小鼠胰腺癌细胞论文-谢俊木子,田文聪,袁向飞,胡立娟,王丰

小鼠胰腺癌细胞论文-谢俊木子,田文聪,袁向飞,胡立娟,王丰

导读:本文包含了小鼠胰腺癌细胞论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献,主要关键词:胰腺肿瘤,恶病质,脂类代谢,胰岛素抵抗

小鼠胰腺癌细胞论文文献综述

谢俊木子,田文聪,袁向飞,胡立娟,王丰[1](2019)在《胰腺癌细胞可溶性分泌物对小鼠脂代谢的影响》一文中研究指出目的探讨胰腺癌细胞可溶性分泌物对体内脂肪代谢的影响。方法利用无血清培养基培养胰腺癌Panc-1、MiaPaCa-2、BxPC-3细胞24 h后留取上清制得胰腺癌细胞条件培养基。全实验包括两个子实验,实验A将37只BALB/c小鼠随机分为对照组(n=14),Panc-1组(n=10),MiaPaC-2组(n=6)和BxPC-3组(n=7),分别注射正常DMEM培养基和3种胰腺癌细胞(Panc-1,MiaPaCa-2,BxPC-3)条件培养基,每组小鼠连续7 d接受培养基的皮下注射,每日2次。监测每只小鼠进食量及体质量,检测血浆葡萄糖、叁酰甘油含量和肝脏中糖原含量,酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆胰岛素水平,小鼠的腹股沟脂肪垫(BAT)、附睾脂肪垫(WAT)予以称质量,Western blot检测脂肪中脂肪甘油叁酯脂肪酶(ATGL)蛋白表达水平。实验B将30只BALB/c小鼠随机分为对照组(n=10)、1/2 M组(n=10)、M组(n=10),将正常DMEM培养基和不同剂量的MiaPaCa-2细胞条件培养基注射入对应组别小鼠体内,余处理与实验A相同。结果实验A中,小鼠进食量及体质量初期均下降,之后回升并趋于稳定,与对照组相比,MiaPaCa-2组和BxPC-3组血浆胰岛素、血糖水平升高(P<0.05),肝糖原、叁酰甘油水平下降(P<0.05),BAT和WAT质量增加(P<0.05),Panc-1组仅叁酰甘油水平下降(P<0.05),3个胰腺癌细胞条件培养基注射组脂肪组织内ATGL表达水平均下降(P<0.05);实验B中,与对照组相比,M组血浆胰岛素和葡萄糖上升(P<0.05),肝糖原和叁酰甘油均下降(P<0.05),BAT和WAT质量增加(P<0.05),ATGL表达水平下降(P<0.05),1/2 M组仅胰岛素水平和脂肪垫质量上升(P<0.05)。结论注射胰腺癌细胞条件培养基可造成小鼠体内脂肪代谢失衡,出现胰岛素抵抗、脂肪储存加强和脂肪分解减弱的现象。(本文来源于《天津医药》期刊2019年01期)

