导读:本文包含了卤醇脱卤酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:卤醇脱卤酶,1-氯-3-苯氧基-2-丙醇,催化,工艺
卤醇脱卤酶论文文献综述
亚香菊,王于齐,朱鑫海,经玉洁,林茜[1]（2019）在《卤醇脱卤酶催化合成(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的工艺优化》一文中研究指出以卤醇脱卤酶重组湿菌体E. coli BL21(pET28a-HHDH)为催化剂,催化外消旋的1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的动力学拆分可以获得光学纯的(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇。本文系统地研究了卤醇脱卤酶催化合成光学纯(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的影响因素,对反应pH、反应温度、菌体浓度、亲核试剂N3-浓度和底物浓度进行了探究。结果表明,卤醇脱卤酶催化合成(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的最佳工艺条件为:pH为7.0,反应温度为28℃,菌体浓度为22.5g/L,亲核试剂NaN3的浓度为50mmol/L,底物外消旋1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的浓度为10mmol/L。在此工艺条件下,(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的ee值和收率分别为100%和16.97%。(本文来源于《化工进展》期刊2019年08期）
亚香菊[2]（2019）在《卤醇脱卤酶的基因挖掘、催化性能及其分子改造研究》一文中研究指出卤醇脱卤酶能够在温和条件下催化邻卤醇脱卤和环氧化物的开环,在手性环氧化物和β-取代醇的合成方面具有极大的应用潜力。但是到目前为止立体选择性优异的卤醇脱卤酶仅有HheC,为了满足应用的需求,开发新型高效、选择性好、活性高的生物催化剂,已经成为卤醇脱卤酶工业应用基础研究的重点研究方向。本文首先以HheC和HheB为基因探针,通过基因挖掘法获得了10种潜在的卤醇脱卤酶基因,其中9种在大肠杆菌中成功表达。以苯基缩水甘油醚((R,S)-PGE)为模式底物,通过显色反应和高效液相色谱检测比较,筛选获得3种高活性且具有不同选择性的卤醇脱卤酶;经引入组氨酸标签后,确定了一种来源于菌株Pseudomonas pohangensis的HHDH_(His)10作为后续研究对象,其与HheB的同源性为44%,与HheC的同源性为31%,并对(R,S)-PGE表现出R选择性。通过Ni-NTA柱纯化目标蛋白,并对其酶学性质进行研究。其最适脱卤反应温度为40℃,最适脱卤反应pH为10.0,最适开环反应pH为7.5,该酶在pH6.0-7.5范围内和温度低于50℃时具有较好的稳定性。HHDH_(His)10具有较广的底物谱,对多种卤代醇和环氧化物表现出较好的活性及对映选择性。该酶对底物(R,S)-PGE的K_m为31.75 mM,V_(max)为32.79μmol·min~(-1)·mg~(-1)。HHDH_(His)10对(R,S)-PGE表现出较好的对映选择性,在20 mM的底物浓度下,获得的(S)-PGE的ee值和收率分别为>99%和16.35%;在pH 7.5和pH 8.0条件下,HHDH_(His)10催化拆分1-氯-3-苯氧基-2-丙醇(7)的单酶串联反应中,获得的(R)-7的ee值均可达>99%,收率约为25%。为提高酶的立体选择性,尝试对酶进行半理性设计改造,利用同源建模和分子对接技术,选定底物结合口袋附近的6个氨基酸残基(Gln159、Asn160、Phe161、Tyr167、Phe168和Pro169)进行定点饱和突变和组合突变。