一、鹅细小病毒和番鸭细小病毒核酸疫苗重组质粒的构建及表达（论文文献综述）
姜煜晨[1]（2021）在《江苏地区小鹅瘟流行病学调查及其细胞适应毒研究》文中提出小鹅瘟（Gosling Plague,GP）是一种由鹅细小病毒（Goose Parvovirus,GPV）引起 1-20日龄雏鹅或雏番鸭的高度接触性、传播性、高致病性和高死亡率的急性或亚急性败血性传染病,严重危害养鹅业的发展。虽然小鹅瘟弱毒疫苗及卵黄抗体的使用对小鹅瘟的控制发挥了重要作用,但小鹅瘟依然有流行趋势。本研究在对江苏地区小鹅瘟分子流行情况初步了解基础上,对GPV-CZM、CZM-70和CZM-142进行了全基因序列分析,并对细胞适应毒CZM-142进行了动物攻毒保护实验相关的研究。1 2019-2020年江苏地区小鹅瘟分子流行调查为了解江苏地区小鹅瘟的流行情况,于2019年到2020年采集来自扬州大学动物医院的疑似小鹅瘟病例的肠道和肝脏等样品,共分离到30份GPV分离株。从流行季节来看,以春夏两季所得到的分离株较多;从临床脏器病变情况来看,主要以肠道症状为主。对所有GPV分离株的主要结构基因VP3进行测序,并对其基因序列、遗传进化、糖基化位点和基因重组测试进行分析研究。结果表明:30株GPV分离株的VP3全长均为1605bp,编码534个氨基酸,与GenBank中已发表的经典GPV-VP3序列同源性为95.2%-100%,氨基酸序列同源性为97.6%-100%,分离株集中分布在同一亚群中,与经典GPV株亲缘关系较近,说明遗传进化相对保守。所有分离株均有5个糖基化位点,比标准B株少505-508位NRTS糖基化位点。重组事件分析发现,现有分离株病毒没有重组情况的发生。2不同代次CZM株病毒全基因分析本研究选取GPV-CZM、CZM-70和CZM-142三株病毒进行了全基因测序和致病性试验。致病性试验结果表明,与其他代次毒株相比,CZM-142株在雏鹅的发病、致死率、体重等方面的影响是最小的,可以作为潜在的细胞弱毒疫苗候选株。全基因测序结果发现,三株病毒的全长均为5106bp。与GPV-CZM相比,CZM-142株基因存在79个核苷酸差异位点,其中,非编码区有32个核苷酸差异位点;编码区中有16个核苷酸差异位点位于NS片段,31个位于VP片段,不存在碱基的插入与缺失。氨基酸方面有8个位于NS蛋白,25个位于VP蛋白,其中部分氨基酸位点差异通过分析发现可能与细胞致弱机制有关。3细胞适应毒CZM-142动物攻毒保护实验为了解小鹅瘟细胞适应毒CZM-142对野毒攻毒保护的免疫效果,本研究将CZM-142适应毒分别以625、1250、2500和5000TCID50免疫剂量免疫1日龄雏鹅,并在免疫后第6天进行强毒100LD50的攻毒试验。结果发现,2500和5000TCID50剂量CZM-142适应毒免疫后不仅能产生较高抗体水平,而且均能有效保护雏鹅不发病,强毒对照组雏鹅全部发病死亡,说明2500个TCID50剂量的CZM-142适应毒就能有效保护100LD50的强毒感染,提示小鹅瘟细胞适应毒CZM-142株有望成为小鹅瘟病毒细胞弱毒疫苗候选株并应用于小鹅瘟的防控。
秘清灵[2]（2021）在《鹅细小病毒成纤维细胞适应株的培育及细胞适应的分子基础》文中进行了进一步梳理鹅细小病毒病,俗称“小鹅瘟”,是危害雏鹅的一种主要疫病,流行于世界上主要的养鹅国家,具有很高的发病率和死亡率。该病病原为鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）,目前归为细小病毒科依赖病毒属。目前,对GPV致病的分子机理的认识还很不清楚,这与GPV不能在体外培养的细胞上良好增殖不无关系。GPV强毒株在鹅胚上能够很好的复制并能致死鹅胚,但却不能在鹅胚成纤维细胞中良好增殖,这也限制了深入探究GPV与宿主细胞蛋白之间的互作关系。本研究旨在培育一株能够在鹅胚成纤维细胞上增殖良好的适应株,并对细胞适应的分子基础进行了分析揭示,为今后深入探索GPV复制及致病的分子机制奠定了基础。一、鹅细小病毒鹅胚成纤维细胞适应株的培育SYG61v是一株对鹅胚高度适应的GPV弱毒疫苗株。为了在尽可能短的传代时间内培育出对GEF高度适应的GPV毒株,本研究以SYG61v作为传代的起始亲本株,在GEF原代或次代细胞上连续盲传40代次。研究结果显示,SYG61v病毒株传代至40代次,已经能很好的适应GEF,感染后72h,GEF上已经可以观察到明显的细胞病变（CPE）,表现为胞质内颗粒物增加、细胞肿胀、边界粗糙,直至崩解脱落。为区分于传代前的亲本株SYG61v,对传代至40代次的病毒用SYG61v-C40表示。以Rep蛋白多克隆抗体介导的间接免疫荧光（IFA）显示,在接种细胞适应株之后72h,在细胞核内可以检测到明亮的荧光,而对照组GEF无荧光信号。绝对荧光定量PCR显示,在20代次的细胞裂解物中,病毒基因组拷贝数可达到最高水平,约2.4×109/ml,并在随后代次中略有下降,维持在约5.4×108/ml水平。对SYG61v-C40适应株的组织细胞半数感染量（TCID50）测定表明,其TCID50达到2×106.69/ml。为了进一步评价适应毒对雏鹅及鹅胚的致病性,将SYG61v-C40细胞裂解液与其亲本病毒SYG61v分别接种9日龄易感鹅胚和2日龄雏鹅。结果显示,SYG61v-C40接种的9个易感鹅胚,平均死亡时间达211h,而SYG61v接种的鹅胚在97h即可致死全部鹅胚,表明SYG61v-C40对鹅胚的致病力已经明显下降。对SYG61v-C40接种的雏鹅无一死亡,其7天和21天的体重分别达到0.258 kg和0.657 kg,略低于同期对照组的体重0.288 kg和0.690 kg,但统计学差异不显着,表明SYG61v-C40细胞适应株对雏鹅仍表现为轻微的致病性。二、GPV鹅胚成纤维细胞适应株SYG61v-C40基因组定序和比较分析SYG61v-C40细胞适应株基因组中哪些元件的改变与细胞适应性转变相关尚不清楚。本研究对SYG61v-C40的基因组分段进行了 PCR扩增、克隆和测序,通过拼接获得了 SYG61v-C40的基因组序列,进而通过与亲本病毒SYG61v之间展开比较,得以明确哪些核苷酸或氨基酸改变与细胞适应性相关。研究结果显示,在SYG61v-C40株编码蛋白区共有13个核苷酸发生了点突变,其中3个位于Rep基因,10个位于VP1基因,共导致6个氨基酸位点发生突变,其中1位于Rep蛋白羧基端,5个位于结构蛋白VP1部分。进一步分析显示,产生于VP1蛋白中的5个突变氨基酸,107和142位氨基酸位于VP1的N端独特区（VP1u）,而该区域被认为具有磷脂酶活性,与细小病毒的感染密切相关。381和449位氨基酸则位于VP3蛋白,分别由天冬酰胺变为赖氨酸（N→K）、丝氨酸变为精氨酸（S→R）。这两个氨基酸突变不仅改变了氨基酸极性,而且其位点还处于衣壳外表面,因而对SYG61v-C40株细胞适应性的转变可能具有关键性影响。SYG61v-C40的ITR回文区茎部缺失34个碱基,这些缺失碱基均处于回文区茎部外侧。应用核酸二级结构分析软件分析显示,SYG61v-C40株ITR回文区茎部由于碱基缺失多出了 1个loop结构。由于ITR不仅是基因组复制起点,还参与转录、病毒子组装等过程,这种ITR二级结构的改变对SYG61v-C40株细胞适应性的建立具有何种作用有待深入分析。三.SYG61v-C40株细胞株突变氨基酸位点的功能分析SYG61v-C40尽管经历了 40次的GEF传代,与其亲本株SYG61v相比,SYG61v-C40累积的核苷酸突变很有限,由此产生的突变氨基酸位点只有6个,而ITR中,除了几个核苷酸突变位点外,一个鲜明的特征是在回文区的茎部区域非对称性的产生了 34个碱基缺失,由此与亲本株SYG61v相比,SYG61v-C40 ITR的二级结构中会多出一个loop。那么,编码蛋白中的核苷酸突变和ITR的碱基变动在细胞适应上是否具有不同的地位是本研究的关注问题。通过基于SYG61v的感染性克隆质粒pSYG61v,构建了整合SYG61v-C40编码区序列的嵌合质粒pSYG61v-C40,转染GEF并拯救出感染性病毒。结果显示,拯救出的嵌合病毒pSYG61v-C40感染GEF后72h,GEF就产生细胞崩解等CPE,与细胞适应株SYG61v-C40感染GEF细胞的表现极为类似。而pSYG61v拯救出的病毒感染GEF细胞,直至96 h也不会产生明显CPE。TCID50测定也表明,嵌合病毒pSYG61v-C40的TCID50达到了 2×108.615/ml。绝对荧光定量PCR测定也显示,pSYG61v-C40感染GEF后96 h收获细胞裂解液中能够检出的病毒基因组拷贝数稳定在108～109/ml左右。这些结果表明,SYG61v-C40株之所以能够高度的适应GEF,Rep-VP1编码框中产生的6个氨基酸点突变在其中应该发挥了关键作用。
胡瑞鸿[3]（2020）在《抗H株小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与质量评估》文中进行了进一步梳理小鹅瘟（Gosling plague,GP）又称为鹅细小病毒病,是由鹅细小病毒引起的一种高度接触性、败血性传染病,是危害养鹅业的主要传染病。近年来,根据遗传进化分析,小鹅瘟病毒（Gosling plague virus,GPV）的毒力有增强趋势,给该病的防治带来更大的挑战。目前GP的特异性防治主要依赖接种卵黄抗体（Immunoglobulin of yolk,IgY）进行被动免疫,对GP强毒感染具有明显的防治效果。由于IgY具有价格低廉、防治效果好等优点,已被广大养鹅户接受和采用。但目前使用的IgY多为粗制抗体,缺乏统一的生产、检验标准,琼扩抗体效价高低不等,故研制一种纯度及效价高,防治效果好,有统一生产标准的GPV IgY势在必行。本研究从黑龙江省某地饲养的雏鹅群中,采集疑似GP病死鹅的病料,进行GPV的分离鉴定,利用分离获得的GPV研制抗GP的IgY,并对其质量进行评价,具体研究内容和方法如下:（1）GPV的分离鉴定用氯仿提取法从疑似GP病死鹅的肝、脾组织中分离病毒,接种3日龄雏鹅和12日龄鹅胚进行病毒分离;分离的病毒经特异性检验（琼脂扩散试验（AGP）和鹅胚中和试验）、超微结构观察、毒力测定、理化特性（热敏感试验、乙醚敏感试验、氯仿敏感试验、胰蛋白酶敏感试验、耐酸性试验）检验、纯净性试验、核酸检测、VP3基因序列鉴定及基因进化树分析,进行综合鉴定。