一、低温保存犊牛睾丸组织生产猪瘟细胞苗效果观察（论文文献综述）
陈昕迪[1]（2019）在《牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立》文中研究表明牛病毒性腹泻病毒（BVDV）感染牛表现出一种复杂,多种临床表现的疾病,主要为腹泻、急性及慢性黏膜病、先天性缺陷、免疫抑制、免疫耐受、持续性感染、母畜流产,死胎和畸形胎等[1],该传染病严重影响了世界养牛业的发展。随着规模化养殖和种畜的频繁调运,该病在我国流行趋势也逐渐上升,给养牛业带来了巨大的经济损失[2]。本研究利用从内蒙古周边某些牧场采集的鼻拭子样本和血液样本,样本经处理后,分别接种已长成单层的MDBK细胞培养瓶,用已设计好的引物PCR鉴定为阳性后分离出牛病毒性腹泻病毒,利用纯化后的病毒进行后续的试验。首先我们分析了牛病毒性腹泻病毒（BVDV-1）E2蛋白的主要编码区,利用PCR扩增技术将BVDV-1 E2基因定向克隆到表达载体Pcold-TF上,将Pcold-TF-E2转化至感受态细胞BL21中,使用IPTG进行重组蛋白的诱导表达,诱导表达的条件为0.8 mMol/L IPTG 37℃诱导4 h。收集菌液,经过超声破碎裂解后,利用Ni-IDA蛋白纯化试剂盒纯化后进行SDS-PAGE和Western blot鉴定,表达的重组蛋白E2鉴定大小为82 Kda,与预期条带相符。使用裂解表达、纯化后的产物E2蛋白,作为包被抗原,建立了用于检测牛病毒性腹泻病毒的间接ELISA方法。确定反应的最佳条件为:抗原包被浓度为8 ug/mL,最佳包被温度和时间为4℃ 16 h,一抗血清稀释比为1:100,反应温度和时间为37℃1 h,最佳封闭液为10%PEG4000,37℃封闭1 h,酶标二抗的稀释度为1:6000,反应温度和时间为37℃1h。通过试验确定阴阳判定的临界值为0.33。该方法与牛传染性鼻气管炎、牛传染性胸膜肺炎、赤羽病、副结核、布鲁菌病,小反刍兽疫等阳性血清均无交叉反应,说明该方法具有良好的特异性,将BVDV的阳性血清稀释至1:4096时仍可判断为阳性,表明所建立的方法具有较高的敏感性,组间和组内重复试验变异系数均小于5%,表明该方法具有较好的重复性。采用以上建立的间接ELISA方法和通过IDEXX BVDV抗体检测试剂盒检测189份血清临床样品,两者的符合率为92.8%。由以上结果可知,本试验建立的间接ELISA方法可以为该病的快速诊断,以及流行病学调查等提供便捷有力的手段,且价格成本低廉。
韦雪华[2]（2017）在《CSFV/BVDV双重荧光RT-PCR检测方法的建立与山东地区CSFV的分子生物学研究》文中研究表明猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种高度接触性致死性传染病,现阶段,猪瘟的防控通常采用猪瘟兔化弱毒疫苗（C株）进行接种预防,该疫苗是世界上公认的最有效和安全的弱毒疫苗,对猪瘟的防控起到了重要的作用。然而,在免疫良好的猪场仍有猪瘟的病例的发生,CSFV与牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）同属于黄病毒科、瘟病毒属,存在抗原相关性和交叉反应性,两者自然条件下感染猪,其临床症状和病理变化相似,加大了临床诊断的困难。为了解山东地区CSFV的流行状况和更好地进行CSFV的监测,本试验建立了双重荧光RT-PCR（RT-qPCR）检测方法,并对成功分离的CSFV的C、E0、E1基因和E2部分基因进行了克隆测序和遗传进化分析。为建立CSFV和BVDV的鉴别检测方法,根据Genbank公布的基因序列设计特异性引物和TaqMan探针,以构建的CSFV Npro和BVDV 5′-UTR的阳性重组质粒作为阳性质控品,优化反应条件,建立了双重RT-qPCR检测方法。以阳性质控品和常见病毒为模板进行了特异性、灵敏性和重复性试验,并应用于临床检测。结果,CSFV和BVDV的检测灵敏度均为100拷贝/μl,特异性强、稳定性好。应用所建立的RT-qPCR方法和本实验室常用单项CSFV RT-qPCR试剂盒和单项BVDV RT-qPCR试剂盒对本实验室2016年采集的206份猪病料进行检测,结果显示CSFV阳性59份、BVDV皆为阴性,与常用单项CSFV和BVDV RT-qPCR试剂盒检测结果一致。本研究建立的双重RT-qPCR整个检测过程不到3h,采取闭管反应,检测完毕直接处理,避免开盖造成气溶胶污染,具有简单、快捷、灵敏度高、生物安全性好等优点,可用于CSFV和BVDV的临床鉴别检测,且BVDV-1和BVDV-2皆能检出,为2种病毒的交叉污染的检测提供一种方便、快捷的方法。