以(R,S)-PGE为模式底物,通过高效液相色谱检测,获得3个立体选择性提高的突变体,分别是Q159L、N160L和P169Q,其对映体选择率分别约从9.85提高到21.80,21.10和10.84,其中突变体N160L的选择性和原始酶是相反的。我们还尝试对突变体进行迭加突变,但是并未检测到选择性提高的阳性突变体。利用亲和层析分离纯化突变体N160L和Q159L,结果发现突变后的酶活相比较于原始HHDH_(His)10明显降低,分别为原始酶的56.75%和47.45%。通过对突变体N160L与Q159L的环氧化物底物谱进行研究,两突变体除了对底物邻乙基苯基缩水甘油醚(12)和苯基环氧乙烷(16)选择性没有提高以外,对于其它底物的选择性均有一定程度的提高,尤其是突变体N160L对底物对甲基苯基缩水甘油醚(11)的E值提高到了25.77,是原始HHDH_(His)10的13.93倍。对突变体N160L与原始HHDH_(His)10对映选择性相反的机理进行分析,结果表明:通过将突变体N160L与(R)-PGE和(S)-PGE分子对接发现,两个氨基酸残基Ser116和Tyr129与(R)-PGE和(S)-PGE底物的氧原子之间形成的氢键的距离不同,导致发生作用的作用力存在差异,从而出现了构型逆转的现象。利用突变体N160L动力学拆分(R,S)-PGE(20-200 mM),获得(R)-PGE的最大ee值可达>99%,收率最高达到30.92%。(本文来源于《江苏科技大学》期刊2019-05-29）
霍姣[3]（2019）在《卤醇脱卤酶的酶学性质及其进化的研究》一文中研究指出卤醇脱卤酶通过分子内亲核取代机制催化邻卤醇脱卤生成手性环氧化物,并可以在不同非自然亲核试剂介导下催化环氧化物开环生成手性?-取代醇。因此卤醇脱卤酶可用于手性环氧化物和手性?-取代醇等一类高价值手性药物中间体的合成。此外,卤醇脱卤酶也可以降解异生质卤化物,在环境治理方面也有着较高的应用价值。在本研究中主要是对新发现的卤醇脱卤酶HHDH_(XF2)高效表达、酶学特性、分子改造及其应用方面进行研究,具体成果如下:(1)通过实验研究发现卤醇脱卤酶HHDH_(XF2)的最佳表达条件为:当OD_(600)=1.0时加入终浓度为0.05 mmol/L的IPTG并在24℃,150 rpm的诱导条件下诱导10 h,卤醇脱卤酶所表达出的酶活最高可达1438.25 U/mL。(2)研究卤醇脱卤酶HHDH_(XF2)以1,3-二氯-2-丙醇为底物时的酶学特性,通过研究发现其最适反应温度为47℃,最适反应pH为8.67,且该酶在35-40℃范围内较稳定,且当Zn~(2+)的浓度为0.8 mmol/L时对催化反应具有较好的促进作用,该酶对1,3-二氯-2-丙醇的动力学参数K_m=0.035 mmol/L,最大反应速率V_(max)=0.0025mol/min。(3)对卤醇脱卤酶HHDH_(XF2)采用易错PCR进行定向进化构建突变文库,并采用比色法对突变文库进行筛选,最终筛选到一株立体选择性提高6.6倍的阳性突变体。(4)在研究卤醇脱卤酶HHDH_(XF2)催化1,3-二氯-2-丙醇生成环氧氯丙烷时,发现最佳催化条件为:最适pH=8.34,最适温度为45℃,底物浓度为30 mmol/L,在此条件下转化2 h后,1,3-二氯-2-丙醇的最高转化率可达89.4%。通过实验研究发现卤醇脱卤酶HHDH_(XF2)对高效氯氰菊酯具有降解作用,当降解温度为45℃时降解2 h后高效氯氰菊酯的降解率可以达到41.2%。(本文来源于《武汉科技大学》期刊2019-05-01）
亚香菊,王于齐,朱鑫海,经玉洁,林茜[4]（2019）在《来源于Xylophilus ampelinus的卤醇脱卤酶的克隆表达及应用》一文中研究指出卤醇脱卤酶可以高对映选择性地催化环氧化物和邻卤醇之间的相互转化,用于合成各种光学纯的卤代醇、环氧化物和β-取代醇。利用数据库挖掘技术,从Xylophilus ampelinus中获得一种新型卤醇脱卤酶HHDH-Xa基因,对其进行了克隆,以pET-28a(+)作为表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了高效重组表达。序列分析结果表明,该片段包含681个核苷酸,编码226个氨基酸。SDS-PAGE分析结果表明,该酶的分子量约为25kDa。底物特异性研究发现,该酶具有较宽的底物谱,分别对苯基缩水甘油醚和1,3-二溴-2-丙醇表现出了较高的活性。卤醇脱卤酶HHDH-Xa催化1-氯-3-苯氧基-2-丙醇的生物级联反应可以获得光学纯的(R)-1-氯-3-苯氧基-2-丙醇及相应的1-迭氮-3-苯氧基-2-丙醇。(本文来源于《化学与生物工程》期刊2019年02期）
