（1广东省第二人民医院神经外科广东广州510317）
（2广东省妇幼保健院广东广州511400）
【摘要】目的：旨在研究原癌基因Pokemon对核因子-κB/p65（nuclearfactor-kappaB,NF-κB）基因在胶质瘤细胞中的表达及调控作用。方法：采用小干扰RNA（siRNA）瞬时转染，抑制Pokemon在胶质瘤细胞的表达，采用实时荧光定量-PCR（Real-timePCR）和蛋白印迹法（Westernblot）分别检测Pokemon、NF-κB/p65mRNA和蛋白在胶质瘤细胞的表达情况。结果：在A172细胞中瞬时转染PokemonsiRNA后(36h，48h，60h)，分别使用Real-timePCR和Westernblot检测Pokemon与NF-κB/p65的mRNA和蛋白水平，结果显示，在Pokemon基因的mRNA（对照组1.0±0.0517（无效RNA片段）,36h0.712±0.1627,48h0.634±0.0961，60h0.562±0.0762差异具有统计学意义P<0.05）和蛋白(对照组vs实验组：36h0.8±0.3517vs0.45±0.2991，48h0.82±0.0842vs0.247±0.0723，60h0.965±0.0762vs0.149±0.0223差异具有统计学意义P<0.05)水平下降的同时，NF-κB/p65基因的mRNA（对照组1.0±0.0833（无效RNA片段），36h0.405±0.0319，48h0.364±0.0412,60h0.355±0.0692差异具有统计学意义P<0.05）和蛋白(对照组vs实验组：36h0.625±0.0547vs0.15±0.0792，48h0.764±0.0426vs0.127±0.0842，60h0.75±0.0587vs0.519±0.0273差异具有统计学意义P<0.05)水平也明显下降，呈时间梯度改变，具有统计学差异（P<0.05）。结论：原癌基因Pokemon在胶质瘤A172细胞中对NF-κB/p65有正向调控作用，与胶质瘤发生、发展过程关系密切。
【关键词】胶质瘤；Pokemon；核因子NF-κB/p65
【中图分类号】R739.4【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）18-0180-03
胶质瘤是中枢神经系统中最常见的性肿瘤，其具有侵袭性和无控性增殖的特性，所引起的“耐药效应”限制了综合手段根治的可能，临床治疗效果差，病患生存率低[1]。近年研究表明，胶质瘤是一种基因病，各种因素影响抑癌基因和原癌基因变化是胶质瘤发生、发展的关键。Pokemon(POKerythroidmyeloidOntogenicfactor)称为POK红细胞髓性致癌因子，位于多种肿瘤原癌基因和抑癌基因的上游位置，因其包含特殊结构域，决定了它在癌基因转化过程中起关键性作用，现有研究指出它可通过ARF-Mdm2-p53通路调控基因转录和肿瘤的发生、发展，但同时还认为Pokemon通过ARF-Mdm2-p53以外的信号通路，能调控其他癌基因和抑癌基因的活性，促进胶质瘤细胞增殖，增强肿瘤细胞抗凋亡能力的科学假说，但其具体作用机制尚未阐明。NF-κB/p65是一个重要的癌基因，近年来国内外多项研究表明，它能促进胶质瘤细胞的增殖。NF-κB/p65在多种信号系统中可作为共同的转录激活因子，介导放大信号促使下游基因作出应答，包括急性应答蛋白、细胞因子、生长因子、免疫应答过程、细胞粘附因子起作用的受体和酶等，被发现参与多种生理和代谢过程。深入研究和探讨Pokemon与NF-κB/p65在胶质瘤发生、发展的相关性，为该领域的基础研究转化为临床治疗提供游离的实验依据。
1.材料与方法
1.1主要材料
1.1.1细胞系人胶质瘤细胞株A172，购自中国科学院上海细胞库。
1.1.2试剂β-actin一抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠/兔IgG(H+L)二抗、预染彩色蛋白质分子质量标准，购自上海碧云天公司；LipofectamineTM2000、TrizolReagent，购自美国Invitrogen，人抗兔NF-κB/p65抗体，购自美国SantaCruz；Dnase、RNaseinhibitor及PrimeScriPt?RTMasterMix(PerfectRealTime)Kit，购自美国宝生物工程(大连)有限公司；人抗源Pokemon抗体(一抗)ZBTB7A(ab133214)，购自美国Abcam公司；用于沉默Pokémon基因的小干扰RNA(si-Pokemon)及空白对照(scrambleRNA)均由上海吉玛制药技术有限公司合成。
1.1.3仪器与设备恒温CO2培养箱；7500Real-timePCRSystem；超净工作台等；MiniPROTEAN3Cell型蛋白电泳系统；TRANS-BLOTSD转印仪。
1.2方法
1.2.1细胞培养A172细胞采用含8～10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，常规培养于含5%CO2的37℃恒温细胞培养箱中，0.25%胰酶消化传代。
1.2.2si-RNA瞬时转染(以6孔板为例，反转法)转染试剂配制：取两管250μl优化培养基溶液分别放入含有5μlLipofectamineTM2000和100pmolsiRNA(约5μl)（正义链5′-GCUGGACCUUGUAGAUCAAtt-3′，反义链5′-UUGAUCUACAAGGUCCAGCtt-3′）的5μlScrambleRNA（正义链5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反义链5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′）的两个1.5mlEP管中(需用无RNA酶)，室温静置5min后，吹打混合上述两试剂，并在室温静置20min。以1.2×105个/孔细胞铺板，加入上述制备好的转染试剂，摇匀后置5%CO2培养箱培养。16～18h后换液，并观察镜下细胞状态。