（2）GPV IgY的研制将分离鉴定获得的GPV（命名为H株）,经鹅胚逐级传代至F10,F10代进行1000倍稀释,接种12日龄鹅胚,收获鹅胚液作为GPV灭活疫苗抗原,抗原无菌检验和毒力检测合格后,进行浓缩及灭活,通过接种12日龄鹅胚进行灭活检验;灭活检验合格后进行GPV灭活疫苗的配制及乳化,获得GPV灭活疫苗,对其进行物理性状、无菌检验及安全性检验;将检验合格的GPV灭活疫苗按经典免疫程序免疫产蛋鸡,当高免鸡蛋卵黄液的GPV IgY琼扩抗体效价≥1:64时,对其进行除脂、提取和灭活,制备出抗H株GPV IgY。（3）抗H株GPV IgY的质量评价通过监测GPV IgY的琼扩抗体效价对GPV IgY的理化特性（温度、酸碱度、胃蛋白酶的作用时间、冻融次数）进行评价;通过GPV IgY单次单剂量、重复单剂量和单次大剂量皮下注射3日龄雏鹅及小白鼠的安全性试验,观察雏鹅和小白鼠的健康状况,局部及全身反应情况对GPV IgY的安全性进行评价;通过不同琼扩抗体效价和不同剂量的GPV IgY对GPV强毒攻毒24 h雏鹅的治疗试验、对GPV感染不同时长和不同日龄雏鹅的治疗试验,依据雏鹅治愈率,对GPV IgY治疗效果进行评价;用不同琼扩抗体效价和不同免疫剂量的GPV IgY对雏鹅皮下接种,24 h后用GPV强毒攻毒,依据雏鹅保护率进行预防效果评价;同类产品免疫3日龄雏鹅,依据雏鹅保护率与治愈率,评价GPV IgY与同类产品的差异。通过物理性状、无菌检验、支原体检验、GPV IgY琼扩抗体效价监测及对雏鹅攻毒保护率监测,确定GPV IgY的储存温度和时间。试验结果表明:（1）GPV的分离鉴定结果分离的病毒接种雏鹅,呈现与GP一致的临床症状和病理剖检变化;接种鹅胚,可在鹅胚中增殖,且为非血凝性感染病毒;AGP显示,从雏鹅和鹅胚分离的病毒液与GP阳性血清之间出现沉淀线;鹅胚中和试验证明,病毒液能被GP阳性血清中和,中和后的病毒液接种鹅胚不引起死亡;电镜下观察,H株病毒粒子具有典型的细小病毒特征;H株鹅胚和雏鹅传代培养F6～F10代,毒价最高且稳定,病毒的ELD50和LD50分别大于10-5.0/0.2 m L和10-4.0/0.2m L;以分离到的H毒株分别接种3日龄、10日龄、20日龄雏鹅,其致病性随雏鹅日龄增大而减弱;分离的病毒在56℃3 h保持其感染性,能够抵抗乙醚、氯仿、胰蛋白酶和酸性条件（p H3.0）的作用;分离的病毒液细菌、支原体和外源病毒检查均为阴性,证明H株病毒纯净;PCR核酸检测病毒约在500 bp处出现特异性DNA条带,DNA大小与GPV相符;上述结果表明,分离的病毒符合GP生物学特性,该病毒为GPV（命名为H株）。以PCR扩增出的VP3基因,与参考毒株的VP3基因序列对比,核苷酸的同源性在95.9%～99.1%之间,氨基酸同源性为97.9%～99.6%之间;基因进化树分析表明,H株与在黑龙江省分离的SP、ZZ、ZD、DQ、JX等毒株亲缘关系较与GD（广东）、YG（扬州）等毒株近。（2）GPV IgY的制备结果GPV H株灭活疫苗抗原无菌检验呈阴性、鹅胚液ELD50为10-5.22/0.2 m L、灭活检验鹅胚全部健活。GPV灭活疫苗的物理性状、无菌检验、安全检验均合格。用该GPV灭活疫苗免疫产蛋鸡,收集AGP≥1:64高免鸡蛋的卵黄液。高免卵黄液经酸化水1:8稀释、p H5.2、4℃作用15 h、1900 g离心20 min条件下除脂;酸化水-1.5%辛酸-33%硫酸铵提取;终浓度0.05%甲醛溶液经20～25℃灭活24 h,对GPV IgY的琼扩抗体效价、蛋白浓度及蛋白纯度均无显着影响,确定上述除脂、提取和灭活条件为最佳工艺。（3）GPV IgY的质量评价结果上述制备的抗H株GPV IgY在60℃以下作用2 h,GPV IgY琼扩抗体效价与对照比不降低,当温度达到70℃以上,琼扩抗体效价显着降低,当温度达到75℃作用30 min时,琼扩抗体效价呈阴性;p H范围在4.0～11.0时,GPV IgY琼扩抗体效价与对照比差异不显着,p H值为3.0和12.0时,GPV IgY琼扩抗体效价显着低于对照组;当胃蛋白酶作用6 h,琼扩抗体效价无变化,作用8 h以上显着降低;GPV IgY经5次反复冻融,琼扩抗体效价与对照比无显着差异;GPV IgY免疫雏鹅和小白鼠均未出现任何注射局部和全身不良反应,精神状态良好,采食正常;GPV IgY对雏鹅治疗效果表明,琼扩抗体效价越高、注射剂量越大,雏鹅治愈率越高;病毒感染雏鹅的时间越长、雏鹅日龄越大,雏鹅治愈率越低;GPV IgY对雏鹅预防效果表明,同一注射剂量,琼扩抗体效价越高,雏鹅保护率越高,同一琼扩抗体效价,注射剂量增加,雏鹅保护率增高;GPV IgY免疫雏鹅后12 h～10 d,对雏鹅保护率高达88.00%以上,可有效抵抗病毒感染。差异对比试验表明,研制的GPV IgY的雏鹅保护率与治愈率均高于同类产品。（4）GPV IgY的储存条件2～8℃储存24个月,GPV IgY的物理性状、纯净性、琼扩抗体效价稳定,对雏鹅感染GPV的保护率达88.00%以上。（5）GPV IgY推荐使用剂量和方法对已感染GPV的雏鹅,选择GPV IgY琼扩抗体效价为1:16以上,1.0 m L/只;对未感染雏鹅进行紧急预防免疫,0.5 m L/只,皮下注射,对GPV感染的治愈率和保护率均达80.00%。
孙洁[4]（2020）在《GPV、NGPV VP2与转铁蛋白受体的相互作用研究及蛋白质结构预测分析》文中研究表明鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）属于细小病毒科（Parvoviridae）、细小病毒属的成员,该病毒从最初造成雏鹅、雏番鸭发生“小鹅瘟”,到1971年在法国造成半番鸭短喙与侏儒综合征（Short beak and dwarfism syndrome,SBDS）,再到2015年新型鹅细小病毒（Novel,Goose parvovirus,NGPV）引起北京鸭短喙侏儒综合征（Duck beak atrophy and dwarfish syndrome,BADS）,病毒的宿主范围逐渐扩大,并出现了跨种间传播的现象,对我国乃至世界范围内的水禽健康高效养殖以及公共卫生产生了巨大威胁。病毒与细胞表面受体的结合是病毒感染复制过程中的始动环节,是影响病毒宿主特异性的决定性因素之一。先前的研究表明,细小病毒衣壳蛋白对于病毒的嗜性、宿主范围以及致病性具有重要意义。其VP2可以与宿主细胞表面的受体相互作用,使病毒进入细胞并增殖,从而发生有效感染。鉴于此,本研究以细小病毒衣壳蛋白VP2为研究对象,提出细胞膜上调控铁转运的跨膜蛋白-转铁蛋白受体（transferrin receptor,TfR）为病毒与宿主细胞结合的假设表面受体。TfR是质膜中高效表达的成分之一,也是病毒引发宿主细胞感染的有力靶标。通过生物信息学、分子生物学等研究方法,对病毒与受体的蛋白进行同源建模与结构预测分析,并分别验证GPV-VP2、NGPV-VP2蛋白与其自然宿主细胞表面受体TFR的互作情况。本研究主要内容如下:1、用序列结构分析软件对GPV、NGPV的衣壳蛋白VP2和鹅、鸭TfR进行比对分析;2、将诱饵质粒VP2-pGBKT7转化到Y2H酵母菌株中,猎物质粒TfR-PGADT7转化到Y187酵母菌株中,混合培养两个酵母菌株,验证鹅TfR与GPV VP2蛋白之间、鸭TfR与NGPV VP2蛋白之间的相互作用情况;3、为了防止假阳性,利用原核表达系统表达并纯化的VP2-GST融合蛋白与真核转染系统表达的TfR-HA融合蛋白进行GSTPull down体外互作试验;4、通过间接免疫荧光确定病毒与TfR的定位情况;5、制备特异性良好的TfR多克隆抗体,并用该多抗封闭GEF细胞和DEF细胞,封闭后吸附感染GPV和NGPV,荧光定量PCR方法测定多抗封闭细胞后病毒的感染效率。结果如下:序列结构分析表明,GPV VP2和NGPV VP2的6个位于病毒表面的氨基酸变异位点（S305N、S353N、A379G、K430R、H515N、D558N）均远离病毒与宿主受体相互作用的区域,提示变异不足以对病毒与受体的结合构成影响。经酵母双杂交系统与GST-Pull down试验证实,鹅TfR与GPV VP2蛋白发生相互作用;鸭TfR与NGPV VP2蛋白发生相互作用。激光共聚焦显微镜观察结果显示,GPV和NGPV病毒粒子分别吸附GEF细胞和DEF细胞后,能够与细胞膜表面的TfR发生共定位。荧光定量PCR结果显示,抗TfR的多克隆抗体封闭GEF细胞和DEF细胞后,可阻断病毒的入侵,降低感染效率。上述结果证明宿主细胞膜表面的TfR是GPV和NGPV的受体,是病毒吸附宿主细胞和感染过程中的重要蛋白,GPV、NGPV通过与其宿主表面TfR相互作用,从而造成鹅、鸭的感染。本研究对于理解GPV-宿主相互作用的分子机制、开发可阻断病毒感染的治疗药物以及制定针对GPV感染的干预策略至关重要。
杨程程[5]（2019）在《鹅细小病毒对雏鸭免疫器官损伤的初步研究》文中认为鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）是一种感染4-21日龄雏鹅和雏番鸭的单链线性DNA病毒,新型鹅细小病毒（Novel goose parvovirus,NGPV）是引起鸭短喙-侏儒综合征的病原,NGPV在遗传性和抗原性方面与GPV极其相似,近年来流行病学调查显示在商业化的鸭群中GPV可与其他病原协同存在或感染发病,文献报道GPV人工感染雏鸭可造成雏鸭不同脏器的损伤,但没有直接证据证实GPV在鸭群的传播,GPV对鸭免疫器官的损伤情况也未见报道。本研究通过对2015-2018年安徽地区GPV的分离鉴定,扩增其VP基因,绘制遗传进化树,选择与NGPV亲缘关系最近的一株经典GPV AH-1株进行雏鸭攻毒试验,观察GPV对雏鸭免疫器官的损伤,旨在研究GPV在雏鸭免疫器官内的增殖规律,为揭示GPV的致病机制提供参考依据。1、对2015-2018年安徽地区12例具有典型临床症状的疑似GPV病例和2例疑似NGPV病例的组织进行PCR检测,检测结果显示均为阳性,其中GPV命名为AH-1至12,NGPV命名为AH13和AH14。然后,将14份病料分别接种13日龄非免疫鹅胚,结果胚体、脏器均出现不同程度的出血;收集死亡胚体尿囊液,扩增14株病料VP基因和ITR基因,并测序进行遗传进化分析,结果显示12株GPV属于一个子集,亲缘性较高,其中GPVAH-1株（GenBank登录号:MK333463）与NGPV具有很高的同源性,因此,选择GPV AH-1株进行鹅胚半数致死量测定,结果显示AH-1株的ELD50=10-4.17/0.2ml,并以此毒株作为后续研究的候选株。2、参考GPV标准B株基因（GenBank登录号:U25749）VP3片段设计一对特异性引物,扩增VP3基因,测序正确后构建pMD18-T-VP3质粒,以该质粒为阳性标准品,建立了 SYBR Green I荧光定量PCR方法。