本研究采取体外培养技术,选取来自济南、德州、临沂、泰安、日照、淄博、济宁等地区的26份CSFV阳性病料接种PK15细胞进行病毒分离,成功分离了26株CSFV,分别命名为SDJN-1、SDJN-2、SDJN-3、SDJN-4、SDJN-5、SDDZ-1、SDDZ-2、SDDZ-3、SDQH-1、SDQH-2、SDQH-3、SDQH-4、SDQH-5、SDQH-6、SDQH-7、SDXJ-1、SDXJ-2、SDXJ-3、SDLY-1、SDLY-2、SDRZ-1、SDZB-1、SDTA-1、SDTA-2、SDSS-1、SDLS-1。采用猪瘟野毒荧光RT-PCR试剂盒对26株分离株进行了检测,结果表明其皆为野毒株。采用分子克隆技术对已分离的26株CSFV C、E0、E1基因和E2部分基因序列进行扩增、克隆、测序,并利用DNAStar软件对测序结果进行序列拼接并分析,同源性分析发现,26株分离株之间核苷酸和推导氨基酸同源性都很高,分别为为91.1%-99.2%、93.8%-99.6%,与其他毒株同源性最低的是SDJN-3;与Shimen、HCLV、pardarborn、HEBZ等8株经典猪瘟毒株比较,核苷酸同源性为83.8%-96.2%和氨基酸同源性为88.6%-97.6%;利用MEGA6软件对26株分离株与8株已知参考毒株序列进行比较,绘制系统发生树发现,所比较的34株分离株分为2个分支,Shimen株、HCLV疫苗株与Brescia株组成一支为1群;其他毒株为一支组成2群,其中26株分离株与Parderborn、HEBZ株亲缘关系较近组成一支为2.1群,CSFV39株为2.2群,Alfort/Tueginen株与SP01株组成一支为2.3群,结果表明本研究分离的26株CSFV属于2.1亚群,是山东地区的优势毒株。
王春伟[3]（2014）在《不同冷冻保护剂对犊牛睾丸组织冷冻保存效果的研究》文中研究表明睾丸组织的冷冻保存为雄性生殖细胞的保存、珍稀濒危物种的保护以及人类辅助生殖技术等提供了新的途径。冷冻睾丸组织能够避免酶解造成细胞存活率降低，机械分离破坏细胞间连接造成细胞缺氧加重等影响。但与常见的细胞冷冻保存相比较，冷冻保存睾丸组织结构和功能复杂，技术难度较大。为探索不同冷冻保护剂对犊牛睾丸组织的冷冻保护效果，筛选犊牛睾丸组织冷冻保存合适的冷冻保护剂，本试验选择二甲基亚砜、甘油、丙二醇、蔗糖和葡萄糖原花青素作为犊牛睾丸组织冷冻保存的保护剂，对8月龄犊牛睾丸组织进行冷冻保存，检测冷冻前后犊牛睾丸组织内一氧化氮（NO）、一氧化氮合酶（NOS）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和睾酮等生化指标的变化以及细胞活率，揭示影响睾丸组织冷冻保存效果的关键因素，旨在初步建立犊牛睾丸组织低损伤冷冻保存体系，为犊牛睾丸组织冷冻保存的进一步研究提供依据。主要研究结果如下：1.新鲜犊牛睾丸组织中NO含量为0.45±0.02μmol/mg，NOS活性为0.86±0.05U/mg，SOD活性为8.85±0.3U/mg，MDA含量为1.95±0.1nmol/mg，睾酮释放量为10.37±1.2nmol/l。2.经10%DMSO冷冻保存的睾丸组织解冻后，NO含量为0.52±0.01μmol/mg，NOS活性为1.03±0.03U/mg，MDA含量为2.56±0.6nmol/mg，显着低于DMSO其他浓度组（P＜0.05）；SOD活性为8.34±0.9U/mg，睾酮释放量为8.85±0.7nmol/L，细胞活率为77.00±0.01%，显着高于DMSO其他浓度组（P＜0.05）。DMSO对睾丸细胞和睾丸组织结构功能起到较好的作用，适合用于犊牛睾丸组织冷冻保存。3.经1mg/ml GSP冷冻保存睾丸组织后，睾丸组织中NO含量为0.49±0.01μmol/mg，NOS活性为0.90±0.08U/mg，MDA含量为2.22±0.4nmol/mg，显着低于GSP其他浓度组（P＜0.05）；SOD活性为8.77±0.9U/mg，显着高于GSP其他浓度组（P＜0.05）。GSP显着降低睾丸组织中NO含量和NOS活性，较好的保护睾丸组织的抗氧化能力，减少组织受到氧自由基的攻击。4.经10%PG冷冻保存睾丸组织后，睾丸组织中NO含量分别为0.66±0.01μmol/mg，NOS活性为1.08±0.06U/mg，MDA含量为2.39±0.3nmol/mg，显着低于PG其他浓度组（P＜0.05）；SOD活性为8.22±0.6U/mg，细胞活率为62.00±0.04%，显着高于PG其他浓度组（P＜0.05）。
