导读:本文包含了双顺反子质粒论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:内部核糖体结合位点,人肿瘤坏死因子-α,单克隆抗体,CHO细胞
双顺反子质粒论文文献综述
李计来,崔文禹,王欣怡,刘敬,郝少杰[1]（2017）在《内部核糖体结合位点介导的叁顺反子抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体表达质粒的构建及在CHO细胞中的表达》一文中研究指出目的构建内部核糖体结合位点(internal ribosome entry site,IRES)介导的叁顺反子抗人肿瘤坏死因子-α(human tumor necrosis factor-α,hTNF-α)单克隆抗体的表达质粒,并在CHO细胞中进行表达。方法采用重迭延伸PCR(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)技术扩增hTNF-α抗体的轻、重链基因,并与IRES基因连接,将连接产物LC-IRES-HC基因克隆至pOptiVEC~(TM)-TOPO~?TA载体,构建单表达载体pOptiVEC-LIH。将单表达载体pOptiVEC-LIH及共转染载体pOptiVEC-HC和pcDNA3.3-LC分别电转至CHODG44细胞,经氨甲喋呤(methotrexate,MTX)加压筛选稳定转染细胞,有限稀释法筛选高表达单克隆细胞株,并采用3 L反应罐对高表达株进行补料批次发酵培养。结果经测序鉴定,单表达载体pOptiVEC-LIH构建正确。瞬时转染后,单表达载体pOptiVEC-LIH转染组的抗体表达量明显高于共转染载体p Opti VEC-HC和pcDNA3.3-LC(P<0.05);经稳定转染有限稀释筛选后,共获得132个克隆,其中A值>2.0的克隆有18株,应用3 L反应器补料批次发酵培养,其表达量可达250 mg/L。结论成功构建了叁顺反子抗hTNF-α单克隆抗体的表达质粒,并在CHO细胞中进行了表达。(本文来源于《中国生物制品学杂志》期刊2017年12期）
张娈娈,陈利苹,曹俊,崔保亮,李华芳[2]（2014）在《结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒的构建及鉴定》一文中研究指出为了构建结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒,本研究利用重迭延伸PCR技术扩增出rv3802c-HisFlag基因片段,将其克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)上,测序验证后,将基因合成的内部核糖体进入位点和增强型红色荧光蛋白基因片段(IRES-DsRed2)定向插入到这个重组质粒上,经酶切鉴定获得双顺反子表达质粒pC3.1-3LHF-Red。将质粒pC3.1-3LHF-Red转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,通过荧光显微镜观察到增强型红色荧光蛋白成功表达;经Western blot分析表明Rv3802c-HisFlag融合蛋白在CHO细胞中获得了表达。结果表明,本研究成功构建了共表达增强型红色荧光蛋白和Rv3802c-HisFlag融合蛋白的双顺反子表达质粒pC3.1-3LHF-Red,为进一步研究结核分枝杆菌Rv3802c蛋白在分枝杆菌感染细胞过程中的作用奠定基础。(本文来源于《畜牧与兽医》期刊2014年10期）