VP3标准曲线的线性回归方程为:y=-3.2568X+37.987（R2=0.9986）,扩增效率在90%-120%之间,最低检测下限为46.95copies/μL,这说明建立的SYBR Green I荧光定量PCR的反应有效性以及不同浓度梯度对数值与Ct值之间呈现良好的线性关系。特异性试验中DTMUV、GPMV、ALV、ILTV、CIAV均为阴性,应用SYBR Green I荧光定量PCR方法检测GPV在雏鹅组织内的病毒含量变化,结果显示在感染后3-5d内均能在组织中检测到病毒,表明该方法具有很高灵敏度和特异性。3、用1000倍ELD50的GPVAH-1株肌肉注射2日龄非免疫雏鸭,研究GPV对雏鸭免疫器官的病理损伤。通过人工感染雏鸭,采集攻毒后1d、3d、5d、7d、10d、14d 7个时间段的组织分别进行大体检查、病理切片观察,抗原的定量和定位分析,结果显示GPV感染雏鸭后除了感染后1d有轻微的精神沉郁和厌食外,无异常变化,14d内没有死亡,感染后3d胸腺有出血点,5d脾脏与肠管肿大,7d肝脏有点状出血。镜下观察感染后5-7d胸腺和脾脏出血较严重,3-5d哈德氏腺充血较为严重,10-14d后所有脏器损伤减轻或消失。qPCR检测结果显示病毒在法氏囊、胸腺、哈德氏腺中第一天增殖达到最高水平并随后呈现递减的规律;在脾脏、盲肠扁桃、骨髓细胞中的增殖规律呈现先增后减的趋势。抗原定位结果显示GPV在免疫器官中3-5d内阳性信号较强,7d后阳性信号逐渐减弱,这些结果说明GPV能够在鸭体免疫器官复制,并造成部分免疫器官病理损伤。综上所述,本研究对12例安徽地区GPV和2例NGPV进行了分离鉴定和VP基因的扩增分析;建立了检测GPV的SYBR Green I荧光定量PCR方法;选取一株GPV经典强毒株AH-1通过肌肉注射雏鸭,观察GPV对雏鸭的病理损伤,并对1-14d感染雏鸭的各免疫器官进行了 GPV的定量和定位分析,为研究GPV的致病机制提供了一定参考依据。
崔元[6]（2018）在《鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析》文中提出“鸭短喙-侏儒综合征”（Beak atrophy and dwarfism syndrome,BADS）是一种以雏鸭发育不良、喙萎缩变形、舌外伸肿胀和骨质疏松为主要特征的传染病。自2014年11月以来,该病在我国东南多省的商品肉鸭群中发生并流行,给我国鸭养殖业造成了严重的经济损失。本研究旨在从流行病学与病原学角度出发,分离相关病原进行致病性分析,明确引发BADS的病因,并建立病原实验室检测方法,探究致病病原的相关特性,为该病的防控提供理论依据及技术支持。本文主要从以下三个方面进行论述:首先,为了探究BADS的致病原因,本研究对发生BADS病鸭的肝脏和脾脏进行了PCR/RT-PCR检测,排除了其他的鸭常见疫病,将该病的病原命名为鸭细小病毒（Duck parvovirus,DPV）。将阳性病料研磨液接种鸭胚,盲传5代,收获尿囊液,通过PCR检测、测序鉴定、同源进化分析、动物回归试验,最终确定本研究成功分离到了一株DPV（命名为DPV SD）。此外,本研究还利用鸭胚成纤维细胞（Duck embryo fibroblasts,DEF）对病毒进行了分离培养,PCR和间接免疫荧光试验（Indirect immunofluorescence assay,IFA）结果表明,本研究成功获得了SD株的细胞分离毒。DPV SD株的成功分离为DPV的进一步研究打下了基础。其次,为了进一步探究DPV分子水平上的特性,本研究对SD株的全基因组序列进行了分段扩增,并对其基因序列进行了结构特征分析及同源进化分析。结果表明,SD株全长5053 bp,由两端的末端倒置重复序列（Inverted terminal repeat,ITR）和中间的开放阅读框（Open reading frame,ORF）组成。左侧ORF（LORF）编码非结构蛋白NS,右侧ORF（RORF）编码结构蛋白VP。SD株与其他BADS分离株和鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）欧洲分离株的亲缘关系较近,而与番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus,MDPV）分离株的关系较远。此外,与绝大多数水禽细小病毒相比,SD株的ITR区分别于100114 nt和337350 nt的区域存在14个碱基的缺失。最后,潜在糖基化位点的预测分析结果表明,SD株NS和VP蛋白上共有6个潜在糖基化位点。本研究为DPV的分子致病机制及分子流行病学调查的深入研究奠定了基础。最后,本研究通过PCR扩增了SD株的VP3基因,构建了标准品重组质粒pMD19-SD-VP3。选取VP3基因中在各株DPV之间较为保守且和其他水禽细小病毒有差异的区域,设计了1对荧光定量PCR引物及1条荧光探针。经过对反应体系的优化和标准曲线的绘制,最终建立了针对DPV的荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性和可重复性进行了验证。结果表明,建立的DPV Taq-Man实时荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、可重复性良好。此检测方法的建立为DPV的实验室诊断提供了有力的技术支持。
宁康[7]（2018）在《鸭短喙与侏儒综合征的病原学及感染鸭喙的转录组学》文中认为短喙与侏儒综合征（Short beak and dwarfism syndrome,SBDS）是1971年在法国出现的半番鸭疾病,其病原属鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）的西欧分支。2014年以来,一种类似半番鸭SBDS的疾病在我国北京鸭养殖业出现和流行,造成了巨大的经济损失。面对这一疫情,首先开展了病原学研究,提出了防治措施。该病主要发生于北京鸭商品肉鸭,感染鸭表现出半番鸭SBDS的特征症状。用易感鹅胚从典型病例分离到GPVJS1株,用该毒株感染2日龄北京鸭,可复制出SBDS。此结果表明,GPV是导致北京鸭发生SBDS的致病病原。用水禽细小病毒PCR检测了安徽、山东、江苏和河北的北京鸭组织样品79份,检出GPV阳性样品77份（97.5%）,由此可见,该病已在我国多个地区流行。检测了不同地区8个孵化场刚出壳的北京鸭样品40份,检出GPV阳性样品35份（87.5%）,提示病毒可经卵垂直传播。在琼脂扩散试验中,北京鸭源毒株与鹅源毒株H株表现出相同的沉淀反应抗原。用VP1和VP3部分序列进行遗传演化分析,结果显示,北京鸭源毒株属GPV的西欧分支。用小鹅瘟抗体制品免疫雏鹅,可有效控制SBDS的发生。为理解北京鸭源GPV毒株的本质,测定了分离株JS1株的基因组序列,观察了北京鸭源和鹅源毒株的基因组差异位点以及JS1株和鹅源经典毒株H株对北京鸭和雏鹅的致病性差异。结果显示,相对于鹅源GPV毒株,我国北京鸭源GPV的非编码区存在碱基突变和插入/缺失,但这些变异并不影响发夹结构的形成。VP1蛋白含5个共性氨基酸突变,但均远离可能的受体吸附位点。在NS蛋白编码区,含9个共性氨基酸突变。在核苷酸水平,可见7个碱基突变位于功能元件内或附近。JS1株和H株均影响北京鸭增重以及喙、翅和腿部骨骼的发育,并均可引起内脏组织出现显微病变,但,仅JS1株可复制出SBDS的典型症状。结果表明,JS1株和H株均对北京鸭有致病性,但JS1株毒力更强,据此可认为SBDS的致病病原属于GPV毒力变异株。qPCR和ELISA检测结果显示,JS1株和H株均可在北京鸭体内复制,并均可诱导血清抗体产生。用JS1株和H株感染雏鹅,均可引起高死亡率（73.3%和93.3%）。此结果表明,北京鸭源GPV仍保留着对雏鹅的高致病性。用转录组学技术分析了JS1株感染组、H株感染组和对照组鸭喙的基因表达谱。通过两两比对,筛选出与鸭短喙与侏儒综合征相关的452个差异表达基因。GO分析表明,这些差异表达基因显着富集到生物学过程、细胞组分和分子功能相关的292个GO类别。KEGG分析结果显示,差异基因富集到与代谢途径通路、钙信号通路、mTOR信号通路、凋亡、WNT信号通路等相关的110个信号通路。结果为进一步研究GPV导致SBDS的致病机制提供了线索。
李鹏飞[8]（2018）在《新型鹅细小病毒检测方法的建立及流行病学调查》文中指出自2014年下半年以来,我国江苏、安徽和山东等养鸭大省的肉鸭养殖地区陆续报道发生一种以肉鸭生长迟缓、上下喙萎缩变短、舌头外露、拉稀、瘫痪等为主要临床症状的传染性疾病,暂时称为“短喙-侏儒综合征”（Short beak and dwarfism syndrome,SBDS）。该病在樱桃谷鸭和半番鸭均有报道发生,感染群体中10%-50%的鸭子会受影响,发病鸭常因采食困难而严重消瘦,病鸭出栏时体重比健康鸭低20%-30%,给肉鸭养殖业造成极大的经济损失。后经学者分离鉴定,发现该病的主要病原是一种能感染北京鸭的新型鹅细小病毒（Novel goose parvovirus-related virus,NGPV）。本研究建立了不同的NGPV检测方法,调查了临床采集的样本中NGPV的流行情况,初步探究了NGPV的组织嗜性;分离培养多株NGPV毒株,通过进行全基因组扩增测序和对病毒基因组全面的分析,为NGPV基因组特点和致病机制等研究提供新思路;广泛采集不同的临床样本,对NGPV与鸭圆环病毒（DuCV）的混合感染进行了更加全面的调查研究。本研究主要分为以下四部分:1.检测NGPV与GPV的双重半套式PCR方法的建立及应用根据传统GPV和NGPV的衣壳蛋白保守区域序列,应用Oligo7.0软件设计了一对通用引物和两条分别针对传统GPV和NGPV的特异性引物,建立了能一步检测传统GPV和NGPV的双重半套式PCR方法。该方法的最佳反应程序为:95°C 7 min;95°C45 s,51°C 45 s,72°C 55 s,33个循环,最后72°C延伸10 min,4°C保存。该方法特异性好,仅能检测到NGPV与GPV,不与减蛋综合征病毒、鸭乙肝病毒、鸭圆环病毒、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、大肠杆菌、沙门氏菌等其它常见病原反应;灵敏度高,最低能检测到100拷贝的病原核酸。应用所建立的双重半套式PCR方法对来自15个鸭场的疑患SBDS病的133只病死鸭进行检测,未在收集的病料中检测到传统GPV。共计91.58%（87/95）的5-18日龄的樱桃谷鸭和92.11%（35/38）的17-25日龄的半番鸭检测为NGPV阳性。