白成友,陈天泽,郑玉晏,谢晓燕,谢君庆[4]（2012）在《猪瘟疫苗的研究现状及正确使用方法》文中提出猪瘟（CSF）是严重危害养猪业的古老传染病之一,其流行范围几乎遍布世界各地。猪瘟兔化弱毒疫苗（国际上称C株）对猪瘟预防有着显着地作用,有些国家已经利用此疫苗消灭了猪瘟,因此本文通过对猪瘟新型疫苗、免疫注射方法以及使用误区上进行综述,目的是为生产实践上猪瘟免疫提供参考。
蒙明璐[5]（2012）在《猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建》文中认为牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrheavirus, BVDV）与猪瘟病毒（HCV）和羊边界病病毒（BDV）同属于黄病毒科瘟病毒属的成员,BVDV除了能够引起牛的病毒毒性腹泻、粘膜病以及繁殖障碍等症状外,还可引起山羊、绵羊、猪、野牛、羊驼、白尾鹿等动物感染。猪主要通过与带毒动物接触或者使用被BVDV污染的疫苗感染BVDV,据报道猪感染BVDV可出现类似于猪瘟的临床症状和病理变化。由于在规模化养殖中混合感染日益严重,而且牛病毒性腹泻病毒与猪瘟病毒有着密切的联系,因此猪源牛病毒性腹泻病毒和猪瘟病毒的快速鉴别检测,对于猪群的混合感染、继发感染以及猪瘟疫苗生产中外源基因的检测和猪瘟免疫失败分析有着重要的意义。猪痘病毒（SPV）是痘病毒科,脊椎动物痘病毒亚科,猪痘病毒属中的唯一成员,在自然情况下,SPV只感染猪,并且感染非常温和,能自行康复。由于SPV有生物安全性和临床安全性好、较大的插入外源基因的能力及能诱导宿主产生良好的保护性免疫反应等优点,故适合作为载体用于开发重组疫苗。1猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与临床运用根据牛病毒性腹泻病毒5’端非编码区基因序列,设计合成了一对特异性引物,经过PCR反应条件的优化,建立了BVDV RT-PCR的检测方法,其PCR产物大小分别为186bp,对于BVDV的检测灵敏度为10TCID50,对于CSFV、PRRSV、PEDV、SPV和PCV的PCR扩增结果均为阴性；用该方法对169份临床样品进行了检测,结果BVDV有20份阳性,阳性率为11.8%,其中124份粪便样有11份阳性,22份组织样有4份阳性,23份猪瘟细胞苗样有5份阳性。成功测出两份阳性样PCR产物序列,并与代表毒株序列比对分析。本实验证明建立的RT-PCR检测方法具有快速、准确、低污染等优点,可用于临床样品中BVDV的检测。2表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的研制E2是BVDV囊膜糖蛋白含有病毒的主要抗原决定簇,能诱导机体产生保护性免疫反应,是BVDV的主要保护性抗原。本研究以BVDV标准毒株Oregon c24v基因组为模板扩增出E2基因,将E2基因连接到通用克隆载体pUSG11/P28上,构建出转移载体pUSG11/P28E2,利用SPV020和SPV021两基因间的非编码区作为产生重组猪痘病毒外源基因的插入位点,GFP基因作为一个显性筛选标记,获得的重组病毒rSPV-E2.通过PCR、western blotting和间接免疫荧光检测对rSPV-E2进行了鉴定,结果显示rSPV-E2能正确表达E2蛋白,重组猪痘病毒有望成为BVDV疫苗用于预防猪发生BVDV感染。
刘艳[6]（2011）在《猪瘟细胞苗生产工艺的优化及ELISA法在抗原定量测定中的应用》文中研究指明以猪瘟病毒中国兔化弱毒疫苗株（CSFV C株）为实验材料,首先采用常规细胞实时计数的方法,得到正常犊牛睾丸细胞增殖曲线和带毒睾丸细胞的增殖曲线,结果发现猪瘟病毒不仅不影响犊牛睾丸细胞的生长,反而促进细胞的分裂增殖,培养48小时时,带毒的牛睾丸细胞计数是未带毒细胞的117.5%。初步确立了该毒株在原代犊牛睾丸细胞中增殖的规律与基本特性。再进一步运用直接免疫荧光法确定出最佳细胞初始密度、最佳接毒量及接毒方式的产毒模型,建立了常规的病毒增殖曲线。以建立的细胞及病毒生长曲线及产毒模型为依据,根据GMP生产车间的实际情况,从生产种毒繁殖、原代细胞制备、CSFV的感染、CSFV感染后维持液的调节以及带CSFV的犊牛睾丸细胞的多次传代这几个对CSFV增殖有影响的因素方面入手进一步展开工作。严格控制生产种毒,优质达标的生产种毒,是疫苗病毒含量达标的必要保障。原代细胞制备过程中,依据《中华人民共和国兽用生物制品规程》（以下简称:《规程》）无菌摘取犊牛睾丸,在《规程》的指导基础上,调整消化时间、温度可以同时达到提高细胞数量及质量的双重效果。