮和高盐的进一步刺激下,NKCC-2表达增加。4.在高尿酸诱导的盐敏感高血压中,NCC改变和炎症活化不突出,入球动脉的急性收缩和慢性重塑则是这一时期的高血压的重要发病机制,A1AR可能参与其中。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2018-04-01）
刘琳[3]（2013）在《肾脏管球反馈在高尿酸诱导高血压发病中可能的机制》一文中研究指出背景高血压是危害人类健康的常见病,但其机制并不非常清楚,越来越多的流行病学证据提示高尿酸血症是高血压的独立危险因素,并在动物实验中观察到高尿酸与高血压的因果关系,其机制可能与肾素—血管紧张素系统(RAS)激活、内皮功能障碍及血管平滑肌病变有关,但具体的机制并不确切,且存有争议。肾脏的管球反馈(TGF)是机体调节血压和水盐平衡最重要的机制之一,致密斑(MD)感受肾小管中盐浓度的改变,通过旁分泌途径直接调节球旁器区域颗粒细胞分泌肾素和入球小动脉舒缩,直接改变肾小球对水盐的滤过率和远端小管对盐的重吸收,而RAS的活化又直接参与全身血管的舒缩功能,进一步调节血压。因此探讨高尿酸状态管球平衡的紊乱及相关血管活性物质的分泌,对于深入了解高血压的发病机制和潜在的干预位点有积极的意义。目的1.观察正常血压和高血压良性肾硬化患者尿酸与血压及肾脏局部肾素表达的关系；2.建立轻度高尿酸血症小鼠早期高血压动物模型,观察高尿酸血症对管球反馈中致密斑旁分泌叁大途径的影响,了解肾脏局部肾素表达及入球小动脉结构的变化;3.在体外培养致密斑细胞中,观察尿酸对Cox-2、nNOS、ATP代谢酶的直接作用机制；4.在A1型腺苷受体基因敲除(A1AR-/-)小鼠中,观察TGF缺失后,高尿酸诱导高血压的作用是否依然存在,及相应肾素分泌和血管病变的改变。材料、方法与结果一、高尿酸血症与血压及肾素表达相关性在人群中的初步观察收集2004年至2011年在北京协和医院行肾活检的17例高血压良性肾硬化症患者及同期血压正常的19例肾小球轻微损伤患者的临床资料(血清尿酸、肌酐、血压等),免疫组化染色方法评估肾脏局部肾素表达,观察到肾小球轻微损伤患者血清尿酸与肾脏肾素表达具有显着正相关(P<0.05),而良性肾硬化组尿酸与血压及局部肾素表达没有相关性。二、高尿酸血症模型小鼠血压升高(一)高尿酸血症小鼠模型的建立比较2%氧嗪酸饲料喂养、250mg/kg/d氧嗪酸灌胃和500mg/kg/d氧嗪酸灌胃+0.1%尿酸水叁种方法诱导C57BL/6J小鼠高尿酸血症,确定250mg/kg/d氧嗪酸灌胃能有效诱导血清尿酸水平在1w后开始升高,2w后显着升高并维持8w以上,尿酸平均升高幅度为59.8±24.3μmol/L。小鼠的一般情况、肾功能和肾脏病理大致正常。(二)小鼠血清尿酸浓度与血压的关系使用无创尾动脉血压监测系统定期测定小鼠血压,观察到高尿酸小鼠收缩压2w后升高至114.2±10.9mmHg,显着高于自身基线水平106.6±7.4mmHg (P=0.017),并且显着高于同期正常对照组和别嘌醇治疗组小鼠血压。相关分析提示血清尿酸水平与收缩压呈显着正相关(r=0.333,P<0.001)叁、高尿酸对肾素表达调控及入球小动脉的影响通过免疫组化方法观察到高尿酸小鼠肾脏肾素阳性球旁器区域数／肾小球数比例显着高于正常对照组和别嘌醇治疗组(31.0±6.3%比16.8±6.3%和19.1±4.7%,P值分别为0.008和0.013),免疫荧光染色也观察到类似结果。ELISA方法检测叁组小鼠血清肾素浓度,未观察到统计学意义的差异。使用免疫组化方法观察到高尿酸小鼠肾皮质nNOS表达下降,但Real-time PCR没有观察到Cox-2、CD39及CD73mRNA的统计学差异。a-SMA免疫组化染色提示,高尿酸小鼠入球小动脉管壁肌层平均面积显着增加,高于正常对照组和别嘌呤治疗组(115.25±20.78μm2比81.46±18.44μm2和79.12±9.79nm2, P值分别为0.020和0.006),同时伴有管腔狭窄(39.03±4.64μm2比51.07±8.45μm2和65.25±11.78μm2,P值分别为0.030和0.005)。