在NGPV阳性的鸭子中,心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺、胆汁、胸腺、法氏囊和脑中病毒检出率在樱桃谷鸭中为85.08%至9.20%,在半番鸭中为74.29%-5.71%。根据我们临床检测结果,NGPV在我国华东三省（山东、安徽、江苏）呈流行态势,而患SBDS的病鸭中不存在传统GPV的感染,同时,NGPV对樱桃谷鸭和半番鸭具有广泛的组织嗜性,能够破坏中枢免疫和外周免疫系统以及突破血脑屏障。2.NGPV核酸探针检测方法的建立及应用本试验将新型鹅细小病毒的VP3保守区域的一段长390 bp的序列克隆制备成核酸探针,通过核酸探针的特异性试验结果表明,制备的该核酸探针特异性高,只与GPV和NGPV反应,灵敏性试验结果表明,针对新型鹅细小病毒最低检出量约为6 pg。应用该核酸探针对来自山东、江苏、安徽三省的87只疑患“短喙长舌-侏儒综合征”的樱桃谷肉鸭的870份组织脏器进行检测,结果个体阳性率为89.7%（78/87）,在各脏器中心脏和脾脏检出率较高,分别为74.4%和50.0%,在脑中检出率最低为9%,这一检出结果与PCR方法的结果基本一致。以上结果表明,制备的地高辛标记的新型鹅细小病毒核酸探针特异性强,灵敏性高,适合不同来源的鹅细小病毒临床批量诊断和流行病学调查。3.7株NGPV的分离培养及全基因组测序分析为了更好的了解NGPV与传统GPV之间的关系,本研究对2015-2016年分离自不同地区的7株NGPV进行了全基因组测序与分析。比对分析和进化树结果显示NGPV属于GPV的一个分支,与GPV享有92.2%-97.1%核苷酸同源性。与传统GPV的ITR区域相比,NGPV存在5处核苷酸同步变异,6株NGPV（SDLY1512,SDHZ1604,SDDY1605,AH1605,AH1606,JS1603）存在两个14个核苷酸片段的缺失,在Rep蛋白和Cap蛋白分别发现了12处和8处氨基酸同步变异点,这可能与NGPV的基因调控、体液免疫应答以及宿主迁移有重要关联。此外,经过软件分析发现,NGPV分离株SDLY1602被认为是重组毒株,主要亲本为GPV台湾疫苗株82-0321v,次要亲本为GPV野毒株GDaGPV,这是首次发现NGPV野毒株由GPV疫苗株和野毒株重组而来,有助于对NGPV分子生物特性的深入理解。4.NGPV与DuCV混合感染的研究NGPV被认为是樱桃谷鸭SBDS病的主要致病原,然而典型的短喙侏儒症状却无法高成功率的单纯用NGPV病毒在实验室重复出来。由于禽圆环病毒感染会导致类似于SBDS的临床症状,因而鸭圆环病毒被猜测是肉鸭SBDS病的次要病原。本研究中,我们使用两种半套式PCR方法调查了来自20个鸭场共计170只疑患SBDS病的病死鸭以及200枚不同日龄的鸭胚中NGPV和DuCV的混合感染情况。根据我们的调查数据显示,我国山东、江苏、安徽三省的鸭场的NGPV和DuCV混合感染率为100%（20/20）,170只病死肉鸭中NGPV与DuCV的混合感染率为63.53%（108/170）,其中DuCV-1的检出率为DuCV-2检出率的两倍,说明在肉鸭SBDS中DuCV-1相比于DuCV-2占主要作用。在200枚鸭胚中NGPV与DuCV的混合感染率为3.5%,说明这两种病毒可以通过鸭胚垂直传播。根据对临床SBDS病鸭中NGPV与DuCV感染率的调查统计,我们提出肉鸭的SBDS病是由NGPV与DuCV协同感染导致。
苏晓娜[9]（2017）在《水禽细小病毒的分离鉴定及VP3-ELISA方法的建立》文中研究说明水禽细小病毒包括鹅细小病毒（Goose parvovirus,GPV）和番鸭细小病毒（Muscovy duck parvovirus,MDPV）,是引起水禽细小病毒病的两种重要病原,这两种病毒主要感染雏鹅和雏番鸭,具有较高发病率和死亡率,严重制约水禽业发展。这两者在病原学、流行病学、临床症状等方面极其相似,血清抗体也存在一定的交叉保护性,常规的血清学诊断方法不能将两者区分,这对两者的鉴别诊断带来很大困难。本研究于2014年1月至2016年9月份期间对我国南方5个省份部分鸭场进行水禽细小病毒的流行病学调查,并通过建立特异的PCR诊断方法对临床病例进行确诊。统计结果表明,MDPV疫情多发于冬春季节,自2016年以来,GPV疫情呈爆发式增长,在调查的鸭场中福建区域疫情最为严重。动物回归试验表明,GPV和MDPV的临床症状及病理变化相似,GPV较MDPV攻毒后发病早、病程急。本研究根据GenBank上的水禽细小病毒株的全基因序列,共分别设计了6对引物扩增水禽细小病毒基因组的ITR区和编码区,通过改进全基因克隆方法,共获得11株水禽细小病毒全基因序列。与参考毒株序列进行ITR及编码区的序列比对及遗传进化分析。结果表明:1)新分离毒株可分为3个分支:经典MDPV分支、SAAS-SHNH新型MDPV分支和GPV分支;2)新分离毒株LHX以及鹅细小病毒疫苗株YM的基因组发生了MDPV与GPV的重组,重组主要发生在VP3片段;3)在同一分支毒株之间的同源性,VP3>VP1>NS1,而对于不同分支的毒株之间的同源性,NS1>VP1>VP3;4)鹅细小病毒疫苗株SYG50、YM株和新分离毒株LHX在80110位有连续碱基缺失,番鸭细小病毒疫苗DHN、M株和新分离毒株YFL、WZQ缺失第110140位碱基,这些变异是否是疫苗株之间的共性变异,以及新分离毒株是否与疫苗株发生重组,需要进一步研究确定;5)2015年分离毒株MSY、WZH和DQF株与经典MDPV分支的代表毒株相似性极高;而2016年新分离毒株YFL、LHX和WZQ株,出现了许多与SAAS-SHNH分支及GPV分支相似的变异,说明番鸭上GPV和MDPV之间发生重组的变异越来越常见。本研究利用原核表达的MDPV-VP3蛋白为免疫原免疫小鼠,获得2株分泌抗MDPV-VP3蛋白的阳性杂交瘤细胞株,分别命名为2G1和2G5。亚类鉴定结果显示,两株单抗均为IgG1亚类。Westernblot及间接免疫荧光结果显示,2株单抗均能与天然MDPV结合。本研究利用原核表达的MDPV-VP3蛋白为包被抗原,建立能检测血清中MDPV的IgG抗体的间接ELISA方法。该方法对MDPV抗体特异性强,与GPV的阳性血清无交叉反应,重复性好,临床样品检测符合率高、应用前景广。
王燕[10]（2017）在《新型鹅细小病毒VP3抗体特异性ELISA检测方法的建立》文中进行了进一步梳理近年来,一种新型鹅细小病毒（GPV）在我国北方各省鸭群中出现并流行,导致发病鸭群出现短喙凸舌,生长迟缓等症状,命名为鸭短喙侏儒综合征（BADS）。本研究建立了一种基于新型GPV病毒VP3结构蛋白的间接酶联免疫吸附实验,检测血清中的GPV抗体。大肠杆菌表达的GPV-VP3衣壳蛋白经包涵体粗纯化及镍柱纯化,Western blot实验结果显示纯化后的蛋白可与GPV抗体反应。通过条件优化:抗原包被最适浓度为100 ng/孔,4℃过夜包被;使用复合封闭液封闭2 h;最佳一抗稀释倍数为1:640,作用时间为1 h;辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体稀释倍数为1:10000,二抗反应时间为1 h;TMD显色时间为15 min,建立了一种基于VP3蛋白检测新型GPV抗体的间接ELISA方法。特异性检测显示,该方法不与新城疫病毒、鸭肝炎病毒、鸭源呼肠孤病毒、禽流感病毒和传染性法氏囊病毒有交叉反应;灵敏性检测结果显示:待测血清10240倍稀释后,仍可良好检出GPV特异性抗体;临床样品检测评价显示:80份血清样本用血清中和试验（SN）和建立的ELISA方法平行检测。结果显示两种方法检测都为阳性的有32份,阴性的有48份,符合率为88.75%。该VP3-ELISA方法有高灵敏度和特异性,是一种检测血清中GPV抗体的有效的血清学检测方法。
二、鹅细小病毒和番鸭细小病毒核酸疫苗重组质粒的构建及表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、鹅细小病毒和番鸭细小病毒核酸疫苗重组质粒的构建及表达（论文提纲范文）
（1）江苏地区小鹅瘟流行病学调查及其细胞适应毒研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 1 鹅细小病毒基本特征 |
| 1.1 病原学特征 |
| 1.2 宿主范围和培养特性 |
| 2 基因分子特征 |
| 2.1 GPV基因组结构 |
| 2.2 非结构蛋白 |
| 2.3 结构蛋白 |
| 3 临床特点 |
| 3.1 流行病学 |
| 3.2 临床症状和病理变化 |
| 4 诊断 |
| 4.1 病毒分离与鉴定 |
| 4.2 分子生物学诊断 |
| 4.3 血清学诊断 |
| 5 防治 |
| 本研究的目的及意义 |
| 研究内容一 2019-2020年江苏地区小鹅瘟分子流行调查 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料与实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 病毒分离 |
| 2.2 病毒鉴定 |
| 2.3 PCR产物的纯化 |
| 2.4 与pGEM-T Easy载体的连接 |
| 2.5 连接产物的转化 |
| 2.6 质粒DNA的提取 |
| 2.7 酶切鉴定 |
| 2.8 重组质粒序列测定及分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 接种鹅胚结果 |
| 3.2 HA试验结果 |
| 3.3 PCR鉴定结果 |
| 3.4 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 3.5 流行情况分析 |
| 3.6 GPV-VP3序列分析 |
| 3.7 氨基酸序列分析 |
| 3.8 VP3潜在糖基化位点分析 |
| 3.9 重组分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 研究内容二 不同代次CZM株病毒全基因分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒株、细胞及实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 原代GEF细胞制备 |
| 2.2 病毒传代 |
| 2.3 不同代次CZM株半数组织细胞感染量的测定 |
| 2.4 不同代次CZM株鹅胚半数感染量和半数致死量的测定 |
| 2.5 不同代次CZM株雏鹅致病性实验 |