将《规程》消化时间调整为0.25%的胰酶37℃消化30 min后降低温度继续消化。结果,每1g睾丸组织可制备3×105个/ml细胞悬液400-500ml,是传统消化法的两倍,并且细胞活力明显增强,消化后期降低温度可减轻后期胰酶的作用强度,减少对已消化好细胞的伤害。脾组织毒对次代牛睾丸细胞有很强的刺激作用,生产接毒时适度减少组织毒,同时补入一定量病毒含量≥106细胞毒液,可减少组织毒对细胞的刺激作用,降低细胞的脱瓶率,提高病毒液的收次。在病毒液收获期间,增大维持液量,将《规程》中10%的维持液调节为20%,4天收获一次延长为8天收获一次,经兔体检验,病毒含量仍能达到5×104ml。病毒含量测定方面,应用猪瘟抗原/血清ELISA试剂盒（IDEXX HerdCheck Co.）对经兔体检验已知滴度的20份HCLV半成品细胞病毒液、10份兔体检验检验阴性HCLV半成品细胞病毒液、10份冻干成品疫及10份冻干脾淋苗进行抗原含量测定,并与兔体定型热反应法的结果进行对照,结果半成品检测结果与兔体检验相关率可达95%,成品75%。ELISA法可快速、稳定、简单地运用于HCLV细胞苗的半成品与成品的病毒含量测定,并可反向检测兔体检验的不敏感性,降低检验误判,同时提高产品的质量及产量。
陶海静[7]（2006）在《河南猪群HCV感染及防疫的流行病学调查》文中提出背景和目的 猪瘟（Hog cholera，HC或Classical Swine fever，CSF）是一种高度接触性传染病，其病原为猪瘟病毒（Hog cholera Virus，HCV或Classical Swine fever virus，猪瘟病毒），属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属(（Pestivirus）成员；该病呈世界范围流行，国际兽疫局将其列为A类16种法定传染病之一；到1992年全世界宣布消灭猪瘟的有24个国家。但从1993年开始，有些消灭猪瘟的国家如德国、英国和荷兰等又出现了猪瘟的流行；猪瘟是我国4大动物疫病之一，已流行了70多年；1956年周泰冲、袁庆志等研制成功的中国系（C系）猪瘟兔化弱毒疫苗（Hog Cholera Lapinized Virus，HCLV）是中国一直使用的唯一疫苗株。以此疫苗免疫为基础，我国于1956年提出了以预防接种为主的综合措施来消灭猪瘟的规划，推广应用至今，已取得显着效果。但近年来由于养猪规模的扩大，据报道猪瘟在各地的发病率呈逐年上升趋势；在河南各地也有关于发生猪瘟的零星报导，且近几年它的表现形式比以前发生了较大的变化；主要表现为潜伏期较长、临床症状不典型、发病率和死亡率也相对较低以及仔猪先天感染、免疫失败、母猪持续性感染等。造成这些现象的主要原因可能是养猪业的饲养与管理水平落后，防疫检疫
赵守友,孙洪丽,郑若龙[8]（2004）在《低温保存犊牛睾丸组织生产猪瘟细胞苗效果观察》文中研究指明将犊牛睾丸置2～8℃保存96 h，按常规方法制备原代和次代细胞，并接种猪瘟兔化弱毒苗，结果表明细胞活力和产毒效价均可满足生产要求，从而建立了睾丸组织细胞活力保持的一种新方法。
朱良全[9]（2004）在《猪瘟兔化弱毒（C株）和鸡马立克火鸡疱疹病毒（HVT）病毒保护剂的研究》文中研究说明本试验将6种病毒保护剂基质运用于PKl5细胞,鸡胚成纤维细胞,带毒牛睾丸细胞,通过细胞形态学实时观察法筛选出一种病毒保护剂Ⅰ,并确定其工作浓度为10%。 通过建立PK15细胞、猪瘟Thiveosal株及病毒保护剂三者相互关系模型,为提高猪瘟细胞疫苗的效价构建理论规律。首先,我们运用常规细胞实时计数法,建立PK15细胞增殖曲线和带毒PK15细胞的增殖曲线,发现猪瘟病毒对PK15细胞不但不产生细胞病变,反而促进细胞的分裂增殖,在48小时细胞生长的对数期,带毒的PK15细胞的分裂增殖数是未带毒细胞的131.5%。 运用直接免疫荧光法筛选出最佳细胞密度、最佳接毒量及最佳接毒方式的产毒模型。建立了常规对照组（未加病毒保护剂）的病毒增殖曲线和加入病毒保护剂的病毒增殖曲线,从两者对比结果看,直接免疫荧光检测病毒保护剂增殖病毒的结果并不明显,但相同滴度下加入病毒保护剂组测得荧光斑较亮且致密。进一步运用活细胞染色排除法证明病毒保护剂具有提高带毒细胞数量的功能。同样原始的细胞经过60h后,试验组的带毒活细胞数是对照组的1.22倍,而活细胞比率基本一致。运用MTT活力测定同样验证了试验组活细胞增幅优于对照组。生产应用中提取的样品病毒蛋白浓度测定表明试验组的病毒浓度比对照组提高22%。 