曲鑫建,刘天庆,宋克东,李香琴,葛丹[3]（2013）在《多顺反子质粒重编程人脂肪干细胞为诱导多能干细胞》一文中研究指出为建立多顺反子质粒载体转染技术获得人脂肪干细胞(adipose stem cells,ASCs)来源的诱导多能干细胞(inducedpluripotency stem cells,iPSCs),应用2A元件连接Oct4/Sox2/KLF4/c-Myc四因子基因,构建为单一开放阅读框的多顺反子质粒载体.使用该质粒对ASCs进行转染及重编程为iPSC.采用形态学观察、特异性抗体免疫荧光鉴定、体外拟胚体诱导分化和体内畸胎瘤形成等方法进行鉴定.结果显示,ASCs成功重编程为iPSCs,具有与人胚胎干细胞相似的形态学及多向分化潜能;通过拟胚体和畸胎瘤实验证实iPSCs能在体内外分化成叁胚层细胞;DNA印迹实验显示质粒载体序列未整合至iPSCs基因组中.因此,通过多顺反子质粒载体重编程技术成功建立的人iPSCs具有多向分化潜能,可减免发生插入突变和免疫排斥问题,为iPSCs在遗传性或退行性疾病的治疗奠定了实验基础.(本文来源于《生物化学与生物物理进展》期刊2013年05期）
曲鑫建[4]（2013）在《多顺反子质粒载体重编程脂肪间充质干细胞为诱导多能干细胞》一文中研究指出诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是通过向分化的体细胞转入特定的外源转录因子进行重编程,从而获得具有自我更新能力和多能性的细胞。iPSCs具有形成体内所有细胞类型的潜能,尤其是能以患者自身体细胞制备iPSCs可用于特定疾病的治疗,不但能解决干细胞临床应用所遇到的免疫排斥问题和伦理医学等难题,而且在基础研究、再生医学以及药理科学中也有着广阔的发展前景和重要的意义。目前,iPSCs的来源主要是将细胞导入外源基因进行重编程而获得。但是根据细胞种类的不同,所采用的具体基因组合和转基因方式各不相同,获得的iPSCs的质量也不尽相同,存在着安全性等方面的隐患。为提高产生iPSCs的安全性,本研究采用多顺反子质粒载体在无饲养层细胞条件下重编程脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)获得iPSCs,旨在为再生医学的深入研究和应用提供更安全便利的细胞源。首先,构建了两种多顺反子质粒载体pIRES2-OSKM-EGFP和pIRES2-OS-EGFP。以分别实现四因子和两因子多顺反子质粒载体转染人ADSCs的目标。先以重迭PCR方法将酶切位点(EcoR I、SaL l和BamH I)与具有自我剪切功能的2A元件(P2A、T2A和E2A)序列插入至Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc基因序列之间；再将各个基因片段连接(Oct4-P2A-Sox2-T2A-Klf4-E2A-c-Myc, OSKM)构建成单个开放阅读框(open reading frame, ORF);最后以双酶切、连接的方式插入pIRES2-EGFP质粒载体,构建成携带四因子的多顺反子质粒载体pIRES2-OSKM-EGFP.随后以Nhe I酶切pIRES2-OSKM-EGFP作为模板,利用PCR方法克隆Oct4-P2A-Sox2片段,再以重迭PCR方法在Oct4-P2A-Sox2序列两端添加酶切位点Nhe I和Sac I,然后以双酶切、连接的方式插入pIRES2-EGFP质粒载体,构建成携带Oct4和Sox2两个基因的多顺反子质粒载体pIRES2-OS-EGFP。经过设计特异引物进行PCR反应和测序鉴定,证实所构建的两种多顺反子质粒载体序列正确。因此,本实验成功采用2A元件构建了两种质粒载体pIRES2-OSKM-EGFP和pIRES2-OS-EGFP。然后,先使用构建的四因子多顺反子质粒pIRES2-OSKM-EGFP载体转染人ADSCs,在无饲养层细胞条件下将其重编程为iPSCs。首先分离培养ADSCs,将传代培养至第四代的ADSCs用pIRES2-OSKM-EGFP质粒载体转染一次,间隔4天后进行第二次转染。光学显微镜下观察,在转染后的3～4周,当有明显的细胞克隆出现时,将集落边缘界限清晰的细胞克隆进行挑取,并分离传代培养与鉴定。