四、尿酸对致密斑细胞旁分泌作用的影响使用Real-time PCR及细胞免疫荧光染色鉴定MMDD1细胞系表达Cox-2、 nNOS阳性,符合MD细胞特征。MTS试验、台盼蓝排斥试验提示3mg/dl-18mg/dl尿酸刺激对MD细胞增殖和死亡率无影响。使用Real-time PCR和western blot方法观察到6mg/dl与12mg/dl尿酸刺激48h和72h,促进MD细胞Cox-2表达上调,nNOS表达下降。6mg/dl尿酸刺激48h和72h均可促进CD39、CD73mRNA表达上调,而12mg/dl尿酸刺激后CD39、CD73mRNA则与正常对照无显着差异。Western blot方法观察到MD细胞表达尿酸转运子URAT1,使用苯溴马隆抑制URAT1,观察到6mg/dl尿酸刺激对CD73mRNA的上调作用被阻断。五、腺苷及A1AR在高尿酸血症所致高血压机制中的作用引进A1AR基因敲除杂合子C57BL/6J小鼠进行配种、繁殖、基因鉴定。在A1AR-/-小鼠中复制高尿酸血症模型,观察到A1AR-/-小鼠血清尿酸升高与野生型小鼠无差异,但收缩压并不升高(P<0.05)。ELISA方法检测A1AR-/-小鼠血清肾素水平与野生型无显着差异。腹腔注射呋塞米1小时后,观察到A1AR-/-高尿酸小鼠收缩压从99.2±13.8mmHg升高至113.7±19.4mmHg, P=0.005,而野生型高尿酸小鼠、A1AR-/-正常尿酸小鼠收缩压均无变化。2周低盐饮食慢性刺激肾素分泌实验中,A1AR-/-高尿酸小鼠收缩压仍低于野生型高尿酸小鼠。a-SMA免疫组化染色提示,A1AR-/-高尿酸小鼠入球小动脉管壁肌层面积与野生型正常尿酸小鼠无异,未出现野生型高尿酸小鼠的入球小动脉管壁增厚现象。结论在本实验条件下观察到：1.血压正常的肾小球轻微损伤患者血清尿酸与肾脏局部肾素表达存在显着的正相关;2.氧嗪酸灌胃可诱导C57BL/6J小鼠血清尿酸持续升高、收缩压升高和肾脏局部肾素表达升高,长期高尿酸导致入球小动脉平滑肌增厚。3.尿酸能直接刺激体外培养的致密斑细胞系叁条旁分泌途径活化,表现为Cox-2表达升高、nNOS表达下降、CD39、CD73表达升高,尿酸对CD73的影响可能通过尿酸转运子(URAT1)介导。4. A1AR-/-小鼠高尿酸血症并不升高血压,也不伴有入球小动脉管壁平滑肌增厚。急性肾素刺激实验可引起A1AR-/-高尿酸小鼠收缩压显着升高,低盐慢性刺激肾素分泌并不能改变A1AR-/-高尿酸小鼠收缩压,说明腺苷及A1AR可能在高尿酸导致高血压发病机制中起到关键作用。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2013-05-01）
张骞[4]（2013）在《醛固酮诱导管球反馈调节过程中一氧化氮和超氧化物在致密斑内的相互作用》一文中研究指出目的：高血压病被世界卫生组织认定为导致心血管疾病患者死亡的主要因素,其多种机制都跟高血压患者的外周血管阻力增高有关。大量证据显示肾脏的水盐代谢功能紊乱(尤其是肾脏内的肾素-血管紧张素-醛固酮系统功能失调)和／或交感神经系统功能紊乱是高血压病发生发展的重要因素。管球反馈(Tubuloglomerular glomerular feedback, TGF)是调节肾脏微循环和肾脏血流动力学的重要机制,通过调节肾小球入球小动脉的收缩与舒张,改变肾小球的滤过率(Glomerular filtrationrate, GFR)。而肾脏致密斑(Macula densa,MD)细胞可以通过释放一氧化氮(Nitric oxide,NO)而减弱TGF,使肾小球入球小动脉舒张而增加GFR。而同样来源于MD的超氧化物(Super oxide, O2-)则可以使NO失活,TGF加深,最终减少GFR。但它们之间的相互作用以及它们跟TGF之间的具体作用还不明了。TGF受多种因素调节,包括血管紧张素Ⅱ、腺苷、花生四烯酸代谢物、ATP、心房利钠因子、NO和O2-等等。