病毒保护剂运用于猪瘟兔化弱毒牛睾丸细胞毒疫苗生产中,发现20%的病毒保护剂对产毒有轻微损伤作用,10%的病毒保护剂测毒的兔体热型反应统计数是对照组的两倍。试验组和对照组的反复冻融试验表明对照组反复冻融6次即为临界点,超过6次即达不到配苗的要求,而加入病毒保护剂后反复冻融10次,也能达到配苗的要求。冷冻保存期试验表明对照组保存3月合格,而病毒保护剂组可保存到5个月合格。37℃耐热试验表明对照组置37℃8小时合格,而病毒保护剂组置37℃10小时达到合格。 通过细胞毒电镜观察及主要保护性抗原基因E2、E0测序比对结果表明:病毒保护剂不影响病毒粒子形态的变化,且不产生基因突变。抗体水平检测和免疫攻毒试验结果表明:病毒保护剂能刺激机体早期中和抗体的产生,且免疫保护力坚强。
二、低温保存犊牛睾丸组织生产猪瘟细胞苗效果观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、低温保存犊牛睾丸组织生产猪瘟细胞苗效果观察（论文提纲范文）
（1）牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 牛病毒性腹泻病毒概述 |
| 1.1.1 病原性 |
| 1.1.2 抗原性 |
| 1.2 牛病毒性腹泻的流行状况 |
| 1.3 BVDV的检测 |
| 1.3.1 抗原的检测 |
| 1.3.2 抗体的检测 |
| 1.4 病理学变化 |
| 1.5 诊断 |
| 1.6 防治 |
| 1.7 试验研究目的及意义 |
| 2 BVDV的分离与鉴定 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 细胞及主要材料 |
| 2.1.2 主要设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的设计 |
| 2.2.2 细胞的制备 |
| 2.2.3 病毒的培养 |
| 2.2.4 病毒RNA的提取 |
| 2.2.5 RT-PCR |
| 2.2.6 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.7 测定基因组序列 |
| 2.2.8 间接免疫荧光试验 |
| 2.2.9 TCID_(50)测定病毒滴度 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒的增殖 |
| 2.3.2 RT-PCR扩增结果 |
| 2.3.3 测序结果 |
| 2.3.4 间接免疫荧光试验结果 |
| 2.3.5 病毒TCID_(50)测定结果 |
| 2.4 讨论 |
| 3 BVDV E2蛋白的原核表达 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 细胞及质粒 |
| 3.1.2 病毒 |
| 3.1.3 主要试剂与仪器 |
| 3.1.4 主要溶液 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 引物的设计与合成 |
| 3.2.2 细胞中病毒RNA的提取 |
| 2.2.3 cDNA的合成 |
| 3.2.4 E2基因的扩增 |
| 3.2.5 产物胶回收 |
| 3.2.6 E2基因重组表达载体的构建 |
| 3.2.7 重组质粒的转化 |
| 3.2.8 重组质粒的鉴定 |
| 3.2.9 重组质粒转化至表达菌 |
| 3.2.10 重组蛋白的诱导表达 |
| 3.2.11 纯化重组蛋白 |
| 3.2.12 蛋白的浓缩 |
| 3.2.13 重组蛋白Western blot检测 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 E2基因的扩增 |
| 3.3.2 重组质粒的双酶切鉴定 |
| 3.3.3 E2重组蛋白的表达 |
| 3.3.4 E2重组蛋白的纯化 |
| 3.3.5 重组蛋白Western blot鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 4 BVDV间接ELISA方法的建立 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 抗原及血清 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 间接ELISA方法的主要步骤 |
| 4.2.2 间接ELISA方法的建立 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 最佳抗原包被浓度及最佳血清稀释倍数的确定 |