| 2.6 全基因PCR扩增 |
| 2.7 构建重组质粒 |
| 2.8 重组质粒的筛选与鉴定 |
| 2.9 重组质粒序列测定及分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 GPV-CZM、CZM-70和CZM-142的TCID_(50)试验结果 |
| 3.2 GPV-CZM、CZM-70和CZM-142的EID_(50)和ELD_(50)试验结果 |
| 3.3 不同代次CZM株对雏鹅致病性实验结果 |
| 3.4 GPV全基因PCR扩增结果 |
| 3.5 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 3.6 GPV全基因序列分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 研究内容三 细胞适应毒CZM-142动物攻毒保护实验 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 GPV强毒株的筛选 |
| 2.2 强毒对雏鹅半数致死量的测定 |
| 2.3 母源抗体检测 |
| 2.4 CZM-142免疫剂量选择试验 |
| 2.5 攻毒保护试验 |
| 2.6 攻毒保护重复性试验 |
| 2.7 泄殖腔排毒检测和体重称量 |
| 2.8 血清的分离 |
| 2.9 不同剂量免疫水平检测 |
| 2.10 组织器官病变情况 |
| 3 结果 |
| 3.1 GPV强毒株筛选结果 |
| 3.2 强毒对雏鹅半数致死量测定结果 |
| 3.3 母源抗体检测结果 |
| 3.4 CZM-142免疫剂量选择结果 |
| 3.5 攻毒保护试验结果 |
| 3.6 攻毒保护重复性试验结果 |
| 3.7 PCR检测泄殖腔排毒情况 |
| 3.8 免疫后鹅体重变化 |
| 3.9 不同免疫剂量抗体水平检测结果 |
| 3.10 组织器官病变情况 |
| 4 小结与讨论 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（2）鹅细小病毒成纤维细胞适应株的培育及细胞适应的分子基础（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 文献综述: 鹅细小病毒鹅胚成纤维细胞适应株的培育及细胞适应的分子基础 |
| 1 鹅细小病毒概述 |
| 1.1 鹅细小病毒病原学 |
| 1.2 分子生物学特征 |
| 2 鹅细小病毒致病机制 |
| 2.1 宿主范围和临床症状 |
| 2.2 GPV体外培养物的选择及其培养特性 |
| 3 病毒与细胞的相互作用 |
| 3.1 病毒感染引起的细胞变化 |
| 3.2 病毒和细胞表面受体互作研究进展 |
| 4 宿主细胞的抗病毒作用 |
| 4.1 病毒与胞内miRNA互作 |
| 4.2 病毒感染对机体免疫系统的影响 |
| 5 研究目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 鹅细小病毒鹅胚成纤维细胞适应株的培育 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒株 |
| 1.2 鹅胚及雏鹅 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 鹅胚原代成纤维细胞( GEF)的制备 |
| 2.2 鹅胚成纤维细胞(GEF)的传代培养 |
| 2.3 SYG61v毒株接种GEF |
| 2.4 细胞毒的收集和传代 |
| 2.5 PCR检测 |
| 2.6 组织细胞半数感染量(TCID50)的测定 |
| 2.7 间接免疫荧光(IFA)检测GEF中的病毒增殖 |
| 2.8 病毒基因组拷贝数荧光定量PCR方法的建立 |
| 2.9 SYG61v-C40细胞适应株的鹅胚感染实验 |
| 2.10 SYG61v-C40细胞适应株的雏鹅感染试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 鹅胚成纤维细胞的制备 |
| 3.2 SYG61v病毒的细胞传代 |
| 3.3 病毒传代中病毒核酸的PCR鉴定 |
| 3.4 SYG61v-C40细胞适应株TCID50的测定 |
| 3.5 间接免疫荧光(IFA)结果 |
| 3.6 SYG61v不同代次培养物中病毒基因组拷贝数的测定 |
| 3.8 SYG61v-C40细胞适应毒株的鹅胚感染实验 |
| 3.9 SYG61v-C40细胞适应株的雏鹅感染试验 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 GPV鹅胚成纤维细胞适应株SYG61v-C40基因组定序和比较分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒株 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 生物学试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 SYG61v-C40细胞适应株基因组扩增 |
| 2.2 序列比较和生物信息学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 SYG61v-C40基因组扩增和序列测定 |
| 3.2 结构蛋白VP1核苷酸和氨基酸比较 |
| 3.3 非结构蛋白Rep1核苷酸和氨基酸比较 |
| 3.4 SYG61v-C40及其亲本株5'ITR二级结构比较分析 |
| 3.5 SYG61v-C40及其亲本株VP1蛋白二级结构比较分析 |
| 3.6 SYG61v-C40及其亲本株VP1蛋白三级结构比较分析 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 SYG61v-C40株氨基酸突变位点在细胞适应中的作用分析 |
| 1 材料 |
| 1.1 病毒株 |
| 1.2 菌株和质粒 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 生物学试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 pSYG61v-C40质粒的构建 |
| 2.2 嵌合质粒pSYG61v-C40转染鹅胚成纤维细胞 |
| 2.3 嵌合病毒的传代 |
| 2.4 pSYG61v-C40嵌合病毒TCID_(50)的测定 |
| 2.5 pSYG61v-C40传代病毒载量检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 SYG61v-C40细胞适应株3.5 kb片段的PCR扩增和克隆 |
| 3.2 pSYG61v质粒的酶切和4.5kb骨架的回收 |
| 3.3 pSYG6v-C40嵌合质粒的构建 |
| 3.4 嵌合质粒pSYG61v-C40的转染拯救 |
| 3.5 嵌合病毒TCID_(50)检测 |
| 3.6 嵌合病毒基因组拷贝数的测定 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 攻读硕士期间参与发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）抗H株小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与质量评估（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 小鹅瘟病毒研究现状 |
| 1.1.1 小鹅瘟病毒及小鹅瘟病简介 |
| 1.1.2 小鹅瘟病毒的鉴定方法 |
| 1.2 小鹅瘟生物制剂研究进展 |
| 1.2.1 小鹅瘟病毒活疫苗 |
| 1.2.2 小鹅瘟病毒灭活疫苗 |
| 1.2.3 小鹅瘟病毒基因疫苗 |
| 1.2.4 小鹅瘟病毒重组活载体疫苗 |
| 1.2.5 小鹅瘟抗血清 |
| 1.2.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体 |
| 1.3 卵黄抗体的研究进展 |
| 1.3.1 卵黄抗体的结构特点 |
| 1.3.2 卵黄抗体的提取方法 |
| 1.3.3 卵黄抗体的灭活方法 |
| 1.3.4 卵黄抗体应用 |
| 1.3.5 卵黄抗体的优势与展望 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器与设备 |
| 2.2 主要材料和试剂 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 研究技术路线图 |
| 2.3.2 小鹅瘟病毒分离培养 |
| 2.3.3 小鹅瘟病毒的鉴定 |
| 2.3.4 小鹅瘟病毒灭活疫苗的制备及检验 |
| 2.3.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体的制备 |
| 2.3.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体质量评价 |
| 2.3.7 小鹅瘟病毒卵黄抗体储存条件的确定 |
| 2.4 试验数据分析及统计 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 小鹅瘟病毒分离培养 |
| 3.1.1 小鹅瘟病毒在雏鹅分离培养结果 |
| 3.1.2 小鹅瘟病毒在鹅胚分离培养结果 |
| 3.2 小鹅瘟病毒鉴定 |
| 3.2.1 小鹅瘟病毒特异性试验结果 |
| 3.2.2 小鹅瘟病毒粒子超微结构观察结果 |
| 3.2.3 小鹅瘟病毒毒力测定 |
| 3.2.4 小鹅瘟病毒理化特性 |
| 3.2.5 小鹅瘟病毒的纯净性试验结果 |
| 3.2.6 小鹅瘟病毒核酸检测结果 |
| 3.2.7 小鹅瘟病毒VP3基因序列鉴定 |
| 3.3 小鹅瘟病毒灭活疫苗抗原的制备及成品检验 |
| 3.3.1 小鹅瘟病毒H株灭活疫苗制备抗原用病毒的检验 |
| 3.3.2 小鹅瘟病毒H株灭活疫苗检验 |
| 3.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体的制备 |
| 3.4.1 产蛋鸡选择结果 |
| 3.4.2 高免鸡蛋的琼扩抗体效价监测结果 |