最近,我们发现由肾上腺皮质球状带分泌的盐皮质激素——醛固酮在TGF反应中也有重要的作用。蛋白激酶C (Protein Kinase C, PKC)是一种调节机体对类固醇激素急性反应的信号转导蛋白。PKC被证明在多种类型细胞上醛固酮诱导的信号通路中是一种重要的中介物。但是PKC信号通路在致密斑细胞上醛固酮的促氧化作用中是否有作用还不知道。本论文的实验思路是：同时应用体外培养细胞与应用分离和微灌注球旁器(Juxtaglomerular apparatus, JGA)技术在活体组织中证明,在肾脏致密斑中醛固酮能够刺激超氧化物产生,从而消除一氧化氮,进而抵消一氧化氮对管球反馈的抑制作用。同时还研究PKC在醛固酮刺激超氧化物产生过程中的作用。第一部分：醛固酮刺激致密斑细胞产生一氧化氮和超氧化物材料与方法实验细胞系本实验中所使用的细胞为MMDD1(Macula dense like cell line)细胞系,由美国国立卫生院的Dr J. Schnermann提供,这种细胞系是由具有致密斑细胞特性的肾小管上皮细胞系培育而成。为确保细胞处于较好的活性状态,只选用孵育至21-25代的MMDD1细胞。一氧化氮的检测使用荧光检测法检测MMDD1细胞中生成NO的量。操作步骤主要为选用生长面积达到70%-80%的细胞,加入能渗透细胞膜的一氧化氮指示剂4,5-diaminofluorescein diacetate(DAF-2DA),作为荧光染料,将其溶于0.5%的dimethyl sulfoxide (DMSO)溶液,浓度为10umol/L,作用细胞30min后,使用荧光显微镜检测荧光,计算NO产量,然后加入或者不加入醛固酮作用15min然后再检测NO产量。超氧化物的检测使用Lucigenin增强化学发光法检测MMDD1细胞中生成O2-的量。操作步骤主要为,选用生长面积达到70%-80%的细胞,用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution, PBS)冲洗细胞两次,加入1mL胰酶消化1-2min,5ml Krebs/Hepes缓冲液中和,离心,去上清后,加入12mL Krebs/Hepes缓冲液制备细胞悬浊液。通入氧气,加入NAD(P)H,然后加入Lucigenin,加入或者不加入醛固酮后37℃水浴30min,然后分别上机检测。分离和微灌注球旁器应用跟以前报道的相似的分离和微灌注技术来处理入球小动脉(Afferent glomerular arteriole, Af-Art)(?)(?)附着的致密斑。取雄性新西兰大白兔(1.5到2.0kg)用氯胺酮麻醉(45mg/kg,腹腔注射)。游离取下肾脏沿纵轴切片。通过立体显微镜显微分离皮质内的肾小球及入球小动脉、伴随的髓袢升支粗段、致密斑还有远端小管起始端。分离完成后将其转移到倒置显微镜中具备温度调节功能的载物台上。然后入球小动脉和远端肾小管起始端或者髓袢升支粗段插入玻璃毛细管装置。显微分离和微灌注要在8℃下60min以内完成。然后标本被转移到倒置显微镜的载物台上并浸入保持37℃的MEM溶液中完成剩余的实验。在检测前可以等待30min的稳定期。检测被灌注的致密斑中超氧化物的产生选用对超氧化物敏感的荧光染料——dihydroethidium(二氢乙啶)来检测超氧化物的含量水平。髓袢升支粗段持续灌注,致密斑细胞浸入含有二氢乙啶的MEM溶液中结合30min然后冲洗10min。致密斑细胞在380/490nm光线下照射来激活dihydroethidium和oxyethidium(氧乙啶)。收集并计算oxyethidium对dihydroethidium的比值变化作为超氧化物产量的指标。先前发现增加灌注液中氯化钠和醛固酮的浓度能促进致密斑中一氧化氮的释放,所以在MEM浸液跟致密斑灌注液中加入一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS)的拮抗剂N-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)来消除测量超氧化物的过程中一氧化氮对其影响。