李阳[2](2017)在《CRISPR/Cas9系统介导的?Np63α基因定点敲入增强小鼠胰腺癌细胞干性和吉西他滨的敏感性》一文中研究指出背景和目的胰腺癌是致死性极强的恶性肿瘤,在世界范围内居肿瘤致死病因的第四位。胰腺癌在早期缺乏有效的诊断手段,中位生存期只有6到8个月,5年生存率<5%。胰腺癌发病原因发杂,涉及众多的基因表达及调控,是多基因异常累积的结果。为研究其发病机制,研究人员构建了KC(LSL-Kras G12D/+,Pdx-1-Cre)和KPC(LSL-Kras G12D/+,Trp53R172H/+,Pdx-1-Cre)基因工程小鼠来模拟胰腺癌的发病过程。P53作为抑癌基因,其突变体广泛参与肿瘤的发生发展过程。P63基因属于p53转录家族中的一员,其异常表达与肿瘤有很大的关系。由于启动子的不同,p63又可以被分为TAp63和?Np63两大类。?Np63α是p63在肿瘤中的主要表达亚型,在肿瘤发生中发挥重要的作用。?Np63α可结合p53的下游靶基因发挥显性失活作用阻碍p53的抑癌作用,被认为是致癌基因,也有报道称其可与p53突变体结合,发挥抑癌作用。在胃癌中,?Np63α抑制肿瘤细胞增殖,但在乳腺癌中促进肿瘤细胞增殖。在肺癌中?Np63α抑制细胞迁移,在乳腺癌中却促进细胞迁移。在乳腺癌、头颈部鳞癌和肺癌中,高表达的?Np63α肿瘤化疗药物敏感性增强;而在膀胱癌、卵巢癌和前列腺癌中,高表达的?Np63α会降低化疗药的敏感性。针对以上问题,本研究用CRISPR/Cas9基因编辑技术将?Np63α基因定点敲入小鼠胰腺癌细胞DT6606,并对其在肿瘤细胞增殖、迁移、细胞干性和药物敏感性等方面的作用进行研究。方法1.px330-rosa26-sgRNA切割载体和同源重组打靶载体p Rosa26-?Np63α的构建。利用ZIFIT网站设计针对小鼠基因Rosa26位点的sgRNA序列,合成后,连接到px330质粒构建px330-Rosa26-sgRNA载体质粒。通过PCR获得目的基因片段,先连接到pc DNA3.1质粒上,获取CMV启动子和zeocin抗性标记之后,将片段连接到p Rosa26-1同源臂载体上,构建成同源重组打靶载体p Rosa26-?Np63α。2.细胞转染实验及阳性细胞的筛选。利用lipo2000脂质体转染试剂,将同源重组打靶载体p Rosa26-?Np63α和px330-Rosa26-sgRNA载体共转染小鼠胰腺癌细胞DT6606,通过抗性标记博来霉素(Zeocin)筛选,初步获取具有抗性的转染细胞,用PCR鉴定?Np63α是否敲入。用q PCR检测Rosa26基因片段的含量来对?Np63α插入位置定位。3.?Np63α的表达及其对胰腺癌细胞增殖、迁移、细胞干性和化疗药物敏感性的观察。通过q PCR和免疫细胞化学,分别从RNA和蛋白水平检测?Np63α的表达情况;通过长时间动态活细胞成像系统,检测细胞群体增殖情况;通过克隆形成实验,检测单个细胞的增殖能力;用划痕实验检测细胞的迁移能力;通过干细胞球体形成实验来检测细胞的干性,用MTS实验来检测细胞对化疗药物的敏感性。结果1.成功构建了CRISPR/Cas9系统切割载体px330-rosa26-sgRNA和同源重组打靶载体p Rosa26-?Np63α。2.通过有限稀释法筛选单克隆细胞,成功的构建了在Rosa26位点定点敲入?Np63α基因的小鼠胰腺癌细胞亚系1B9和2D5,其中1B9比2D5具有更高的?Np63α的表达量。3.相较于DT6606细胞,1B9细胞形态发生了变化,细胞可呈卵圆形且成团生长,细胞间的界限不清,2D5细胞无明显变化。4.相较于DT6606细胞,2D5细胞有更强的增殖能力和迁移能力,1B9细胞的增殖能力明显降低,迁移能力无变化。肿瘤干细胞成球实验中,1B9和2D5的球体量都增多,但1B9细胞有更多的球体数量(p<0.001)。5.相对于DT6606细胞,1B9和2D5对胰腺癌化疗药吉西他滨的敏感性增高;其中1B9的敏感性低于2D5(p<0.001)。结论1.成功的构建了在Rosa26位点定点插入并高表达?Np63α的小鼠胰腺癌细胞DT6606的细胞亚系1B9和2D5。2.小鼠胰腺癌细胞在亚系形成、增殖、迁移、细胞干性和化疗药物敏感性等方面存在异质性。3.在Rosa26位点定点敲入?Np63α可促进小鼠胰腺癌细胞的干性并提高其对化疗药物吉西他滨的敏感性。(本文来源于《郑州大学》期刊2017-05-01)