| 4.3.2 封闭液的确定 |
| 4.3.3 二抗稀释度的确定 |
| 4.3.4 阴阳临界值判定标准的确定 |
| 4.3.5 特异性试验 |
| 4.3.6 敏感性试验 |
| 4.3.7 重复性试验 |
| 4.3.8 临床样品的检测 |
| 4.3.9 稳定性试验 |
| 4.4 讨论 |
| 5 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（2）CSFV/BVDV双重荧光RT-PCR检测方法的建立与山东地区CSFV的分子生物学研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 CSFV的生物学特性 |
| 1.1.1 CSFV的基因组特点 |
| 1.1.2 CSFV编码的结构蛋白 |
| 1.1.3 我国CSFV基因分群 |
| 1.2 猪瘟疫苗质量研究 |
| 1.3 猪源BVDV与CSFV的联系研究 |
| 1.3.1 猪感染BVDV的传染来源 |
| 1.3.2 非典型猪瘟的临床症状和病理变化 |
| 1.4 猪感染BVDV和CSFV的鉴别诊断 |
| 1.4.1 病毒的分离和鉴定 |
| 1.4.2 单克隆抗体技术 |
| 1.4.3 酶联免疫吸附试验（ELISA） |
| 1.4.4 核酸杂交试验技术（NAH） |
| 1.4.5 反转录-多聚酶链式反应（RT-PCR） |
| 1.4.6 实时荧光定量RT-PCR技术 |
| 1.5 我国CSF发病原因分析 |
| 1.5.1 免疫程序的影响 |
| 1.5.2 母源抗体的干扰 |
| 1.5.3 疫苗效价的影响 |
| 1.5.4 免疫抑制病的影响 |
| 1.5.5 母猪带毒综合征 |
| 1.6 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒和病料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 CSFV/BVDV双重RT-qPCR方法的建立及初步应用 |
| 2.2.2 病毒的分离鉴定 |
| 2.2.3 山东地区CSFV分子生物学特征的研究 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 CSFV/BVDV双重RT-qPCR方法建立的结果 |
| 3.1.1 阳性质控品的制备及浓度确定 |
| 3.1.2 双重RT-qPCR条件的优化及标准曲线建立 |
| 3.1.3 特异性、重复性和敏感性试验结果 |
| 3.1.4 临床样品检测 |
| 3.2 病毒分离鉴定的结果 |
| 3.2.1 CSFV接种PK15细胞后细胞状态 |
| 3.2.2 病毒分离与RT-qPCR鉴定结果 |
| 3.3 山东地区CSFV分子生物学特性的研究的结果 |
| 3.3.1 PCR扩增结果 |
| 3.3.2 酶切鉴定结果 |
| 3.3.3 同源性分析结果 |
| 3.3.4 遗传进化分析结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 CSFV/BVDV双重RT-qPCR检测方法的建立 |
| 4.2 病毒的分离鉴定 |
| 4.3 山东地区CSFV分子生物学特性的研究 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（3）不同冷冻保护剂对犊牛睾丸组织冷冻保存效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 睾丸组织冷冻保存概述 |
| 1.1 睾丸组织冷冻保存的意义 |
| 1.2 国内外睾丸组织冷冻的研究进展 |
| 1.3 冷冻保护剂的研究进展 |
| 1.4 冷冻保护剂的保护机制 |
| 1.5 睾丸组织冷冻效果评估的研究进展 |
| 1.6 睾丸组织冷冻保存技术的应用前景 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 不同冷冻保护剂对睾丸组织冷冻-解冻后细胞活率的影响 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 不同冷冻保护剂对睾丸组织冷冻解冻后 NO、NOS 的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 新鲜睾丸组织内 NO 含量和 NOS 活性 |