对重编程细胞的相关检测结果表明：细胞克隆的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)表现为阳性；定量RT-PCR检测内源性多潜能相关基因Oct4、Sox2、 Klf、 c-Myc和TERT的mRNA呈高水平表达；免疫荧光细胞化学显示其表达多能性标志蛋白分子Oct4、 Nanog、TRA-1-60和SSEA4;细胞保持正常核型。更重要的是,Southern blot检测结果表明,无质粒载体序列插入／整合到iPSC基因组中。此外,体外分化实验证实可形成拟胚体(embryonic bodys, EBs)并具有分化成叁胚层细胞类型的能力；体内分化实验则表明,该细胞可形成畸胎瘤并具有分化形成叁个胚层组织的能力。因此,本实验成功使用多顺反子质粒载体转染了ADSCs,并将其重编程为iPSCs;经过细胞特异性标记基因检测和分化能力检测,证实iPSCs具有类似胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)的形态与功能。接着,使用仅携带两个多能性因子Oct4和Sox2的多顺反子质粒pIRES2-OS-EGFP载体转染ADSCs并将其重编程为具备多能性细胞特点与功能的iPSCs.先以pIRES2-OS-GFP质粒载体第一次转染ADSCs细胞,以转染当天计为向iPSCs诱导的第0天,在第7天后进行第二次转染。在含有4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)的干细胞培养液中培养传代,21天后逐步分离出集落边缘界限清晰的细胞克隆。高倍镜下集落中的单个细胞核较大,核质比例较高；细胞集落生长稳定,核型正常；AP检测其为阳性；免疫细胞化学检测细胞表达Oct4、Nanog、 TRA-1-60和SSEA4; RT-PCR检测其表达ESCs的标志基因。经体内体外分化实验,可分别检测到形成叁个胚层的EBs和畸胎瘤,并且无质粒载体序列插入／整合至iPSCs基因组中。上述实验结果显示,只采用多顺反子质粒载体携带Oct4和Sox2两个转录因子转染ADSCs,仍然可以使其重编程为iPSCs。最后,使用多顺反子质粒pIRES2-OSKM-EGFP载体重编程ADSCs获得多能性后,又进行了该细胞向神经细胞诱导分化的研究。先使用质粒载体对传代至第六代的ADSCs转染操作,以转染操作当天计为第0天。为达到更高转染效率,细胞培养4天后进行第二次转染。在第一次转染后的第7天,将原来的ADSCs生长培养基更换为添加G418药物的筛选培养基；一周后,更换为不含有G418药物的培养基。细胞进行药物筛选后继续培养。相关结果表明：经免疫荧光细胞化学检测,重编程细胞表达多能性蛋白标记Oct4、 Nanog、TRA-1-60、TRA-1-81和SSEA4; RT-PCR结果显示,细胞不仅表达多能性相关基因Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc,还表达ESCs多能性特异基因REX1和TERT;细胞核型正常,无质粒载体序列插入／整合到iPSCs基因组中。而且,将重编程的多能细胞培养在神经诱导分化培养基中,并经过3周的诱导培养后,细胞表达神经细胞相关蛋白标志分子Nestin、GFAP、TUJl、RIP和Nurrl。进而通过免疫细胞化学技术,在培养板中随机选取不同视野,计算了表达不同蛋白标志分子阳性细胞与总细胞数目比例,结果显示：GFAP70.5±8.0%(n=258)、 TUJ182.7±7.3%(n=266)、RIP60.4±5.2%(n=212)和Nurr173.6±9.2%(n=244).因此,本试验经过细胞形态和标志分子表达检测,成功诱导了ADSCs来源的多能细胞,并使其向神经细胞发生了分化。本研究分别构建多顺反子质粒载体pIRES2-OSKM-EGFP和pIRES2-OS-EGFP,在无饲养层细胞条件下分别重编程ADSCs获得iPSCs,提高了所产生的iPSCs的安全性。(本文来源于《大连理工大学》期刊2013-04-15）