为了证明致密斑中醛固酮所诱导产生的超氧化物有时间依赖性,在含有L-NAME的灌注液中加入10-7mol/L的醛固酮,然后每间隔15min检测超氧化物的量,共检测75min。统计分析采用了t检验,单因素方差分析(ANOVA)和post-hoc Fisher LSD检验对实验所得数据进行统计分析,数据均采用均数±标准差表示,P<0.05被视为有统计学意义。结果醛固酮刺激MMDD1细胞产生一氧化氮实验组基础值是40.4±4.3U/min,加入醛固酮刺激15mmin后升为644.1±118.5U/min,而在对照组中,基础值是45.9±5.2U/min,15min后为53.4±6.1U/min。醛固酮刺激MMDDI细胞产生超氧化物没有醛固酮处理的对照组基础值是1293±106RLU·s-1.105cells-1,有醛固酮处理细胞的实验组,升为2349±222RLU·s-1.105cells-1。醛固酮在分离灌注的致密斑中刺激超氧化物的产生将致密斑的灌注液中氯化钠(NaCl)浓度从10mmol/L升至80mmol/L,然后用10-8或者10-7mol/L的醛固酮刺激15min,并没有发现超氧化物的产生有明显变化。推测是致密斑中由醛固酮诱导产生的一氧化氮对超氧化物产生了影响,为了消除一氧化氮的影响,在后续实验中检测超氧化物时向致密斑浸液和灌注液中加入10-4mol/L L-NAME。用NaCl(80mmol/L)灌注致密斑时,超氧化物量为9.4±1.5U/min。在灌注液中加入醛固酮(10-7mol/L)刺激15mmin,超氧化物产量增加到17.2±1.3U/min。加入醛固酮(10-8mol/L)对一氧化氮产生没有明显影响。在含有L-NAME的灌注液中加入醛固酮(10-7mol/L),每间隔15mmin检测超氧化物,共检测75mmin。结果显示,致密斑中超氧化物的量随时间延长而逐渐增加。结论醛固酮能刺激MMDD1细胞产生一氧化氮和超氧化物,同时在分离并微灌注的活体组织致密斑上醛固酮能增加超氧化物的产生第二部分醛固酮诱导产生的一氧化氮和超氧化物的相互作用以及对管球反馈的影响材料与方法分离和微灌注球旁器同第一部分。检测一氧化氮和超氧化物的相互作用对管球反馈的影响将显微分离的致密斑转移到倒置显微镜中具备温度调节功能的载物台上并采用NaCl (10mmol/L)灌注等待30min稳定期后,换用NaCl (80mmol/L)灌注液,检测入球小动脉管腔十径5min。再换回NaCl (10mmol/L)的灌注溶液,藉由入球小动脉前后直径的变化反映管球反馈效应的改变。将醛固酮加入肾小管的灌注液中灌注15mmin然后检测管球反馈效应的改变,以此反映醛固酮在管球反馈调节过程中的作用。为了检测超氧化物的清除剂哌啶(tempol)对管球反馈效应的影响,向小管灌注液中加入超氧化物清除剂哌啶灌注15min然后检测管球反馈效应的改变。为了确定哌啶在管球反馈中的影响是否具有持续性,换回含有lOmmol/L NaCl的灌注液并重复上述实验。为了检测致密斑中超氧化物的清除对醛固酮诱导的管球反馈的反应性降低是否有作用,同时向小管灌注液中加入超氧化物清除剂哌啶(tempol)和醛固酮灌注15min然后检测管球反馈效应的改变。检测醛固酮诱导致密斑产生超氧化物的信号通路为了证明醛固酮诱导超氧化物的产生是否通过PKC调节,采用PKC的抑制剂并且重复上面分离微灌注致密斑的实验。将PKC的非特异性抑制剂Chelerythrine chloride (CC)加入含有80mmol/L NaCl的灌注液中灌注致密斑30min,检测超氧化物的产量。然后在灌注液中加入10-7mol/L的醛固酮刺激15min,并检测超氧化物的产量。为了证明醛固酮诱导超氧化物的产生是否通过PKCa调节,采用PKCa抑制剂并且重复上面分离微灌注致密斑的实验。将PKCa特异性抑制剂Go10-7mol/L加入含有80mmol/L NaCl的灌注液灌注致密斑30min。检测超氧化物的产量。然后在灌注液中加入10-7mol/L的醛固酮刺激15min,并检测超氧化物的产量。