刘斐然,刘为青,洪敏,张红星,延威[3](2015)在《小鼠胰腺癌细胞MPC-83中干性细胞群的筛选及其特性的鉴定》一文中研究指出目的:本实验从小鼠胰腺癌细胞MPC-83中筛选出干性细胞群,并鉴定其生物学特性。为小鼠胰腺癌干细胞群免疫抑制功能的研究提供基础。方法:运用流式分选技术从小鼠胰腺癌细胞MPC-83中分选出CD24+CD44+的肿瘤干细胞群。将流式细胞仪分选获得的MPC-83干性细胞群接种于无血清培养基进行培养,观察细胞生长情况及成球能力。通过检测细胞的自我更新能力、细胞周期、侵袭和迁移能力、细胞体内成瘤能力等,鉴定MPC-83干性细胞群的肿瘤干细胞特性。结果:利用流式细胞技术筛选出的CD24+CD44+的MPC-83干性细胞群在无血清培养基中可以存活,形成细胞球。在体外可连续培养。CD24+CD44+的MPC-83干性细胞群,G0/G1期细胞占(76.8±2.57)%,与MPC-83细胞的G0/G1期(47.28±1.31)%相比,差异显着。CD24+CD44+的MPC-83干性细胞群和MPC-83细胞Transwell迁移实验平均穿膜数分别为145.2±15.4 vs 112.3±11.5,侵袭实验平均穿膜数分别为62.8±12.7 vs 48.7±21.5,与MPC-83细胞相比,CD24+CD44+的MPC-83干性细胞群的侵袭和迁移能力更强。CD24+CD44+的MPC-83干性细胞群形成移植瘤所需最少细胞数为1×103个,成瘤能力是普通MPC-83细胞的100倍。结论:通过流式细胞技术筛选出的MPC-83干性细胞群具有干细胞特性,能够成为后期实验的研究基础。(本文来源于《第十四届全国肿瘤生物治疗大会论文集》期刊2015-05-15)

刘斐然[4](2015)在《小鼠胰腺癌细胞MPC-83中干性细胞群的筛选及其特性的鉴定》一文中研究指出目的:本实验从小鼠胰腺癌细胞MPC-83中筛选出干性细胞群,对其在侵袭能力、致瘤性等方面的生物学特性进行鉴定,并对胰腺癌干细胞对化疗药的耐受性进行初步研究。为小鼠胰腺癌干细胞群免疫抑制功能的研究提供基础。方法:1.运用流式分选技术从小鼠胰腺癌细胞MPC-83中分选出CD24+CD44+的肿瘤干细胞群。2.运用无血清悬浮培养法,将分选获得的CD24+CD44+的MPC-83干性细胞群进行体外培养。将细胞传代培养,观察细胞成球能力。3.通过划痕实验和Transwell侵袭、迁移实验检测CD24+CD44+的MPC-83干细胞的迁移能力和侵袭能力。4.将细胞接种于昆明小鼠,观察细胞的成瘤能力,比较细胞成瘤率。5.运用流式细胞术检测分选获得的CD24+CD44+的MPC-83干细胞的细胞周期。6.MTT技术检筛选出的CD24+CD44+的MPC-83干细胞和普通MPC-83细胞对抗肿瘤药物吉西他滨作用的敏感性。使用不同浓度的吉西他滨干预CD24+CD44+的MPC-83干细胞和普通肿瘤细胞,分析化疗药物刺激对两种细胞生长的影响。结果:1.利用流式细胞分选技术,可以筛选出CD24+CD44+的MPC-83干性细胞群,这些干细胞约占细胞总数的5%。2.利用流式细胞技术筛选出的CD24+CD44+的MPC-83干性细胞群在无血清培养基中可以存活,形成细胞球。在体外可连续培养,具有自我更新能力。3.CD24+CD44+的MPC-83干性细胞群和普通MPC-83细胞Transwell迁移实验平均穿膜数分别为(145.2±15.4)个细胞vs(112.3±11.5)个细胞,侵袭实验平均穿膜数分别为(62.8±12.7)个细胞vs(48.7±21.5)个细胞。与普通MPC-83细胞相比,CD24+CD44+的MPC-83干性细胞群的侵袭能力和迁移能力更强。4.在体内成瘤能力试验中,CD24+CD44+的MPC-83干性细胞群形成移植瘤所需最少细胞数为1×103个,成瘤能力是普通MPC-83细胞的100倍。5.细胞周期检测的结果显示:在CD24+CD44+的MPC-83干性细胞群中,Go/G1期细胞占细胞总数的(76.8±2.57)%。在普通MPC-83细胞中,G0/G1期细胞占细胞总数的(47.28±1.31)%。两者之间相比,差异显着。6.在耐药性试验中:相同作用时间,相同作用浓度条件下吉西他滨对普通MPC-83细胞的杀伤能力要强于对CD24+CD44+的MPC-83干性细胞群的杀伤能力。CD24+CD44+的MPC-83干性细胞群对于吉西他滨的作用,具有耐受性。结论:通过流式细胞技术成功筛选出小鼠胰腺癌干性细胞群。来源于小鼠MPC-83细胞的CD24+CD44+的细胞具有干细胞的生物学特性,并且对化疗药物耐受,为今后进行胰腺癌个体化治疗和干细胞群免疫抑制功能的研究提供基础。(本文来源于《昆明医科大学》期刊2015-05-01)