李科,李君武,苏泽轩,刘艳[5]（2009）在《肾癌G250基因和hGM-CSF基因双顺反子表达质粒的构建及鉴定》一文中研究指出目的应用分子生物学技术,构建pIG250-GM双顺反子真核表达质粒并进行测序鉴定。方法从肾癌组织中提取总RNA,采用RTPCR技术扩增肾癌G250抗原的基因编码区序列,同时从质粒pORF-hGM-CSF中扩增出基因佐剂hGM-CSF,分别克隆到真核表达载体pIRES的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建pIG250-GM真核表达质粒,并进行酶切鉴定。结果酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.44kμ和0.47kμ,测序分析表明克隆的G250和hGM-CSF序列与GenBank上公布序列完全一致。结论成功构建双顺反子表达pIGM-G250质粒,为研究G250-GMCSF基因负载的DC疫苗防治肾癌提供了必要的实验基础。(本文来源于《中国现代医学杂志》期刊2009年08期）
唐梦君,王红宁,周生,徐永莉,鲜凌瑾[6]（2007）在《IBV的S1、M、N基因与IL-2、IL-18基因双顺反子质粒DNA疫苗研究》一文中研究指出前言：禽传染性支气管炎是危害养禽业的重大传染病之一,该病在我国大部分地区相继流行,其发病率 100％,死亡率10％～30％。国内每年由此病造成的经济损失超过十亿元。对 IB 的 DNA 疫苗的研究发(本文来源于《第15届世界禽病大会、中国畜牧兽医学会2007年学术年会论文集》期刊2007-09-01）
李君武,周曙光,黄泽棋,李晓栋,宋东[7]（2007）在《结核杆菌Hsp65和hGM-CSF双顺反子表达质粒的构建与表达》一文中研究指出目的:应用分子生物学技术,构建pIHsp65GM双顺反子真核表达质粒,并在真核细胞中表达.方法:以结核分枝杆菌H37Rv株基因组为模板经聚合酶链反应(PCR)扩增出Hsp65基因,同时从质粒pORF-hGM-CSF中扩增出基因佐剂hGM-CSF,分别克隆到真核表达载体pIRES的多克隆位点A(MCSA)和B(MCSB)中,构建pIHsp65GM真核表达质粒,并转染HepG-2细胞中表达和检测.结果:酶切鉴定提示插入的基因片段大小分别为1.64kb和0.47kb,测序分析表明克隆的Hsp65和hGM-CSF序列与GenBank上公布序列完全一致;免疫组织化学方法检测到表达Hsp65的阳性细胞;ELISA方法检测到pIHsp65GM转染组细胞培养上清中hGM-CSF的表达,与空载体对照组比较差异有统计学意义(P<0.01).结论:成功构建和表达了pIHsp65GM质粒,为研制优于卡介苗的新型抗结核病DNA疫苗奠定基础.(本文来源于《第四军医大学学报》期刊2007年13期）
刘焰,彭剑虹,马立新,刘君炎,曹晓春[8]（2006）在《结核分枝杆菌Ag85B与IL-2基因双顺反子真核表达质粒的构建及体外表达》一文中研究指出目的:构建结核分枝杆菌Ag85B与白细胞介素2(IL-2)双顺反子真核表达质粒。方法:以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,通过PCR扩增出Ag85B基因。采用亚克隆的技术从pcDNA3.1-IL-2中获得小鼠IL-2基因的cDNA片段。将两者分别定向插入真核双表达载体pIRES,构建表达两个目基因的双顺反子重组质粒,然后用脂质体包裹体外转染A549细胞,RT-PCR检测Ag85B及IL-2的表达。结果:酶切分析及序列测定证实重组质粒构建正确;该重组质粒能在体外表达Ag85B及IL-2 mRNA。结论:成功构建了结核杆菌Ag85B及IL-2基因双顺反子真核表达质粒,为进一步在整体动物水平的实验研究奠定了基础。(本文来源于《武汉大学学报(医学版)》期刊2006年06期）