| 3.4.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体除脂条件的确定 |
| 3.4.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体提取方法的确定 |
| 3.4.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体外源性病毒灭活方法确定 |
| 3.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体的质量评价 |
| 3.5.1 小鹅瘟病毒卵黄抗体的理化特性 |
| 3.5.2 小鹅瘟病毒卵黄抗体的安全性评价 |
| 3.5.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体对人工感染雏鹅的治疗效果评价 |
| 3.5.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体对雏鹅注射后攻毒的预防效果评价 |
| 3.5.5 小鹅瘟病毒卵黄抗体与试验选用的同类产品差异试验 |
| 3.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体储存条件的确定 |
| 3.6.1 储存温度及时间对小鹅瘟病毒卵黄抗体物理性状的影响 |
| 3.6.2 储存温度及时间对小鹅瘟病毒卵黄抗体纯净性的影响 |
| 3.6.3 储存温度及时间对小鹅瘟病毒卵黄抗体琼扩抗体效价的影响 |
| 3.6.4 储存温度及时间对雏鹅攻毒预防效果的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 小鹅瘟病毒的分离鉴定及生物学特性分析 |
| 4.2 小鹅瘟病毒H株VP3基因序列分析 |
| 4.3 影响HA与HI效果的因素分析 |
| 4.4 小鹅瘟病毒灭活疫苗的制备 |
| 4.5 鸡群的选择管理与高免蛋黄收集 |
| 4.6 小鹅瘟病毒卵黄抗体除脂条件的确定及主要影响因素分析 |
| 4.7 最优小鹅瘟病毒卵黄抗体提取方法确定及分析 |
| 4.7.1 辛酸终浓度对小鹅瘟病毒卵黄抗体的影响 |
| 4.7.2 小鹅瘟病毒卵黄抗体提取方法的对比分析及验证 |
| 4.7.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体的琼扩抗体效价与蛋白浓度的相关性分析 |
| 4.8 小鹅瘟病毒卵黄抗体灭活条件的确定 |
| 4.9 小鹅瘟病毒卵黄抗体的质量评价 |
| 4.9.1 小鹅瘟病毒卵黄抗体安全性评价 |
| 4.9.2 小鹅瘟病毒卵黄抗体治疗效果评价 |
| 4.9.3 小鹅瘟病毒卵黄抗体的预防效果评价 |
| 4.9.4 小鹅瘟病毒卵黄抗体试验选用的同类产品差异 |
| 4.10 储存条件的确定 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
（4）GPV、NGPV VP2与转铁蛋白受体的相互作用研究及蛋白质结构预测分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 水禽细小病毒感染 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 症状及病理变化 |
| 1.1.4 鹅细小病毒病的防控 |
| 1.1.4.1 生物安全措施 |
| 1.1.4.2 免疫防控 |
| 1.1.4.3 水禽细小病毒病的治疗 |
| 1.2 转铁蛋白受体 |
| 1.2.1 转铁蛋白受体的结构 |
| 1.2.2 转铁蛋白受体的功能 |
| 1.2.2.1 转铁蛋白受体的运铁功能 |
| 1.2.2.2 转铁蛋白受体与病毒细胞相互作用机制 |
| 1.2.3 转铁蛋白受体作为病毒细胞受体的研究进展 |
| 1.2.3.1 犬细小病毒 |
| 1.2.3.2 猫泛白细胞减少症病毒 |
| 1.2.3.3 水貂肠炎病毒 |
| 1.3 病毒细胞受体的研究方法 |
| 1.3.1 酵母双杂交技术 |
| 1.3.2 GST pull-down技术 |
| 1.3.3 免疫荧光标记 |
| 1.4 研究的目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株、菌株、载体、细胞及动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要溶液的配制 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 GPV NGPV VP2 序列扩增 |
| 2.2.1.1 引物设计 |
| 2.2.1.2 DNA提取 |
| 2.2.1.3 PCR检测 |
| 2.2.1.4 PCR产物回收与克隆和测序 |
| 2.2.2 鸭、鹅Tf R序列扩增 |
| 2.2.2.1 引物设计 |
| 2.2.2.2 鸭和鹅肝脏Total RNA的提取 |
| 2.2.2.3 基因的扩增 |
| 2.2.3 序列分析和分子建模 |
| 2.2.3.1 VP2 序列分析和分子建模 |
| 2.2.3.2 TfR序列分析与结构分析 |
| 2.2.4 酵母双杂交验证 |
| 2.2.4.1 试验设计方案 |
| 2.2.4.2 质粒构建 |
| 2.2.4.3 制备酵母感受态细胞 |
| 2.2.4.4 质粒转染酵母感受态细胞 |
| 2.2.4.5 诱饵蛋白的自激活检测 |
| 2.2.4.6 酵母融合培养 |
| 2.2.4.7 阳性质粒的提取及鉴定 |
| 2.2.5 GST pull-down验证 |
| 2.2.5.1 原核表达载体的构建与表达 |
| 2.2.5.2 真核表达载体的构建与表达 |
| 2.2.5.3 GST pull-down试验验证 |
| 2.2.6 TfR蛋白多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 2.2.6.1 重组蛋白的原核表达与鉴定 |
| 2.2.6.2 蛋白纯化与蛋白浓度的测定 |
| 2.2.6.3 多克隆抗体的制备 |
| 2.2.6.4 多克隆抗体效价的测定 |
| 2.2.6.5 多克隆抗体的特异性检测 |
| 2.2.7 激光共聚焦蛋白定位分析 |
| 2.2.8 TfR多克隆抗体封闭细胞对病毒感染的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 序列结构分析 |
| 3.1.1 VP2 氨基酸同源性分析和进化分析 |
| 3.1.2 VP2 变异位点的比较与结构分析 |
| 3.1.3 TfR序列比对分析 |
| 3.1.4 TfR的结构分析 |
| 3.2 酵母双杂交验证 |
| 3.2.1 诱饵质粒构建的验证结果 |
| 3.2.2 猎物质粒构建验证结果 |
| 3.2.3 诱饵质粒转化Y2H结果 |
| 3.2.4 猎物质粒转化Y187 结果 |
| 3.2.5 诱饵蛋白VP2 自激活检测结果 |
| 3.2.6 酵母菌株融合培养结果 |
| 3.2.7 阳性质粒的鉴定 |
| 3.3 GST pull-down验证试验 |
| 3.3.1 原核表达质粒的构建与表达 |
| 3.3.2 真核表达质粒的构建与表达 |
| 3.3.3 GST-Pull down试验结果 |
| 3.4 TfR蛋白多克隆抗体的制备与鉴定 |
| 3.4.1 重组质粒pET-32a-TfR O的构建验证结果 |
| 3.4.2 TfR蛋白表达和纯化结果 |
| 3.4.3 纯化后Tf R蛋白浓度的测定 |
| 3.4.4 TfR多克隆抗体效价的测定结果 |
| 3.4.5 TfR多克隆抗体特异性检测结果 |
| 3.5 激光共聚焦蛋白定位分析 |
| 3.6 TfR多克隆抗体封闭细胞降低病毒感染 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 7 致谢 |
| 8 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（5）鹅细小病毒对雏鸭免疫器官损伤的初步研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 文献综述 |
| 1.鹤细小病毒概述 |
| 2.病原学 |
| 3.实验室诊断 |
| 4.GPV感染对免疫系统的影响 |
| 5.小鹅瘟的防治 |
| 6.研究目的与意义 |
| 引言 |
| 1.材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病料及毒株 |
| 1.1.2 实验动物 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 主要试剂的配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鹅细小病毒的鉴定 |
| 1.2.2 12例GPV和2例NGPV的VP基因测序 |
| 1.2.3 AH-1毒株ELD_(50)测定 |
| 1.2.4 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1.2.5 雏鸭致病性试验 |
| 1.2.6 病理组织观察 |
| 2.结果 |
| 2.1 鹅细小病毒的PCR鉴定及电镜观察 |
| 2.2 AH-1毒株ELD_(50)测定 |
| 2.3 12例GPV病例和2例NGPV的基因测序 |
| 2.3.1 VP基因测序 |
| 2.3.2 ITR基因测序 |
| 2.4 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR |
| 2.4.1 pMD-18-T-VP3质粒的构建及鉴定 |
| 2.4.2 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR标准曲线 |
| 2.4.3 SYBR Green I荧光定量PCR的特异性检测 |
| 2.5 SYBR Green I荧光定量PCR应用检测 |
| 2.5.1 人工感染雏鹅的临床症状 |
| 2.5.2 SYBR Green I荧光定量PCR检测雏鹅组织脏器的病毒含量 |
| 2.6 AH-1病毒株对雏鸭致病性试验 |
| 2.6.1 临床症状 |