马翔,张登勇,孙万亮,鲁正[5](2015)在《应用siRNA敲低TPM3基因表达后对大鼠胰腺癌细胞侵袭转移能力的影响》一文中研究指出目的:探究原肌球蛋白3(tropomyosin alpha-3 chain,TPM3)在大鼠胰腺癌细胞中对其侵袭转移能力的影响并初步阐述其可能的分子机制。方法:(1)将70只大鼠随机分为手术组40只[将7,12-二甲基苯并蒽(7,12-dimethyl-1,2-benzanthracene,DMBA]植入大鼠胰腺被膜下后荷包缝合被膜),假手术组15只(只对胰腺进行荷包缝合而后关腹,不置入DMBA),阴性对照组15只(不做任何处理),建立大鼠胰腺癌模型。(2)通过组织免疫组化染色的方法对差异蛋白TPM3进行验证。(3)通过机械分离和酶阶段消化法分离胰腺癌组织的方法获取大鼠胰腺癌细胞,体外传代培养获得纯度较高的细胞后,应用si RNA敲低大鼠胰腺癌细胞中TPM3基因的表达;通过RT-PCR技术检测其沉默效果。(4)通过Transwell实验和平板克隆实验分别对细胞的侵袭、迁移能力及生长增殖能力进行观察。结果:(1)经病理验证模型组有37.83%(14/37)形成胰腺癌,证明大鼠胰腺癌模型建立成功。(2)免疫组化验证胰腺癌组织中TPM3阳性率(92.8%)明显高于正常胰腺组织(6.7%)。(3)RT-PCR结果显示,转染TPM3-si RNA的细胞中TPM3的表达量(0.31±0.02)明显低于其余各组,脂质体组(0.45±0.02),阴性对照组(0.45±0.02),空白对照组(0.43±0.02)(P<0.05),其余各组之间TPM3表达量差异无统计学意义(P>0.05)。(4)转染TPM3-si RNA的细胞其侵袭[(161.63±4.94)个]、迁移能力[(206.87±4.21)个]及生长增殖能力[(51.5±2.327)个]较对照组明显降低[分别为(39.7±1.40)个,(67.27±1.76)个,(5.900±0.767)个](P<0.05)。结论:体外化学合成的TPM3-si RNA可有效的抑制大鼠胰腺细胞TPM3的表达,TPM3表达降低后其侵袭能力、迁移能力及生长增殖能力下降。(本文来源于《重庆医科大学学报》期刊2015年08期)

朱晓燕,孟志强,陈震,陈联誉,解婧[6](2013)在《华蟾素注射剂对荷人胰腺癌细胞株SW1990裸小鼠的抑瘤作用》一文中研究指出目的研究华蟾素注射剂在小鼠体内的最大耐受量以及不同剂量华蟾素对荷人胰腺癌细胞株SW1990裸小鼠的抑瘤作用。方法将华蟾素分为100、75、50、30、10、3 g·kg~(-1)共6个不同剂量组并设对照组(生理盐水组),观察该药对CD1小鼠的最大耐受量;根据最大耐受量的结果将荷人胰腺癌细胞株SW1990皮下移植瘤裸小鼠,之后随机分为对照组与吉西他滨组,以及华蟾素12.5、25、50 g·kg~(-1)剂量组,定期测量肿瘤体积,给药21 d后计算抑瘤率。结果华蟾素毒性反应出现在100、75 g·kg~(-1)两剂量组。华蟾素小剂量组抑瘤率为16.95%,中剂量组为30.51%,大剂量组为18.64%,各给药组的平均瘤体积均小于对照组(P<0.05);其中华蟾素中剂量组的抑瘤率较好。华蟾素各剂量组裸小鼠均生长良好,无明显毒性反应。结论华蟾素在CD1小鼠体内的最大耐受剂量为50 g·kg~(-1),华蟾素给药剂量为25 g·kg~(-1)时对荷人胰腺癌细胞株SW1990裸小鼠抑瘤作用最佳。(本文来源于《中国临床药学杂志》期刊2013年05期)