王露,徐刚,杨立荣,吴坚平[5]（2018）在《迭代饱和突变提高卤醇脱卤酶HheA_(AM)催化制备6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的酶活》一文中研究指出(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(A7)是合成降血脂药物阿托伐他汀钙的关键手性中间体,利用卤醇脱卤酶催化(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯(D3)的脱卤氰化反应制备A7是很有潜力的合成方法。现有研究存在的主要问题是卤醇脱卤酶种类少,对底物D3的催化活性很低,且鲜见有关脱卤酶分子改造提高其对D3催化活性的报道。本研究利用基因挖掘技术获得了一个对D3表现出较高催化活力的卤醇脱卤酶HheA_(AM) (来源于Agromycesmediolanus sp.),运用定向进化和半理性设计方法确定了4个影响酶活的关键位点(84、88、136、144位),然后使用迭代饱和突变(ISM)策略对这4个位点进行组合突变,突变株M4-HheA_(AM)(84S-88L-136T-144C)的比酶活为0.89U·mg-1,是野生型HheA_(AM)(Wt-HheA_(AM))的13倍,对D3的催化活性得到了显着的提高。(本文来源于《高校化学工程学报》期刊2018年05期）
王露[6]（2018）在《分子改造提高卤醇脱卤酶HheA_(AM)催化制备(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的酶活》一文中研究指出(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(A7)是降血脂药物阿托伐他汀钙的关键手性中间体,利用卤醇脱卤酶催化(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯(D3)的脱卤氰化反应制备A7是很有潜力的合成方法。现有研究存在的主要问题是适用的卤醇脱卤酶种类少,对底物D3的催化活性很低,且鲜见有关卤醇脱卤酶分子改造提高其对D3催化活性的报道。本研究以D3为目标底物,对卤醇脱卤酶进行了筛选和分子改造,主要结果如下:(1)利用基因挖掘技术建立了 一个卤醇脱卤酶酶库,筛选获得了 一个对D3具有较高催化活力的卤醇脱卤酶HheAAM(来源于Agromyces mediolanus sp.),其全细胞催化反应酶活为13 U.L-1,比酶活为69.06 U·g-1,高于现有报道的HheC类卤醇脱卤酶HHDH和Mut-HheC2360;(2)分别利用定向进化和半理性设计方法对HheAAM进行改造:通过易错PCR方法筛选得到6个阳性突变体,均在84/88位发生突变,对84位和88位进行定点饱和突变得到另外9个阳性突变体,突变体酶活分别为Wt-HheAAM的1.32-3.46倍;根据分子对接结果对底物结合区域附近的位点进行定点饱和突变,得到4个在136/144位发生突变的阳性突变体,酶活分别为Wt-HheAAM的1.78-3.13 倍;(3)分别利用迭代饱和突变(ISM)和CASTing策略对4个关键位点(84,88,136,144位)进行组合突变:前者筛选得到14个阳性突变体,酶活分别为Wt-HheAAM的1.78-15.19倍;后者筛选得到19个阳性突变体,酶活分别为Wt-HheAAM的 1.03-11.98 倍。其中最优突变体 M4-1(84S-88L-136T-144C)的比酶活为887.80 U.g-1,是Wt-HheAAM的13倍,对D3的催化活性得到了显着的提高。同时,M4-1的最适反应pH由7.5变为8.0,最适反应温度由55℃变为60℃,50℃下的半衰期(t1/2,50℃)由 0.87h变为 2.38h。(本文来源于《浙江大学》期刊2018-05-04）