统计分析采用了t检验,单因素方差分析(ANOVA)和post-hoc Fisher LSD检验对实验所得数据进行统计分析,数据均采用均数±标准差表示,P<0.05被视为有统计学意义。结果致密斑中超氧化物的消除进一步增强醛固酮在管球反馈中的作用首先测定了基础值,当灌注液中NaCl的勺含量从10mmol/L升到80mmol/L时,入球小动脉管腔直径从17.5±0.5um降到了15.1±0.5umn,管球反馈为2.4±0.3umn。将10-7mol/L的醛固酮加入灌注液中灌注15min,当灌注液中NaCl的含量从10mmol/L升到80mmol/L时,入球小动脉的管腔直径从17.6±0.5um降到了16.1±0.6um,管球反馈降为1.4±0.2um将10-4mol/L的哌啶加入灌注液中灌注15min,当灌注液中NaCl的含量从1Ommol/L升到80mmol/L时,入球小动脉管腔直径从17.2±0.5um降到了15.6±0.4um,管球反馈为1.5±0.2um。重复上述实验,将灌注液中NaCl的含量从10mmol/L再次升到80mmol/L,入球小动脉管腔直径显示从17.3±0.6um降到了15.8±0.7um,管球反馈为1.4±0.2um。将10-4mol/L的哌啶和10-7mol/L的醛固酮同时加入灌注液中灌注15min,将灌注液中NaCl的含量从10mmol/L升到80mmol/L时,入球小动脉管腔直径从18.4±0.6um降到了18.1+0.7um,管球反馈为0.4+0.2um。醛固酮刺激超氧化物产生过程是由PKC α信号通道介导将PKC的非特异性抑制剂CC10-7mol/L加入含有80mmol/L NaCl的灌注液灌注致密斑30min。超氧化物的产量为7.3+1.1U/min.然后在灌注液中加入10-7mol/L的醛固酮刺激15min,超氧化物的产量为5.9+1.7U/min。将PKCα的特异性抑制剂Go10-7mol/L加入含有80mmol/L NaCl的灌注液灌注致密斑30min。超氧化物的产量为7.9±1.2U/min.然后在灌注液中加入10-7mol/L的醛固酮刺激15min,超氧化物的产量为6.3±1.5U/min。结论首次应用分离和微灌注球旁器技术在活体组织中进一步证明,醛固酮诱导超氧化物的产生增加能够抵抗致密斑中一氧化氮对管球反馈的影响,从而调节管球反馈的反应性；而且PKC α在调节致密斑中醛固酮诱导的超氧化物产生增加的过程中有重要作用。意义与本实验室以往进行的体外实验相比,该体内实验有助于进一步了解肾脏致密斑中醛固酮引起的一氧化氮和超氧化物的产生及相互作用对管球反馈的影响,进而影响肾脏的水盐代谢及血流动力学变化,从而对血压产生影响等机制,明确其在心脏、肾脏等高血压相关靶器官损伤中的作用,为临床治疗提供新的干预靶点,对临床工作给予积极指导。(本文来源于《山东大学》期刊2013-04-10）
吴广延,隋建峰[5]（2009）在《致密斑在管球反馈和肾素分泌中的作用》一文中研究指出肾脏是泌尿系统的组成器官之一,不仅是一个单纯的排泄器官,而且是一个对内环境和正常生理活动调节有着关键影响作用的器官,肾小球球旁器在肾脏调节水盐代谢和自身稳定的过程中发挥重要的作用。近年来的研究发现:在哺乳动物肾脏内,ATP是致密斑(Macula densa,MD)参与的管球反馈(Tubuloglomerular feedback,TGF)过程中的信息传递物质;前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)在MD调节肾素分泌的过程中是至关重要的。(本文来源于《四川生理科学杂志》期刊2009年04期）