田劲猛,何建平,李琳慧,杨福[7](2013)在《叁七皂甙制剂抑制小鼠胰腺癌细胞生长增殖的体外实验研究(一)》一文中研究指出目的:观察研究叁七皂甙(PNS)制剂对体外培养的小鼠胰腺癌细胞株(MPC)是否有抑制生长增殖作用。方法:应用四唑盐比色法绘制生长曲线,以确定最佳干预时间。测定不同时间、不同浓度的PNS制剂对MPC的生长增殖抑制率。结果:MTT法检测不同浓度PNS制剂对MPC生长抑制率具有时间和剂量依赖性。结论:不同浓度PNS制剂作用不同时间对MPC增殖具有一定的抑制作用,呈时-效和量-效依赖关系。(本文来源于《内蒙古中医药》期刊2013年17期)

马翔[8](2013)在《应用siRNA敲低TPM3基因表达后对大鼠胰腺癌细胞生物学行为的影响》一文中研究指出目的:探究TPM3在大鼠胰腺癌细胞中对其生物学行为的影响并初步阐述其可能的分子机制。方法:1.通过在大鼠胰腺中包埋DMBA的方法建立大鼠胰腺癌模型。2.对差异蛋白TPM3进行免疫组化验证3.通过机械分离和酶阶段消化分离胰腺癌组织的方法获取大鼠胰腺癌细胞,体外传代培养获得纯度较高的细胞后,应用siRNA敲低大鼠胰腺癌细胞中TPM3基因的表达;通过RT-PCR技术检测其沉默效果。4.通过Transwell实验和平板克隆实验分别对细胞的侵袭、迁移能力及生长增殖能力进行观察。结果:1.经病理验证模型组有37.83%(14/37)形成胰腺癌,证明大鼠胰腺癌模型建立成功。2.免疫组化验证胰腺癌组织中TPM3阳性率明显高于正常胰腺组织。3.RT-PCR结果显示,转染TPM3-siRNA的细胞中TPM3的表达量明显低于其余各组(P<0.05),其余各组之间TPM3表达量差异无统计学意义(P>0.05)。4.转染TPM3-siRNA的细胞其侵袭、迁移能力及生长增殖能力较对照组明显降低(P<0.05)。结论:大鼠胰腺癌细胞TPM3表达降低后其侵袭能力、迁移能力及生长增殖能力均下降(本文来源于《蚌埠医学院》期刊2013-05-01)

娄月红[9](2012)在《大鼠胰腺癌细胞裂解物修饰的树突状细胞疫苗在大鼠胰腺癌模型中的抗肿瘤作用》一文中研究指出目的:观察经大鼠胰腺癌细胞裂解物修饰的DC疫苗对大鼠胰腺癌皮下移植瘤的免疫治疗作用。方法:大鼠胰腺癌细胞注入SD大鼠胰腺被膜下,形成肿瘤,然后将肿瘤切碎,植入同种大鼠的腋窝皮下,建立皮下移植瘤模型;将大鼠胰腺癌细胞反复冻融4次,提取出裂解物,与SD大鼠骨髓来源的DC共培养72小时,制成DC疫苗。根据DC致敏情况分为DC疫苗组、DC组、裂解物组和对照组,每组五只,然后分别注入皮下移植瘤体内。每两天测1次肿瘤的长径和横径,共8次,并观察大鼠的生存期,来研究其对大鼠胰腺癌皮下移植瘤的免疫治疗效果。结果:DC疫苗组随着时间的延长,肿瘤大小呈递减趋势; DC组、裂解物组、对照组随着时间的延长,肿瘤大小呈递增趋势;DC疫苗组与对照组之间肿瘤大小差异有统计学意义(P<0.05);DC组、裂解物组与对照组之间肿瘤大小差异无统计学意义(p>0.05);DC疫苗组与DC组、裂解物组之间肿瘤大小差异有统计学意义(P<0.05);DC疫苗组大鼠生存期为(55.6±9.4)d,明显长于其它各组(P<0.01)。结论:大鼠胰腺癌细胞裂解物修饰的DC疫苗可以诱导胰腺癌皮下移植瘤大鼠产生高效的抗胰腺癌免疫应答反应。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2012-05-01)