| 3.2.2 不同冷冻保护剂对睾丸组织中 NO 含量的影响 |
| 3.2.3 不同冷冻保护剂对睾丸组织中 NOS 活性的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 不同冷冻保护剂对睾丸组织冷冻-解冻后 SOD、MDA 的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 新鲜睾丸组织中 SOD 活性和 MDA 含量 |
| 4.2.2 不同冷冻保护剂对犊牛睾丸组织中 SOD 活性的影响 |
| 4.2.3 不同冷冻保护剂对犊牛睾丸组织中 MDA 的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 不同冷冻保护剂对犊牛睾丸组织冷冻解冻后睾酮释放量的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 新鲜睾丸组织匀浆液中睾酮释放量的测定 |
| 5.2.2 解冻后睾丸组织中睾酮释放量的测定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论 |
| 进一步研究内容 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 主要溶液的配制 |
| 附录Ⅱ 犊牛睾丸组织的冷冻保存方法 |
| 附录Ⅲ 犊牛睾丸单细胞悬液的制备 |
| 附录Ⅳ 组织匀浆液制备 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）猪瘟疫苗的研究现状及正确使用方法（论文提纲范文）
| 1 常用的猪瘟疫苗 |
| 2 新型的猪瘟疫苗 |
| 2.1 活载体疫苗 |
| 2.2 核酸疫苗 |
| 2.3 标记疫苗 |
| 2.4 猪瘟病毒基因缺失型弱毒疫苗 |
| 3 猪瘟疫苗的使用误区 |
| 3.1 重复注射 |
| 3.2 过早注射 |
| 3.3 怀孕注射 |
| 3.4 注射失效疫苗 |
| 3.5 注射不换针头 |
| 4 猪瘟的接种方法 |
| 5 结语 |
（5）猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号及缩略语 |
| 第一章 BVDV研究进展 |
| 1 病毒概况 |
| 2 BVDV基因结构及功能 |
| 3 蛋白结构与功能 |
| 3.1 p20(Npro) |
| 3.2 BVDV结构蛋白 |
| 3.3 p7 |
| 3.4 p125(NS2-3)、NS2和NS3 |
| 3.5 p175 |
| 4 流行病学 |
| 5 急性感染 |
| 6 垂直传播 |
| 7 持续感染 |
| 8 猪感染BVDV |
| 9 诊断方法 |
| 10 防控 |
| 10.1 PI动物的鉴别与清除 |
| 10.2 人工免疫 |
| 10.3 生物安全 |
| 参考文献 |
| 第二章 猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立与临床应用 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 引物设计与合成 |
| 1.3 样品的处理 |
| 1.4 病毒的培养 |
| 1.5 病毒核酸的提取和cDNA的合成 |
| 1.6 PCR体系退火温度的优化 |
| 1.7 特异性 |
| 1.8 敏感性 |
| 1.9 重复性 |
| 1.10 不同样品的检测 |
| 1.11 PCR产物的序列分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 退火温度的优化 |
| 2.2 特异性 |
| 2.3 敏感性和重复性 |
| 2.4 不同样品检测结果 |
| 2.5 PCR产物的序列分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 第三章 表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的重组猪痘病的的研制 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 E2基因的扩增结果 |
| 2.2 载体的构建及鉴定 |
| 2.3 转化结果PCR鉴定 |
| 2.4 重组病毒的纯化与PCR鉴定结果 |
| 2.5 E2表达的鉴定 |