高辞修,杨琳,戴培东,王克强,许世雄[6]（2008）在《肾血流肌源性调节与管球反馈的耦合数学模型》一文中研究指出通过肾脏血流分配的耦合数学模型,来定性、定量的了解生理及病理状态下肾血流的分配。方法:以哈根-泊苏叶定律和渗透传质方程为基础,应用正常生理及部分肾脏切除状态的血流灌注量、血管管径、肾小管溶质浓度等参数,构建了耦合肌源性调节(myogenic response,MR)、管球反馈机制(tubuloglomerular feedback,TGF)和小管系统的数学模型,模拟其自身调节功能及血流重分配。结果:在肾髓质,对小管系统水分和溶质的重吸收进行了一维扩散-传质模型的构建,得到TGF调控下髓袢降支灌注量与远端小管Na浓度之间的数值对应关系;模拟了灌注压、灌注量的自身调节和血流在皮-髓质的分配,正常生理状态下,皮质、外髓质、内髓质的血流量百分比分别为约89%、10%、1%;又模拟了灌注量增加时(部分肾脏切除模型)的血流重分配,灌注量增加,皮质血量比例增加,反之则髓质血量比例增加。结论:本模型能够较好反映肾脏的自身调节功能和血流分配,为临床提供了可借鉴的肾功能定性、定量评价方法。(本文来源于《第十届中国科协年会论文集（叁）》期刊2008-09-01）
西山成,胡宜[7]（2002）在《肾微循环——管球反馈机制及肾微循环的研究法》一文中研究指出近年来 ,随着细胞生物学、基因工程学研究的飞速发展 ,血管生物学研究也在不断取得成果 ,并于最近开始应用于临床。曾经梦想过的使脑梗塞部位血管新生的疗法 ,以及与之相反 ,通过阻碍肿瘤增殖而出现的血管新生 ,以达到治疗癌症的目的正在成为可能。而这一切又与脏器微循环密不可分。为此本刊特选译《医学のあゆみ》2 0 0 2年Vol 2 0 1 ,No 1 0特集 :微小循环 ,做到温故知新。(本文来源于《日本医学介绍》期刊2002年11期）
何小瑞,姚泰[8]（1992）在《刺激脑内渗透压感受器能降低大鼠管球反馈的敏感性》一文中研究指出在麻醉大鼠肾脏近曲小管和远曲小管分别进行微穿刺,采集小管液。测定单个肾单位肾小球滤过率(SNGFR)。由于微穿刺部位对管球反馈造成的影响,在同一肾单位,采集近曲小管末段小管液测出的SNGFR值(SNGFR_p)比在远曲小管起始段测出的SNGFR值(SNG-FR_d)高,故可将在这两个部位测得的SNGFR值的差(SNGFR_(p-d))用作衡量管球反馈(TGF)敏感性的间接指标。脑室内注射高张盐水(icv.HS)后,SNGFR_(p-d)减小,表明脑内渗透压感受器受刺激可使TGF的敏感性降低。静脉注射速尿后,icv.HS不再引起肾血浆流量和肾小球滤过率的增加,但仍能引起尿钠排出增多。上述结果表明,刺激脑内渗透压感受器可通过减弱TGF导致肾脏血流动力学的改变,而其增加尿钠排出的效应则是通过抑制肾小管的重吸收实现的。(本文来源于《生理学报》期刊1992年04期）
何小瑞,姚泰[9]（1991）在《管球反馈对肾小球血流动力学的影响及其机制》一文中研究指出管球反馈的作用在于稳定进入远端肾小管的水和溶质的量。小管液溶质浓度或Nacl浓度变化可刺激致密斑部位的感受细胞,使入球小动脉的阻力发生变化,从而改变肾小球滤过率。管球反馈的敏感性也受某些生理或病理因素的影响。(本文来源于《生理科学进展》期刊1991年03期）
Slomowitz,L,周光达[10]（1988）在《慢性肾衰竭的管球反馈》一文中研究指出现已证明肾脏损害超过一定程度,即使引起肾损害的原因去除,也会进展为终末期肾疾病(ESRD)。受损肾脏在病理上表现为局灶和节段性硬化。无论将鼠的1(5/6)肾切除还是用链脲佐菌素所致糖尿病并用胰岛素治疗,其单个肾单位血液动力学改变相似。输入动脉血流量(Qa)、肾小球毛细血管内外静水压力差(△P),单个肾单位肾(本文来源于《国外医学.泌尿系统分册》期刊1988年02期）
管球反馈论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