| 2.6.2 SYBR Green I荧光定量PCR定量检测雏鸭组织脏器的病毒含量 |
| 2.6.3 间接免疫荧光检测GPV在雏鸭免疫细胞中的位置 |
| 2.6.4 雏鸭免疫器官的病理组织学观察及抗原定位 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 abstract 1 引言 |
| 1.1 水禽细小病毒病原学研究进展 |
| 1.1.1 分类地位 |
| 1.1.2 形态特征及理化特性 |
| 1.1.3 宿主范围及培养特性 |
| 1.1.4 分子生物学特征 |
| 1.2 水禽细小病毒流行病学研究进展 |
| 1.2.1 主要临床症状及病理变化 |
| 1.2.2 诊断方法 |
| 1.2.3 防制 |
| 1.3 研究目的及意义 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、临床样品和实验动物 |
| 2.1.2 主要分子生物学试剂和常用生化试剂 |
| 2.1.3 细胞培养溶液 |
| 2.1.4 工程菌培养及质粒转化用溶液 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 病原的PCR检测及纯净性检测 |
| 2.2.2 SD株鸭胚毒的分离与鉴定 |
| 2.2.3 动物回归试验 |
| 2.2.4 SD株细胞毒的分离与鉴定 |
| 2.2.5 SD株全基因组各片段重组质粒的构建 |
| 2.2.6 SD株全基因组序列的拼接及分析 |
| 2.2.7 荧光定量PCR引物及探针的设计 |
| 2.2.8 PCR反应体系的优化及标准曲线的绘制 |
| 2.2.9 荧光定量PCR检测方法的验证 3 结果与分析 |
| 3.1 DPVSD株的分离与鉴定 |
| 3.1.1 发病鸭的流行病学及临床特征 |
| 3.1.2 病原PCR检测及纯净性检测结果 |
| 3.1.3 鸭胚分离毒PCR鉴定结果 |
| 3.1.4 EID50测定结果 |
| 3.1.5 动物回归试验结果 |
| 3.1.6 细胞分离毒PCR鉴定结果 |
| 3.1.7 细胞分离毒IFA检测结果 |
| 3.2 DPVSD株全基因组序列的测定与分析 |
| 3.2.1 各片段PCR电泳结果 |
| 3.2.2 全基因组序列特征分析 |
| 3.2.3 NS基因序列特征分析 |
| 3.2.4 VP基因序列特征分析 |
| 3.2.5 ITR区序列特征分析 |
| 3.2.6 潜在糖基化位点预测分析 |
| 3.3 DPVTaq-Man实时荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.3.1 Taq-Man实时荧光定量PCR引物的验证 |
| 3.3.2 标准品的制备 |
| 3.3.3 反应体系的优化结果 |
| 3.3.4 标准曲线的绘制 |
| 3.3.5 特异性试验结果 |
| 3.3.6 敏感性试验结果 |
| 3.3.7 重复性试验结果 |
| 3.3.8 临床样品检测结果 4 讨论 |
| 4.1 DPVSD株的分离与鉴定 |
| 4.2 DPVSD株基因组全序的测定与分析 |
| 4.3 DPVTaq-Man实时荧光定量PCR检测方法的建立 5 结论 参考文献 在读期间发表的学术论文 作者简介 致谢 中文详细摘要 |
（7）鸭短喙与侏儒综合征的病原学及感染鸭喙的转录组学（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 缩略词表 第一章 |
| 引言 1.1 |
| 水禽细小病毒病概述 1.2 |
| GPV的形态结构与分类 1.3 |
| GPV的培养特性 1.4 |
| GPV的致病性 1.5 |
| GPV的分子生物学研究进展 1.6 |
| GPV感染的诊断 1.7 |
| GPV的防治策略 1.8 |
| 基因差异表达与喙部发育 1.9 |
| 转录组分析 1.10 |
| 研究的目的和意义 1.11 |
| 研究内容与技术路线 第二章 |
| 鸭短喙与侏儒综合征的病原学、流行病学和预防 2.1 |
| 前言 2.2 |
| 材料 2.3 |
| 方法 2.4 |
| 结果 2.5 |
| 讨论 2.6 |
| 小结 第三章 |
| 北京鸭源和鹅源GPV变异位点分析 3.1 |
| 前言 3.2 |
| 材料 3.3 |
| 方法 3.4 |
| 结果 3.5 |
| 讨论 3.6 |
| 小结 第四章 |
| 北京鸭源和鹅源GPV对北京鸭的致病性比较 4.1 |
| 前言 4.2 |
| 材料 4.3 |
| 方法 4.4 |
| 结果 4.5 |
| 讨论 4.6 |
| 小结 第五章 |
| 北京鸭源和鹅源GPV对雏鹅的致病性比较 5.1 |
| 前言 5.2 |
| 材料 5.3 |
| 方法 5.4 |
| 结果 5.5 |
| 讨论 5.6 |
| 小结 第六章 |
| 感染GPV北京鸭喙的转录组分析 6.1 |
| 前言 6.2 |
| 材料 6.3 |
| 方法 6.4 |
| 结果 6.5 |
| 讨论 6.6 |
| 小结 结论 创新点 参考文献 致谢 个人简介 |
（8）新型鹅细小病毒检测方法的建立及流行病学调查（论文提纲范文）
| 中文摘要 英文摘要 1 前言 |
| 1.1 鸭短喙侏儒综合征概述 |
| 1.2 鹅细小病毒概述 |
| 1.2.1 GPV基因组结构特征 |
| 1.2.2 GPV基因编码蛋白功能 |
| 1.2.3 GPV形态特征及理化特性 |
| 1.3 GPV宿主范围及培养特性 |
| 1.4 GPV实验室诊断 |
| 1.4.1 临床症状及剖检变化 |
| 1.4.2 分子生物学方法 |
| 1.4.3 血清学方法 |
| 1.5 GPV免疫学研究 |
| 1.6 鸭圆环病毒 |
| 1.6.1 鸭圆环病毒生物学特性 |
| 1.6.2 致病机理 |
| 1.6.3 DuCV检测方法 |
| 1.7 研究目的与意义 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒(菌)株及鸭胚 |
| 2.1.2 实验样本来源 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.5 常规试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 检测传统GPV与NGPV的双重半套式PCR方法的建立 |
| 2.2.2 新型鹅细小病毒核酸探针的制备及应用 |
| 2.2.3 新型鹅细小病毒的分离及基因组分析 |
| 2.2.4 NGPV与DuCV混合感染的调查 3 结果与分析 |
| 3.1 双重半套式PCR方法的建立及应用 |
| 3.1.1 双重半套式PCR方法的最佳反应条件 |
| 3.1.2 双重半套式PCR方法的特异性试验结果 |
| 3.1.3 双重半套式PCR方法的灵敏性试验结果 |
| 3.1.4 双重半套式PCR方法的应用 |
| 3.2 NGPV核酸探针的制备及临床应用 |
| 3.2.1 探针PCR制备结果 |
| 3.2.2 pGPV探针灵敏性试验结果 |
| 3.2.3 pGPV探针特异性试验结果 |
| 3.2.4 地高辛标记的pGPV探针对临床病料的检测 |
| 3.2.5 核酸探针对不同地区樱桃谷鸭检测结果 |
| 3.2.6 核酸探针对病鸭不同组织脏器的检测结果 |
| 3.3 NGPV的分离及病毒基因组分析 |
| 3.3.1 NGPV的分离及基因组扩增 |
| 3.3.2 NGPV反向重复区域分析 |
| 3.3.3 NGPV功能蛋白中同步变异位点 |
| 3.3.4 NGPV衣壳蛋白中同步变异位点 |
| 3.3.5 NGPV全基因组及Rep蛋白和Cap蛋白进化树构建 |
| 3.3.6 NGPVRep蛋白和Cap蛋白二级结构分析 |
| 3.3.7 NGPV功能蛋白分析及三维结构构建 |
| 3.3.8 7株NGPV毒株的重组性分析 |
| 3.4 NGPV与DuCV混合感染的研究 |
| 3.4.1 不同鸭场NGPV与DuCV混感的统计 |
| 3.4.2 鸭胚中NGPV与DuCV混感的检测 |
| 3.4.3 DuCV-1和DuCV-2在病料的检出率统计 |
| 3.4.4 NGPV和DuCV在NGPV阳性鸭不同脏器的检测 |
| 3.4.5 DuCV全基因组的扩增 |
| 3.4.6 DuCV基因组分析及进化树的构建 4 讨论 |
| 4.1 双重半套式PCR方法与核酸探针方法的建立及应用 |
| 4.2 NGPV全基因组分析 |
| 4.3 NGPV与DuCV混合感染研究 5 结论 参考文献 致谢 攻读学位期间发表学术论文情况 |
（9）水禽细小病毒的分离鉴定及VP3-ELISA方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章前言 |
| 1.1 细小病毒概述 |
| 1.2 水禽细小病毒的概况 |
| 1.2.1 GPV概况 |
| 1.2.2 MDPV概况 |
| 1.3 病毒生物学特征 |
| 1.3.1 水禽细小病毒的分类特征 |
| 1.3.2 形态特点和理化特征 |
| 1.3.3 宿主范围与培养特性 |
| 1.3.4 血凝特性 |
| 1.3.5 血清型 |
| 1.4 细小病毒成员之间的关系 |
| 1.4.1 GPV和MDPV之间的关系 |
| 1.4.2 与其他细小病毒的关系 |
| 1.5 分子生物学特性 |
| 1.5.1 基因组结构和功能 |
| 1.5.2 基因编码非结构蛋白和结构蛋白 |
| 1.6 流行病学及临床症状 |
| 1.6.1 GPV |
| 1.6.2 MDPV |
| 1.7 GPV和MDPV的诊断 |
| 1.7.1 病原的分离和鉴定 |
| 1.7.2 直接检查病毒抗原 |
| 1.7.3 电镜检查 |
| 1.7.4 分子生物学鉴定 |
| 1.7.5 血清学诊断方法 |
| 1.8 防控措施 |
| 1.8.1 管理措施 |
| 1.8.2 免疫接种 |
| 1.8.3 治疗措施 |
| 1.9 单克隆抗体技术及其研究进展 |
| 1.10 ELISA方法的研究进展 |
| 1.11 本研究的目的和意义 |
| 第二章水禽细小病毒的流行病学调查及分离鉴定 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病料来源 |
| 2.1.2 动物回归试验攻毒毒株 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 质粒、菌株 |