廖国阳,孙明波,张新文,陈俊英,姜述德[9]（2006）在《HBs和HCVc基因双顺反子质粒在BALB/c小鼠体内的分布》一文中研究指出采用注射含双顺反子质粒后,PCR法扩增不同组织中HBsAg和HCVc基因,同时检测HBV和HCV抗体应答水平.研究注射基因免疫用双顺反子质粒在小鼠组织中的分布.pcDNA3.0BApc154S2S 1次注射BALB/c小鼠后,24 h内主要分布于血液、肝、脾、骨髓、淋巴结、注射部位肌肉、肺和肾等含血液丰富的组织中.注射后2 d主要在骨髓、血液和注射部位肌肉中存在.7 d后仅在注射部位肌肉中能检测出来,并可持续到第9周.组织切片镜检质粒注射初期肌肉细胞轻度浊肿,随后肌膜细胞轻度增生,未见其它明显的组织病理学变化.质粒多次免疫BALB/c小鼠未见明显的临床症状和病理组织学变化.质粒在小鼠体内不同组织存在时间不一致.(本文来源于《云南大学学报(自然科学版)》期刊2006年03期）
张淼涛,白华,童德文[10]（2006）在《双顺反子表达质粒在DNA疫苗研究中的应用》一文中研究指出简述了DNA疫苗的研究概况,介绍了真核双表达质粒的结构特点及其在基因佐剂和二价DNA疫苗中的应用情况,总结分析了双表达质粒的优点和存在的问题,并对其今后在DNA疫苗中的研究方向和前景进行了展望。(本文来源于《中国兽医科学》期刊2006年05期）
双顺反子质粒论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
为了构建结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒,本研究利用重迭延伸PCR技术扩增出rv3802c-HisFlag基因片段,将其克隆到真核表达载体pCDNA3.1(+)上,测序验证后,将基因合成的内部核糖体进入位点和增强型红色荧光蛋白基因片段(IRES-DsRed2)定向插入到这个重组质粒上,经酶切鉴定获得双顺反子表达质粒pC3.1-3LHF-Red。将质粒pC3.1-3LHF-Red转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,通过荧光显微镜观察到增强型红色荧光蛋白成功表达;经Western blot分析表明Rv3802c-HisFlag融合蛋白在CHO细胞中获得了表达。结果表明,本研究成功构建了共表达增强型红色荧光蛋白和Rv3802c-HisFlag融合蛋白的双顺反子表达质粒pC3.1-3LHF-Red,为进一步研究结核分枝杆菌Rv3802c蛋白在分枝杆菌感染细胞过程中的作用奠定基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
双顺反子质粒论文参考文献
[1].李计来,崔文禹,王欣怡,刘敬,郝少杰.内部核糖体结合位点介导的叁顺反子抗人肿瘤坏死因子-α单克隆抗体表达质粒的构建及在CHO细胞中的表达[J].中国生物制品学杂志.2017
[2].张娈娈,陈利苹,曹俊,崔保亮,李华芳.结核分枝杆菌rv3802c基因双顺反子真核表达质粒的构建及鉴定[J].畜牧与兽医.2014
[3].曲鑫建,刘天庆,宋克东,李香琴,葛丹.多顺反子质粒重编程人脂肪干细胞为诱导多能干细胞[J].生物化学与生物物理进展.2013
[4].曲鑫建.多顺反子质粒载体重编程脂肪间充质干细胞为诱导多能干细胞[D].大连理工大学.2013
[5].李科,李君武,苏泽轩,刘艳.肾癌G250基因和hGM-CSF基因双顺反子表达质粒的构建及鉴定[J].中国现代医学杂志.2009
[6].唐梦君,王红宁,周生,徐永莉,鲜凌瑾.IBV的S1、M、N基因与IL-2、IL-18基因双顺反子质粒DNA疫苗研究[C].第15届世界禽病大会、中国畜牧兽医学会2007年学术年会论文集.2007
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[9].廖国阳,孙明波,张新文,陈俊英,姜述德.HBs和HCVc基因双顺反子质粒在BALB/c小鼠体内的分布[J].云南大学学报(自然科学版).2006
[10].张淼涛,白华,童德文.双顺反子表达质粒在DNA疫苗研究中的应用[J].中国兽医科学.2006