田劲猛[10](2012)在《叁七皂甙制剂抑制小鼠胰腺癌细胞生长增殖的体外实验研究》一文中研究指出[目的]:观察研究叁七皂甙(Notoginsenoside)对体外培养的小鼠胰腺癌细胞株(MPC)抑制生长增殖和诱导凋亡的作用,以及对MPC细胞体外千移、侵袭能力的影响。[方法]:1.测定体外培养的小鼠胰腺癌细胞株(MPC)细胞活力、贴壁率,应用四唑盐比色法(MTT)测定MPC细胞在不同时间、不同浓度的OD值,绘制生长曲线,确定最佳细胞接种浓度及药物干预区间。2.四唑盐比色法(MTT)测定不同时间、不同浓度的叁七皂甙制剂(Notoginsenoside)对小鼠胰腺癌细胞株(MPC)的生长增殖抵制率并于倒置显微镜观察细胞形态学变化。3.流式细胞术检测叁七皂甙制剂(Notoginsenoside)对MPC细胞周期影响的分析以证实凋亡的存在;细胞划痕实验检测叁七皂甙制剂(Notoginsenoside)对小鼠胰腺癌细胞株(MPC)迁移、侵袭能力的影响。[结果]:1.小鼠胰腺癌细胞株(MPC)常规培养,存活率均>95%符合本实验要求MTT测定的牛长曲线提示按照6×104/孔的密度接种于96孔板内可提供足够的细胞生长空间及营养成分,使细胞于接种12小时后,适应新环境,逐渐进入快速繁殖期。2.选取细胞接种于96孔板后的48小时左右,该区间能够保证细胞始终处于一个稳定的对数生长期;在此条件下MTT法检测不同浓度Notoginsenoside对MPC细胞生长抵制率具有时间和剂量依赖性。3.流式细胞术检测结果显示,药物作用组细胞凋亡、坏死比率随着药物浓度的增加而增加。细胞划痕实验结果显示Notoginsenoside能够降低MPC细胞的迁移、侵袭能力。[结论]:1.不同浓度叁七皂甙制剂(Notoginsenoside)作用不同时间对鼠胰腺癌细胞(MPC)增殖具有一定的抑制作用,呈时-效和量-效依赖关系,具有时间、剂量依赖性。2.叁七皂甙制剂(Notoginsenoside)能诱导小鼠胰腺癌细胞株(MPC)凋亡3.叁七皂甙制剂(Notoginsenoside)能够降低MPC细胞的迁移、侵袭能力。4.叁七皂甙制剂(Notoginsenoside)可能是有前景的抑制胰腺癌细胞的药物。(本文来源于《昆明医科大学》期刊2012-05-01)

小鼠胰腺癌细胞论文开题报告

(1)论文研究背景及目的

此处内容要求:

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景,再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题,并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例:

背景和目的胰腺癌是致死性极强的恶性肿瘤,在世界范围内居肿瘤致死病因的第四位。胰腺癌在早期缺乏有效的诊断手段,中位生存期只有6到8个月,5年生存率<5%。胰腺癌发病原因发杂,涉及众多的基因表达及调控,是多基因异常累积的结果。为研究其发病机制,研究人员构建了KC(LSL-Kras G12D/+,Pdx-1-Cre)和KPC(LSL-Kras G12D/+,Trp53R172H/+,Pdx-1-Cre)基因工程小鼠来模拟胰腺癌的发病过程。P53作为抑癌基因,其突变体广泛参与肿瘤的发生发展过程。P63基因属于p53转录家族中的一员,其异常表达与肿瘤有很大的关系。由于启动子的不同,p63又可以被分为TAp63和?Np63两大类。?Np63α是p63在肿瘤中的主要表达亚型,在肿瘤发生中发挥重要的作用。?Np63α可结合p53的下游靶基因发挥显性失活作用阻碍p53的抑癌作用,被认为是致癌基因,也有报道称其可与p53突变体结合,发挥抑癌作用。在胃癌中,?Np63α抑制肿瘤细胞增殖,但在乳腺癌中促进肿瘤细胞增殖。在肺癌中?Np63α抑制细胞迁移,在乳腺癌中却促进细胞迁移。在乳腺癌、头颈部鳞癌和肺癌中,高表达的?Np63α肿瘤化疗药物敏感性增强;而在膀胱癌、卵巢癌和前列腺癌中,高表达的?Np63α会降低化疗药的敏感性。针对以上问题,本研究用CRISPR/Cas9基因编辑技术将?Np63α基因定点敲入小鼠胰腺癌细胞DT6606,并对其在肿瘤细胞增殖、迁移、细胞干性和药物敏感性等方面的作用进行研究。方法1.px330-rosa26-sgRNA切割载体和同源重组打靶载体p Rosa26-?Np63α的构建。利用ZIFIT网站设计针对小鼠基因Rosa26位点的sgRNA序列,合成后,连接到px330质粒构建px330-Rosa26-sgRNA载体质粒。通过PCR获得目的基因片段,先连接到pc DNA3.1质粒上,获取CMV启动子和zeocin抗性标记之后,将片段连接到p Rosa26-1同源臂载体上,构建成同源重组打靶载体p Rosa26-?Np63α。2.细胞转染实验及阳性细胞的筛选。利用lipo2000脂质体转染试剂,将同源重组打靶载体p Rosa26-?Np63α和px330-Rosa26-sgRNA载体共转染小鼠胰腺癌细胞DT6606,通过抗性标记博来霉素(Zeocin)筛选,初步获取具有抗性的转染细胞,用PCR鉴定?Np63α是否敲入。用q PCR检测Rosa26基因片段的含量来对?Np63α插入位置定位。3.?Np63α的表达及其对胰腺癌细胞增殖、迁移、细胞干性和化疗药物敏感性的观察。通过q PCR和免疫细胞化学,分别从RNA和蛋白水平检测?Np63α的表达情况;通过长时间动态活细胞成像系统,检测细胞群体增殖情况;通过克隆形成实验,检测单个细胞的增殖能力;用划痕实验检测细胞的迁移能力;通过干细胞球体形成实验来检测细胞的干性,用MTS实验来检测细胞对化疗药物的敏感性。结果1.成功构建了CRISPR/Cas9系统切割载体px330-rosa26-sgRNA和同源重组打靶载体p Rosa26-?Np63α。2.通过有限稀释法筛选单克隆细胞,成功的构建了在Rosa26位点定点敲入?Np63α基因的小鼠胰腺癌细胞亚系1B9和2D5,其中1B9比2D5具有更高的?Np63α的表达量。3.相较于DT6606细胞,1B9细胞形态发生了变化,细胞可呈卵圆形且成团生长,细胞间的界限不清,2D5细胞无明显变化。4.相较于DT6606细胞,2D5细胞有更强的增殖能力和迁移能力,1B9细胞的增殖能力明显降低,迁移能力无变化。肿瘤干细胞成球实验中,1B9和2D5的球体量都增多,但1B9细胞有更多的球体数量(p<0.001)。5.相对于DT6606细胞,1B9和2D5对胰腺癌化疗药吉西他滨的敏感性增高;其中1B9的敏感性低于2D5(p<0.001)。结论1.成功的构建了在Rosa26位点定点插入并高表达?Np63α的小鼠胰腺癌细胞DT6606的细胞亚系1B9和2D5。2.小鼠胰腺癌细胞在亚系形成、增殖、迁移、细胞干性和化疗药物敏感性等方面存在异质性。3.在Rosa26位点定点敲入?Np63α可促进小鼠胰腺癌细胞的干性并提高其对化疗药物吉西他滨的敏感性。

(2)本文研究方法

调查法:该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法:用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法:通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法:通过调查文献来获得资料,从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法:依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法:对研究对象进行“质”的方面的研究,这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法:通过具体的数字,使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法:运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法:这是社会科学用来分析社会现象的一种方法,从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法:通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

小鼠胰腺癌细胞论文参考文献

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小鼠胰腺癌细胞论文-谢俊木子,田文聪,袁向飞,胡立娟,王丰
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