1.2.3蛋白印迹检测实验（Westernblot）常规收集36、48、60h不同时间段的转染处理过的细胞，使用LysisBuffer细胞裂解液（含PMSF）裂解细胞，提取细胞总蛋白，用BCA试剂测定蛋白浓度，进行12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，260mA电流湿法转NC膜，5%脱脂牛奶封闭，加入一抗4℃孵育12h，抗体稀释浓度为NF-κB/p65(1:500）、Pokemon（1:1000）、β-actin（1:1000），加入对应二抗溶液，室温孵育1.5h，化学发光试剂盒显影，Bio-Rad凝胶成像系统扫描光密度值，根据分子量选择曝光时间，QuantityOne软件分析。蛋白表达的相对强度=目的条带灰度值/β-actin条带灰度值。
1.2.4实时荧光定量PCR（Real-timefluorogenicquantitative-PCR）收集各时间段细胞，采用Trizol方法提取细胞中的总RNA，按照RNaseinhibitor试剂盒说明反转录为cDNA。PCR反应20μl体系（SYBRPremixExTaqTM10μl、TemplatecDNA1μl、Primer各1μl、DyeⅡ(校对)0.4μl及ddH2O7.6μl），每孔设置3个重复孔。PCR反应条件：Step1，95℃，10s，1cycle；Step2，95℃，5s，40cycles；60℃，34s；Step3Dissociation，stage。Pokemon上游引物序列5′-GAAGCCCTACGAGTGCAACATC-3′，下游引物序列5′-GTGGTTCTTCAGGTCGTAGTTGTG-3′；NF-κB/p65上游引物序列5′-ATCTAGCCATGATGAGCAAT-3′，下游引物序列5′-AGCCTGGTGGACCCTCT-3′；内参GAPDH上游引物序列5′-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，下游引物序列5′-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3′。数据判定方法：ΔCT=CT目的基因－CT内参，ΔΔCT=ΔCT实验组－ΔCT对照组，RQ(RelativeQuantitation)实验组=2-ΔΔCT，RQ对照组=1，实验重复3次，以验证结果的可靠性。所有数据采用7500Real-timePCRSystem软件进行分析。
1.3统计分析
应用SPSS22.0统计软件进行相关性分析，计量资料数据以x-±s表示，两组间差异用t检验进行统计学处理，P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1siRNA-Pokemon对胶质瘤细胞中Pokemon和NF-κB/p65mRNA水平表达的影响
采用瞬时转染不同作用时间的si-Pokemon（实验组）与阴性对照组（无效小干扰RNA片段）进行ΔCT值比较，结果显示，在Pokemon基因的ΔCT值下降的同时，NF-κB/p65基因的ΔCT值也明显下降，差异均有显著意义（P<0.05）；见表1。
3.讨论
Oldfield率先采用基因治疗胶质瘤患者并取得一定疗效后，早期获得众多学者的认同与参与研究，但随着进一步的深入研究，研究人员逐渐发现早期基因治疗研究的不足，目前随着对胶质瘤增殖、侵袭及血管形成的病理及分子机制研究取得的技术进步，基因治疗作为一种高效的治疗手段得到较快的发展，展现出胶质瘤基因治疗的广阔前景，但选择恰当的肿瘤基因作为目标靶基因仍非常困难，原癌基因Pokemon具有特殊结构，决定了它位于多种肿瘤抑制基因和原癌基因的上游位置，在癌基因转化过程中起关键性作用，具有重要研究价值。
原癌基因Pokemon最初被作为与HIV1型启动子元件相结合的一种蛋白质被发现，根据现有研究分析表示，它在人类肿瘤如乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌中表达水平很高，因为Pokemon具有特殊结构，决定了它位于多种肿瘤抑制基因和原癌基因的上游位置，在癌基因转化过程中起关键性作用，具有重要研究价值，但它在胶质瘤中作用和意义尚未阐明。近年来的研究发现：NF-κB作为一种具有炎症反应、与抗凋亡能力关系密切的核细胞转录因子，其表达被较多报道与胶质瘤细胞分化关系密切，与胶质瘤新生血管形成、放化疗敏感性有关。体外培养的胶质瘤细胞中Pokemon过表达可以诱导NF-κB的活化，并上调NF-κB的表达，因此，在胶质瘤细胞中两者是否存在调控关系，这有待进一步研究。
本研究采用小RNA干扰手段，检测了在胶质瘤A172细胞中Pokemon正调控NF-κB/p65的mRNA和蛋白水平，初步发现Pokemon可能通过ARF-Mdm2-p53以外的信号通路，调控其他癌基因和抑癌基因的活性，意味着NF-κB/p65为Pokemon下游靶基因，参与胶质瘤发生、发展，这对胶质瘤的基础研究、诊断和临床治疗具有重要参考意义，丰富了Pokemon的研究内容和对基因治疗研发打下实验基础。
【参考文献】
[1]《中国中枢神经系统胶质瘤诊断和治疗指南》编写组.中国中枢神经系统胶质瘤诊断与治疗指南（2015）[J].中华医学杂志,2016,(7),doi:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2016.07.003.
[2]GuoC，ZhuK，SunW，etal.Theeffectof?Pokemon?onbladdercancerepithelial-mesenchymaltransition[J].BiochemBiophysResCommun.2014Jan24;443(4):1226-31.
基金项目：2014年度广东省医学科研基金立项课题（编号：A2014156）、2014年度广东省省级科技计划项目（编号：2014A020212405）及2015年度广东省自然科学基金项目（编号：2015A030313722）.
作者简介：罗国轩（1985年12月）男，汉族，广州增城，硕士研究生，住院医师，研究方向：神经胶质瘤
通讯作者：罗唯师（1982年1月），男，汉族，广东梅州，硕士研究生，主治医师，研究方向：神经胶质瘤