| 2.1.5 试剂及耗材 |
| 2.1.6 主要实验仪器 |
| 2.1.7 培养基和试剂配置 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 南方部分省份鸭场GPV及MDPV发病情况调查 |
| 2.2.2 病毒分离与鉴定 |
| 2.2.3 动物回归试验 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 病毒的分离 |
| 2.3.2 电镜观察 |
| 2.3.3 PCR鉴定 |
| 2.3.4 病料的实验室PCR鉴定结果与统计分析 |
| 2.3.5 动物回归实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章水禽细小病毒全基因克隆及序列分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株 |
| 3.1.2 质粒和菌株 |
| 3.1.3 试剂及耗材 |
| 3.1.4 主要实验仪器 |
| 3.1.5 培养基和试剂配置 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 细小病毒总DNA的提取 |
| 3.2.2 引物的设计与合成 |
| 3.2.3 细小病毒DNA的退火 |
| 3.2.4 DNA的酶切 |
| 3.2.5 PCR扩增 |
| 3.2.6 PCR扩增产物的回收和纯化 |
| 3.2.7 PCR纯化产物与载体连接 |
| 3.2.8 连接产物转化感受态细胞 |
| 3.2.9 阳性菌落的筛选和鉴定 |
| 3.2.10 测序与序列拼接 |
| 3.2.11 基因组进化分析 |
| 3.2.12 全基因重组分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 全基因分段克隆结果 |
| 3.3.2 全基因序列分析和进化分析 |
| 3.3.3 全基因重组分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 MDPV-VP3蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒 |
| 4.1.2 血清 |
| 4.1.3 菌株与载体 |
| 4.1.4 细胞及实验动物 |
| 4.1.5 主要试剂及耗材 |
| 4.1.6 主要实验仪器 |
| 4.1.7 培养基和试剂配置 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 番鸭细小病毒的增殖 |
| 4.2.2 细小病毒DNA的提取 |
| 4.2.3 引物的设计与合成 |
| 4.2.4 PCR扩增 |
| 4.2.5 PCR扩增产物的回收和纯化 |
| 4.2.6 回收的VP3片段，pCzn1质粒的双酶切及纯化 |
| 4.2.7 pCzn1‐ VP3重组质粒的构建与鉴定 |
| 4.2.8 pCzn 1‐ VP3重组质粒转化至大肠杆菌Arctic Express |
| 4.2.9 pCzn 1‐ VP3融合蛋白诱导表达与可溶性分析 |
| 4.2.10 SDS-PAGE分析蛋白的表达 |
| 4.2.11 His-VP3包涵体蛋白的变复性 |
| 4.2.12 Ni柱亲和纯化融合蛋白 |
| 4.2.13 Western-blot分析重组蛋白的反应原性 |
| 4.2.14 用Bradford的方法测定纯化的His-VP3蛋白浓度 |
| 4.2.15 单克隆抗体的制备 |
| 4.2.16 单克隆抗体的鉴定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 VP3基因的扩增 |
| 4.3.2 菌液PCR鉴定 |
| 4.3.3 重组质粒pCzn 1‐ VP3双酶切鉴定 |
| 4.3.4 融合蛋白His-VP3的表达分析 |
| 4.3.5 融合蛋白His-VP3的变复性及纯化分析 |
| 4.3.6 Western Blot检测重组蛋白反应原性 |
| 4.3.7 用Bradford的方法测定蛋白浓度 |
| 4.3.8 小鼠免疫及小鼠血清效价检测 |
| 4.3.9 融合后细胞上清效价检测 |
| 4.3.10 亚克隆细胞定株 |
| 4.3.11 腹水效价的检测 |
| 4.3.12 单克隆抗体纯化 |
| 4.3.13 单克隆抗体的亚型鉴定 |
| 4.3.14 单克隆抗体效价的测定 |
| 4.3.15 用Bradford的方法测定纯化单抗浓度 |
| 4.3.16 单克隆抗体的Western Blot鉴定 |
| 4.3.17 单克隆抗体的特异性鉴定 |
| 4.3.18 间接免疫荧光实验（IFA）鉴定单抗 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 MDPV VP3-ELISA检测方法的建立 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 血清 |
| 5.1.2 主要试剂及耗材 |
| 5.1.3 主要实验仪器 |
| 5.1.4 培养基和试剂配置 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 MDPV VP3-ELISA抗体检测方法的建立 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 间接ELISA方法的建立 |
| 5.4 讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 硕士期间所获奖励和论文发表情况 |
（10）新型鹅细小病毒VP3抗体特异性ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 第1章 文献综述 |
| 1.1 鹅细小病毒流行现状 |
| 1.2 鹅细小病毒的特性 |
| 1.2.1 GPV形态结构和理化特性 |
| 1.2.2 宿主范围和培养特性 |
| 1.2.3 临床症状及病理特性 |
| 1.2.4 GPV的基因结构 |
| 1.2.5 GPV编码蛋白及功能 |
| 1.3 鹅细小病毒诊断方法的研究进展 |
| 1.3.1 病原学诊断 |
| 1.3.2 分子生物学诊断 |
| 1.3.3 血清学诊断 |
| 1.4 鹅细小病毒病的防治 |
| 1.5 本研究的目的和意义 第2章 鹅细小病毒VP3蛋白的原核表达 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 菌种和载体 |
| 2.1.2 酶和试剂 |
| 2.1.3 各种溶液及培养基 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鹅细小病毒的分离鉴定 |
| 2.2.2 鹅细小病毒VP3蛋白的原核表达 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 鹅细小病毒的分离鉴定 |
| 2.3.2 原核表达载体pET32a-VP3的构建 |
| 2.3.3 目的蛋白的表达 |
| 2.4 讨论 第3章 鹅细小病毒VP3蛋白的纯化与鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 酶和试剂 |
| 3.1.2 各种溶液 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 VP3蛋白包涵体的提取 |
| 3.2.2 包涵体粗纯化 |
| 3.2.3 VP3蛋白N i柱亲和层析 |
| 3.2.4 重组VP3蛋白Western-blot分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 包涵体粗纯化 |
| 3.3.2 VP3蛋白N i柱亲和层析 |
| 3.3.3 重组VP3蛋白Western-blot分析 |
| 3.4 讨论 第4章 间接ELISA方法的建立及评价 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 病毒和血清 |
| 4.1.2 试剂及溶液 |
| 4.1.3 主要设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 间接ELISA方法步骤 |
| 4.2.2 间接ELISA方法条件的优化 |
| 4.2.3 间接ELISA方法的评价 |
| 4.2.4 血清样品的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 间接ELISA方法的建立 |
| 4.3.2 临界值的确定 |
| 4.3.3 特异性试验 |
| 4.3.4 敏感性试验 |
| 4.3.5 重复性试验 |
| 4.3.6 间接ELISA方法敏感性与符合率试验 |
| 4.4 讨论 结论 参考文献 致谢 攻读学位期间取得的科研成果 |
四、鹅细小病毒和番鸭细小病毒核酸疫苗重组质粒的构建及表达（论文参考文献）
- [1]江苏地区小鹅瘟流行病学调查及其细胞适应毒研究[D]. 姜煜晨. 扬州大学, 2021(02)
- [2]鹅细小病毒成纤维细胞适应株的培育及细胞适应的分子基础[D]. 秘清灵. 扬州大学, 2021(02)
- [3]抗H株小鹅瘟病毒卵黄抗体的研制与质量评估[D]. 胡瑞鸿. 东北农业大学, 2020(07)
- [4]GPV、NGPV VP2与转铁蛋白受体的相互作用研究及蛋白质结构预测分析[D]. 孙洁. 山东农业大学, 2020(12)
- [5]鹅细小病毒对雏鸭免疫器官损伤的初步研究[D]. 杨程程. 安徽农业大学, 2019(05)
- [6]鸭细小病毒SD株分离与鉴定及基因组特征分析[D]. 崔元. 河北农业大学, 2018(12)
- [7]鸭短喙与侏儒综合征的病原学及感染鸭喙的转录组学[D]. 宁康. 中国农业大学, 2018(12)
- [8]新型鹅细小病毒检测方法的建立及流行病学调查[D]. 李鹏飞. 山东农业大学, 2018(09)
- [9]水禽细小病毒的分离鉴定及VP3-ELISA方法的建立[D]. 苏晓娜. 华南农业大学, 2017(08)
- [10]新型鹅细小病毒VP3抗体特异性ELISA检测方法的建立[D]. 王燕. 河北大学, 2017(01)