仝亚沛[7]（2018）在《卤醇脱卤酶HheC卤离子结合区域氨基酸的功能探究》一文中研究指出卤醇脱卤酶又称卤代醇脱卤素酶(HHDHs),催化邻卤醇的碳-卤键裂解进而生成相应的环氧化物。它们也可以在亲核试剂如氰化物,迭氮化物和亚硝酸根离子存在的情况下催化其逆反应,生成β-取代醇。HHDHs已被公认为降解环境污染物有机卤化物的理想工具。同时,他们还可作为生物催化剂用于卤代醇和环氧化物的动力学拆分,并用于制备各种光学纯β-取代醇。卤醇脱卤素酶HheC的活性中心由四个柔性loop区域组成,其中P175-P188的loop3区域为卤离子结合区域,该区域在酶行使催化功能中起着关键作用。动力学研究表明卤离子的释放为酶促催化邻卤醇脱卤的决速步骤,并且卤离子的释放过程伴随着活性位点构象的变化,说明P175-P188碳骨架的柔性对于酶的活性至关重要,但是目前尚未对该区域进行过系统的研究。因此,为了探究卤离子结合区域氨基酸的功能,本论文对该区域以及与loop3有密切关联的F12位的功能进行了系统地研究。首先利用丙氨酸扫描技术对loop3中各个位点对活性和对映体选择性的影响进行了系统分析。对模式底物1,3-DCP和rac-2-CPE的检测结果显示:(1)H179A,E181A,D182A,P184A在催化活性以及对映体选择性上与野生型相比,没有很大的差异,暗示这几个位点在酶行使催化功能时是非必须的;(2)N176位点的动力学拆分结果显示,N176A位点的对映体选择性发生逆转(由R型偏好,转变为S型偏好),表明该位点可能对HheC立体选择性有着重要的调控作用;(3)P175A位点表现出底物的偏好性。其他位点的突变体活性基本完全丧失,表明这些位点在酶行使催化功能的重要性。基于此,后续对上述关键位点P175,N176,Y177,L178,S180,E181,D182,S183,Y185,F186,Y187和F12Y进行了深入的研究。为了进一步探究loop3中关键位点的功能,对上述氨基酸进行了饱和突变体文库构建及筛选,以及相应的活性及对映体选择性等分析。实验结果表明:(1)N176,Y185、F186、Y187以及F12位点对HheC的对映体选择性具有重要的调控能力。(2)S180、S183和P188位点,所有类型的突变体都不具有任何活性,凝胶过滤结果显示,这叁个位点突变为丙氨酸后大部分蛋白处于聚集或解聚状态,因此这叁个位点在维持酶的结构中起到非常关键的作用。(3)P175位点以及N176位点,大部分突变体对1,3-DCP都保留有活性,但是对rac-2-CP-E和PNSHH的活性却大部分都丧失,说明这两个位点在不同底物的催化反应上存在着偏好性。(4)177、185、186、187以及F12这些位点只有突变为F和Y,相应的突变体才有活性,替换成其他类型的氨基酸使突变体的活性大幅度地下降。表明了这些氨基酸对维系卤离子结合位点疏水环境的重要作用。同时,突变体177F/185F/186Y/187F的催化活性较野生型HheC有4.5倍的提升。因此Y177、Y185、F186、Y187和F12位的芳香环侧链与周围的氨基酸之间的疏水相互作用力,是酶进行高效催化的重要因素之一。(本文来源于《电子科技大学》期刊2018-04-01）