背景与目的:机体维持水盐电解质和血压的平衡依赖于肾脏小球和小管结构的完整性和正常的管球反馈(tubuloglomerular feedback,TGF)。远端小管上的钠氯共转运子(NCC)是由SLC12A3基因编码的跨膜蛋白,它与近端小管髓攀升支粗段和致密斑的钠钾氯共转运子(NKCC2)、集合管的上皮钠通道(ENaC)共同组成了肾脏的水盐电解质平衡的重要防线,其中NKCC2和ENaC是致密斑和集合管管球反馈的重要感应子,而NCC与TGF的关系并不明确。SLC12A3基因失活突变导致NCC功能障碍即Gitelman综合征(GS),是一种罕见的失盐性肾病,是研究NCC功能的天然疾病模型,但相关病理生理机制的研究不多,缺乏评价临床严重程度、可指导治疗的生物标志物和功能影像学方法。本研究拟观察较大样本量的GS患者临床病理特点、生活质量和性别差异,比较NCC生理功能试验对GS的临床诊断价值;观察尿液PGE2及其代谢产物水平与临床的相关性,初步探索外泌体及功能核磁在GS中的应用价值。建立两种不同的盐敏感高血压小鼠模型:高盐-高醛固酮-低肾素模型(DS)和轻中度高尿酸导致的早期高血压模型(HUA),探索NCC在高血压发生和肾损害中可能的作用,并在腺苷1型受体基因敲除(A1AR-/-)的模型中探讨管球反馈与NCC的相关性。方法:第一部分:先天NCC功能障碍的GS患者临床特点及生物影像标志物探索1.纳入临床疑诊为失盐性肾病的患者,提取外周血DNA、PCR扩增后行SLC12A3基因测序进行基因诊断,作为诊断的金标准,采用氢氯噻嗪试验阻断NCC以评价其体内功能,分析比较该功能试验与经典的GS临床指标在诊断试验中的敏感性、特异性差异;2.搜集GS患者临床资料,观察患者血压和水盐代谢的特点;留取患者血浆和24h尿标本ELISA法测定PGE2及其代谢产物PGEM的水平,分析其与临床资料及NCC功能的相关性;采用SF-36量表分析其生活质量,并与性别年龄匹配的健康受试者比较。比较GS患者以上资料的性别差异。收集女性患者的妊娠资料,观察妊娠期间血电解质水平的变化及妊娠相关并发症。3.总结本中心肾活检的GS患者肾脏病理资料,免疫组化半定量分析肾脏皮质COX-2的表达与对照(肾小球轻微病变患者)的差异。提取尿液外泌体并进行形态、粒径和标志物的鉴定,免疫印迹法检测患者NCC、COX-2、COX-1蛋白表达水平。采用轴位IVIM(体内不相干运动成像)和DKI(弥散峰度成功能核磁)显像的方法,探索GS患者肾脏潜在的功能改变,分析其功能影像学参数与临床资料的相关性。第二部分:盐敏感高血压小鼠模型的建立及NCC相关生理的改变1.分别建立C57b1背景下的单肾切除-高盐-高醛固酮的盐敏感高血压(DS)小鼠模型(肾素抑制)和轻度高尿酸血症(HUA)诱导的早期盐敏感高血压(高肾素型)小鼠模型,尾夹法监测血压变化,观察血压及水盐代谢的变化;评价血压与饮食中盐含量的关系;病理染色观察肾脏病变特点、评价小管间质损害。2.在两种模型中分别检测肾组织3种钠离子转运通道(NCC/NKCC-2/γ ENaC)蛋白和mRNA水平。定量上游的调控激酶SGK-1的蛋白表达,检测炎症焦亡信号caspase-1/IL18/IL1 β及相关指标的异常。3.放免法观察调节血压和出球小动脉收缩的肾素、血管紧张素Ⅱ和醛固酮水平,免疫组化进行球旁器肾素定位,免疫印迹法观察与管球反馈和入球动脉舒缩功能相关的腺苷受体表达水平。第叁部分:NCC在管球反馈缺失后对血压和水盐代谢的可能作用1.在GS患者和非GS患者中进行速尿试验,计算试验前后的肌酐清除率以推测管球反馈的状态,比较GS患者和非GS患者肌酐清除率的变化,初步推测体内管球反馈的活化程度。2.在管球反馈缺失的A1AR-/-小鼠中,分别观察DS模型和HUA模型的血压及水盐代谢变化,评价肾脏病变特点;免疫印迹法检测3种钠离子转运蛋白(NCC/NKCC-2/γENaC)和炎症焦亡信号 caspase-1/IL18/IL1β 的水平;比较A1AR敲除后其他类型腺苷受体的变化。3.分离野生型和A1AR-/-小鼠肾小球的入球动脉,显微灌注观察不同尿酸水平对入球动脉的急性刺激作用;免疫组化半定量评估尿酸对野生型和A1AR-/-小鼠入球动脉的慢性重塑作用。结果:第一部分:先天NCC功能障碍GS患者临床特点及生物影像标志物1.105例低血钾患者检测到SLC12A3基因突变,共携带69种突变,平均血压为110.0±12.4/72.1±9.8mmHg,并伴有不同程度的肾素、血管紧张素Ⅱ、醛固酮活化;氢氯噻嗪实验提示患者NCC不同程度受损。