辛东民[8]（2017）在《应用红外光谱检测卤醇脱卤酶催化活性及初步研究其催化过程的结构基础》一文中研究指出卤醇脱卤酶HheC既能催化邻卤醇碳-卤键断裂生成还氧化物,也可以在多种亲核试剂介导下催化还氧化物发生开环反应生成相应的β-取代醇。因此,该酶在降解环境有机卤化物污染物和生产手性药物中间体等领域具有重要作用。但野生态的卤醇脱卤酶在实际应用中存在一定弊端,对卤醇脱卤酶进行定向改造和突变体文库的筛选成为该领域的重要工作。为此,一种快速、灵敏的文库筛选方法的建立就显得尤为重要。目前对于检测卤醇脱卤酶催化邻卤醇脱卤的筛选方法较为成熟,但方便可靠的开环反应检测方法暂无报导。由于卤醇脱卤酶HheC在催化环氧化物开环反应中的各种亲核试剂N3-(N=N=N)、CN-(C=N)、OCN-(O=C=N)、SCN-(S=C=N)具有区别于蛋白酰胺I带的特征红外吸收峰,原则上红外光谱技术可以用来检测卤醇脱卤酶催化环氧化物开环反应活性。基于此,本论文以HheC催化迭氮介导的CHBE(全称及中文名)环氧化物开环反应作为模式反应体系,建立一种基于傅里叶变换红外(FTIR)技术的卤醇脱卤酶的酶活检测方法。首先在酶促反应条件下检测游离N3-及其开环产物迭氮取代醇所对应的伸缩振动峰位置,分别在2048cm-1和2115cm-1波数处,同时分别制作两种化合物的标准曲线,均与峰面积具有较好的线性关系;通过在酶促反应中检测2048cm-1和2115cm-1波数处吸光度随时间变化的曲线,得出底物NaN3及产物4-迭氮-3-羟基丁酸乙酯浓度随时间变化的曲线,进而计算得到卤醇脱卤酶的比酶活为0.19 U/mg。同时我们也对其它5种环氧化物的酶活性进行了检测,结果均与气相色谱法(GC)所测得的值接近。表明应用FTIR方法进行卤醇脱卤酶酶活检测切实可行。与传统的GC方法相比,该检测手段具有连续、直观、实时、快速等优势。红外光谱技术能灵敏感知酶与底物结合过程中引起的微小结构变化,在研究酶催化反应结构动力学的研究领域具有较大的优势,我们尝试着应用该技术来研究卤醇脱卤酶催化反应过程中的结构变化。研究结果表明:在有和没有N3-基团存在时,卤醇脱卤酶的红外吸收峰位置及峰面积均没有明显变化。结合该酶前期的相关研究结果,可能是由于N3-基团的红外吸收较弱以及结合有N3-基团的卤醇脱卤酶所占的比例较低造成的。通过提高底物和酶的浓度,没有得到预期的结果,为此,我们拟通过引入其他可能的红外探针来解决问题。目前通过非天然氨基酸标记蛋白质从而引入红外光谱探针的手段受到广泛关注,因为该方法无标记位点的局限。为此,我们借助基因密码子扩展技术,通过在大肠杆菌体内转入一种正交改造过的tRNA和与之配对的氨酰-tRNA合成酶,即可实现非天然氨基酸在卤醇脱卤酶中引入琥珀终止密码子UAG所对应氨基酸的特定位点处的标记。结果表明:该表达体系已经构建成功,并且成功表达和纯化在特定位点引入外源红外探针标记的卤醇脱卤酶,为后续应用红外光谱技术研究卤醇脱卤酶催化过程的结构动力学奠定基础。(本文来源于《电子科技大学》期刊2017-04-01）
顾恺,邹树平,王志才,郑裕国[9]（2016）在《环氧树脂固定化卤醇脱卤酶的研究》一文中研究指出采用环氧树脂ES-103B对卤醇脱卤酶进行固定化,对最优固定化条件及固定化酶的操作稳定性进行了研究。结果最佳固定化条件为:吸附温度为25℃,吸附缓冲液为p H 7.0磷酸钠缓冲液,初始酶质量浓度为0.5 mg/m L,共价时间为24 h。在此优化条件下,固定化酶的酶活回收率为74.5%,酶蛋白固定化效率为94.2%,比活力为518.6 U/g。利用固定化酶催化1,3-二氯丙醇制备环氧氯丙烷,重复使用15批次后,产物收率仍能保持在初始收率的91%以上,具有良好的工业化应用潜力。(本文来源于《现代化工》期刊2016年11期）
王雄[10]（2015）在《创建快速进化策略研究卤醇脱卤酶碳末端功能》一文中研究指出卤醇脱卤酶,是一类存在于微生物降解有机卤化合物代谢途径中的关键酶之一,它不仅可以通过分子内亲核取代机制,催化邻卤醇转化生成环氧化物和卤化氢,还能在一系列亲核试剂N3-、CN-和NO2-等介导下,高效高选择地催化其逆反应-环氧化物的开环反应,可以用来合成光学纯的环氧化物以及β-取代醇等一系列高价值手性药物中间体。因此,该酶具有十分重要的工业应用前景。通过对目前研究较为广泛的叁类卤醇脱卤酶进行氨基酸序列同源性比对分析,我们发现来源于放射形土壤农杆菌(Agrobacterium radiobacter AD1)中的卤醇脱卤酶(Hhe C),在其碳末端与另两类卤醇脱卤酶存在着显着的序列特征差异,即前者拥有长于另两类酶约10个氨基酸的碳末端区域。相关研究表明,这段看似冗长的碳末端区域,对卤醇脱卤酶行使催化功能具有十分重要的作用,但对其具体的调控机制还缺乏深入地研究。为了更高效地研究碳末端的具体功能,本论文在迭代式饱和突变策略(Iterative Saturation Mutagenesis,ISM)的基础上,创建了两种多位点快速进化策略。通过运用相关策略,系统地研究和揭示了卤醇脱卤酶碳末端的具体功能以及相应的调控机制。具体研究内容如下:(1)使用定点缺失突变技术,逐一研究卤醇脱卤酶碳末端区域每个氨基酸位点在酶催化反应过程中的作用。对所获得的10个碳末端氨基酸缺失突变体Δ1~Δ10,进行了表达纯化和功能检测。研究发现:碳末端氨基酸的缺失,对卤醇脱卤酶的催化活性有相当显着的负效应,其中缺失突变体Δ7~Δ10几乎完全丧失了催化活性。此外,碳末端氨基酸缺失后,还对酶的热稳定性具有十分显着的负效应。这些结果表明,该碳末端区域对卤醇脱卤酶行使催化功能是必不可少的。(2)使用单点饱和突变技术,系统地研究卤醇脱卤酶碳末端区域每个氨基酸位点在酶催化反应过程中的具体功能及调控机制。通过基于酶催化活性和热稳定性的文库筛选,获得了20个单点优势突变体,并对其进行表达纯化和功能检测。研究发现:碳末端关键氨基酸位点249和252~254发生突变后,对卤醇脱卤酶的催化活性和热稳定性分别具有十分明显地增强作用,证实了碳末端区域对催化活性和热稳定性均具有一定的调控功能。其中,碳末端关键氨基酸位点253和254,被证实能够在不影响卤醇脱卤酶催化活性情形下,独立地调控酶的热稳定性。同源建模分析发现,优势突变体P253D和P253N,在氨基酸位点253和254之间增加了两个氢键,能够较好地稳定整个碳末端区域的构象,使得它们的热稳定性明显改善。相关结果表明:碳末端区域内氨基酸之间的氢键网络,对其维持和调控卤醇脱卤酶的热稳定性有着不可替代的作用。(3)创建高效的多位点快速进化策略,用于后续进一步研究和调控卤醇脱卤酶碳末端功能。首先,在ISM策略的基础上,结合简并密码子设计工具DC-Analyzer,创建了非连续多位点快速进化策略,并成功用于增强卤醇脱卤酶的催化活性实例中。在对5个氨基酸位点的改造研究中,通过筛选约900个单克隆,获得了催化活性较野生型提高9.3倍的高效突变体。但是,该策略用于含有多个连续或者相邻位点的改造研究时,基于DC-Analyzer所设计的引物数目会大大增加。随后,针对DC-Analyzer的应用局限,成功地开发了适用于连读多位点突变重组的简并密码子工具MDC-Analyzer。在此基础上,创建了连续多位点快速进化策略,并成功运用于提高卤醇脱卤酶的催化活性以及热稳定性实例中。在对6个和7个氨基酸位点的改造研究中,通过筛选1,151和384个单克隆,分别获得了高于其模板5.9倍催化活性和2.3倍热失活半衰期的高效突变体。这些结果表明,本论文所创建的快速进化策略,能够高效便捷地用于快速提高生物催化剂的催化特性。(4)运用所创建的快速进化策略,研究卤醇脱卤酶碳末端区域关键氨基酸位点245,249,252,253和254的重组效应,进一步地调控和改善酶的催化活性以及热稳定性。首先,使用非连续多位点快速进化策略,研究碳末端区域关键氨基酸位点245、249和252的重组效应。研究发现,这3个氨基酸位点对酶的催化活性和热稳定性都有相当明显的加和效应,并且筛选获得了高于野生型卤醇脱卤酶5.0倍催化活性以及3.1倍热失活半衰期的高效突变体DL10。随后,运用连续多位点快速进化策略,在DL10的基础上,进一步研究关键氨基酸位点253和254的重组效应。研究发现,这2个氨基酸位点发生突变后,能够在不影响DL10催化活性的前提下,独立地调控酶的热稳定性,并且筛选获得了高于野生型卤醇脱卤酶4.0倍催化活性以及17.8倍热失活半衰期的高效突变体PX14。可见,碳末端氨基酸调控卤醇脱卤酶的催化活性和热稳定性具有可迭加性。综上所述,本论文选取来源于放射形土壤农杆菌中的卤醇脱卤酶碳末端作为研究模型,系统地研究了该碳末端区域在卤醇脱卤酶行使催化反应过程中的具体功能,揭示了其对酶的催化活性以及热稳定性的调控机制。运用所创建的多位点快速进化策略,成功地筛选获得了多个催化活性和热稳定性得以同时增强的高效突变体,这将有助于推动卤醇脱卤酶的理论研究和实际工业生产应用。(本文来源于《电子科技大学》期刊2015-09-25）