以基因诊断为金标准,氢氯噻嗪功能试验的敏感性和特异性分别为93.1%和88.9%,曲线下面积为0.989(95%CI 0.961-1.000),均优于低血镁和低尿钙单个指标或联用的临床诊断价值;2.男性患者较女性发病早、血钾低、血压高、多尿更显着,但生活质量无差异。5例妊娠患者孕期前3月血钾水平较妊娠前显着下降,对症处理后,妊娠过程平稳、结局良好。男性尿PGE2及其代谢产物(PGEM)水平显着高于女性,且GS患者显着高于同性别的对照,并观察到升高的PGE2与更严重的NCC功能障碍(氢氯噻嗪试验)、代谢性碱中毒和电解质紊乱相关。肾皮质的COX-2蛋白表达显着低于对照。尿液外泌体蛋白定量检测到GS患者NCC表达显着减低,COX-2和COX-1的表达均增加。3.GS患者肾脏病理以球旁器增生为主,可伴有肾小球肾炎和间质小管损伤。常规核磁显示GS患者肾脏无异常,功能成像中,弥散峰度成像的K值和D值均与血Cl和HCO3-相关性良好,而IVIM的D值和DP值则与NCC体内功能损害程度相关。第二部分:盐敏感高血压小鼠模型的建立及NCC相关生理的改变1.成功建立高盐高醛固酮的DOCA盐敏感高血压小鼠,表现为收缩压和舒张压持续升高,并伴有尿量增加、尿钠排出量增加和尿渗透压下降;肾脏显着增大,较早(4w)出现小管间质损害和不同程度的间质纤维化,伴有NCC/NKCC-2的表达上调和Casepase-1/IL-1β的激活、COX2高表达。2.氧嗪酸钾(250mg/kg/d)灌胃及0.1%尿酸水饲养成功诱导小鼠轻中度高尿酸血症,并引起血压轻度升高,不伴有尿酸肾病的间质小管改变。小鼠血压与饮食中盐浓度相关,符合盐敏感型高血压的特点,即血压随饮食中盐浓度升高而升高,但其肾组织NCC/NKCC-2/ENaC和炎症焦亡分子的表达量均无显着变化。3.高盐高醛固酮小鼠肾素水平降低,管球反馈相关的A1AR受体无显着差异,A2aR显着降低;高尿酸盐敏感高血压模型中,球旁器肾素表达增加,肾素管球反馈相关的A1AR表达显着升高,而A2aR的表达降低,同时存在RAS系统和管球反馈活化。第叁部分:NCC在管球反馈缺失后对血压和水盐代谢的可能作用1.速尿阻断致密斑NKCC2后,GS患者Ccr显着降低,降低的幅度超过NCC功能正常的非GS患者。2.管球反馈缺失的A1AR-/-小鼠,建立DOCA高血压模型后,肾脏纤维化提前发生,伴随A1AR-/-时上调的A2bR恢复到野生型水平;单肾切除后,A1AR-/-小鼠血压轻度升高,NCC表达上调;高盐高醛固酮刺激不能进一步上调NCC,但可以通过上调NKCC-2促进水和盐的排泄,维持血压与WT-DS小鼠相似。3.管球反馈缺失的高尿酸模型中血压恢复正常,入球动脉慢性重塑消失,伴有A2bR上调;急性尿酸直接刺激入球动脉收缩,并呈剂量依赖性。敲除A1AR后该效应消失,且扩张入球动脉。结论:1.先天性NCC功能障碍的GS患者表现为正常或低血压、低血钾,尿钾、钠、氯排泄增加,以基因诊断为金标准,采用NCC功能试验(氢氯噻嗪试验)临床诊断GS的敏感性和特异性均优于传统的临床诊断标准(低血镁和低尿钙)。2.尿液PGE2水平升高有助于评价临床表现严重程度和NCC功能缺失程度,是潜在的治疗位点;外泌体COX-1和COX-2表达的增加可能是PGE2升高的机制,也可能与活化的管球反馈相关。功能核磁DKI和IVIM参数与NCC功能相关,需要进一步的研究证实。3.低肾素的盐敏感高血压DS模型存在NCC和NKCC2表达上调,炎症可能为高滤过晚期的继发表现;管球反馈缺失后NCC可能与维持正常状态下的血压和电解质平衡相关,在醛固酮和高盐的进一步刺激下,NKCC-2表达增加。4.在高尿酸诱导的盐敏感高血压中,NCC改变和炎症活化不突出,入球动脉的急性收缩和慢性重塑则是这一时期的高血压的重要发病机制,A1AR可能参与其中。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
管球反馈论文参考文献
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