卤醇脱卤酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
卤醇脱卤酶能够在温和条件下催化邻卤醇脱卤和环氧化物的开环,在手性环氧化物和β-取代醇的合成方面具有极大的应用潜力。但是到目前为止立体选择性优异的卤醇脱卤酶仅有HheC,为了满足应用的需求,开发新型高效、选择性好、活性高的生物催化剂,已经成为卤醇脱卤酶工业应用基础研究的重点研究方向。本文首先以HheC和HheB为基因探针,通过基因挖掘法获得了10种潜在的卤醇脱卤酶基因,其中9种在大肠杆菌中成功表达。以苯基缩水甘油醚((R,S)-PGE)为模式底物,通过显色反应和高效液相色谱检测比较,筛选获得3种高活性且具有不同选择性的卤醇脱卤酶;经引入组氨酸标签后,确定了一种来源于菌株Pseudomonas pohangensis的HHDH_(His)10作为后续研究对象,其与HheB的同源性为44%,与HheC的同源性为31%,并对(R,S)-PGE表现出R选择性。通过Ni-NTA柱纯化目标蛋白,并对其酶学性质进行研究。其最适脱卤反应温度为40℃,最适脱卤反应pH为10.0,最适开环反应pH为7.5,该酶在pH6.0-7.5范围内和温度低于50℃时具有较好的稳定性。HHDH_(His)10具有较广的底物谱,对多种卤代醇和环氧化物表现出较好的活性及对映选择性。该酶对底物(R,S)-PGE的K_m为31.75 mM,V_(max)为32.79μmol·min~(-1)·mg~(-1)。HHDH_(His)10对(R,S)-PGE表现出较好的对映选择性,在20 mM的底物浓度下,获得的(S)-PGE的ee值和收率分别为>99%和16.35%;在pH 7.5和pH 8.0条件下,HHDH_(His)10催化拆分1-氯-3-苯氧基-2-丙醇(7)的单酶串联反应中,获得的(R)-7的ee值均可达>99%,收率约为25%。为提高酶的立体选择性,尝试对酶进行半理性设计改造,利用同源建模和分子对接技术,选定底物结合口袋附近的6个氨基酸残基(Gln159、Asn160、Phe161、Tyr167、Phe168和Pro169)进行定点饱和突变和组合突变。以(R,S)-PGE为模式底物,通过高效液相色谱检测,获得3个立体选择性提高的突变体,分别是Q159L、N160L和P169Q,其对映体选择率分别约从9.85提高到21.80,21.10和10.84,其中突变体N160L的选择性和原始酶是相反的。我们还尝试对突变体进行迭加突变,但是并未检测到选择性提高的阳性突变体。利用亲和层析分离纯化突变体N160L和Q159L,结果发现突变后的酶活相比较于原始HHDH_(His)10明显降低,分别为原始酶的56.75%和47.45%。通过对突变体N160L与Q159L的环氧化物底物谱进行研究,两突变体除了对底物邻乙基苯基缩水甘油醚(12)和苯基环氧乙烷(16)选择性没有提高以外,对于其它底物的选择性均有一定程度的提高,尤其是突变体N160L对底物对甲基苯基缩水甘油醚(11)的E值提高到了25.77,是原始HHDH_(His)10的13.93倍。对突变体N160L与原始HHDH_(His)10对映选择性相反的机理进行分析,结果表明:通过将突变体N160L与(R)-PGE和(S)-PGE分子对接发现,两个氨基酸残基Ser116和Tyr129与(R)-PGE和(S)-PGE底物的氧原子之间形成的氢键的距离不同,导致发生作用的作用力存在差异,从而出现了构型逆转的现象。利用突变体N160L动力学拆分(R,S)-PGE(20-200 mM),获得(R)-PGE的最大ee值可达>99%,收率最高达到30.92%。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
卤醇脱卤酶论文参考文献
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标签：卤醇脱卤酶; 1-氯-3-苯氧基-2-丙醇; 催化; 工艺;