| 2.6 重组病毒的遗传稳定性实验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| Abstract |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（6）猪瘟细胞苗生产工艺的优化及ELISA法在抗原定量测定中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 猪瘟及病毒概述 |
| 1.2 CSFV 与宿主细胞的相互作用及其致病机制 |
| 1.3 猪瘟病毒、体外细胞的相互关系 |
| 1.3.1 猪瘟病毒在体外细胞培养物中的增殖方式 |
| 1.3.2 CSFV 弱毒株在犊牛睾丸细胞的增殖 |
| 1.4 猪瘟诊断方法的研究现状 |
| 1.4.1 病原学检测 |
| 1.4.2 抗体诊断方法 |
| 1.4.3 国内外抗原抗体兼用的检测方法 |
| 1.5 猪瘟疫苗的研究进展 |
| 1.5.1 传统疫苗 |
| 1.5.2 新型疫苗 |
| 1.6 我国传统疫苗以及现行工艺存在的问题 |
| 1.6.1 猪瘟兔化弱毒疫苗 |
| 1.6.2 我国的猪瘟免化弱毒疫苗的生产工艺在不断改进和提高 |
| 1.6.3 我现阶段猪瘟疫苗的质量及使免疫过程中存在的主要问题 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第2章 CSFV 在犊牛睾丸细胞中增殖规律的研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 细胞、血清 |
| 2.1.3 7.5 % NaHC0_3 溶液 |
| 2.1.4 0.01mol/LpH7.4 的PBS 缓冲液的配制 |
| 2.1.5 3%谷氨酰胺 |
| 2.1.6 1%酚红溶液 |
| 2.1.7 常用细胞营养液 |
| 2.1.8 猪瘟细胞苗生产中0.5%乳汉液的配制 |
| 2.1.9 仪器：磁力搅拌器：型号HS-2 富华仪器有限公司 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 特定环境下犊牛睾丸细胞的增殖培养 |
| 2.2.2 带毒的犊牛睾丸细胞的增殖培养 |
| 2.2.3 不同细胞密度下，最佳接毒量的筛选 |
| 2.2.4 最佳接毒方式的筛选 |
| 2.2.5 正常CSFV 病毒的增殖培养 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 犊牛睾丸细胞增殖曲线的建立 |
| 2.3.2 带毒睾丸细胞增殖曲线的建立 |
| 2.3.3 不同细胞密度下，最优化接毒量的筛选结果 |
| 2.3.4 最佳接毒方式的确定 |
| 2.3.5 正常病毒增殖曲线的建立 |
| 2.4 分析与讨论 |
| 第3章 猪瘟兔化弱毒细胞苗生产工艺的优化 |
| 3.1 材料(同第二章) |
| 3.1.1 菌种 |
| 3.1.2 细胞 |
| 3.1.3 试剂及仪器（同第二章） |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 种毒的繁殖 |
| 3.2.2 制苗用原代细胞的制备 |
| 3.2.3 次代细胞制备 |
| 3.2.4 犊牛睾丸细胞的CSFV 感染 |
| 3.2.5 病毒液的收获 |
| 3.2.6 调节病毒增殖的维持液 |
| 3.2.7 犊牛睾丸细胞的带毒传代 |
| 3.2.8 半成品检验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 种毒的繁殖及检验 |
| 3.3.1.1 生产种毒的繁殖 |
| 3.3.1.2 生产种毒热型判断记录 |
| 3.3.1.3 家兔的感染性、外源病毒检验、免疫原性、安全性、特异性检验、无菌 检验、支原体检验 |
| 3.3.2 原代细胞制备的计数 |
| 3.3.3 外源病毒检测 |
| 3.3.4 不同接毒方法对睾丸细胞及病毒的影响 |
| 3.3.5 改变细胞培养维持液液量和收获时间对病毒含量的影响 |
| 3.3.6 原代犊牛睾丸细胞带毒传代后的产毒结果 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 3.5 小结与展望 |
| 第4章 ELISA 法在 CSFV 抗原定量测定中的应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 抗原检测试剂盒 |
| 4.1.2 待检CSFV 抗原 |
| 4.1.3 特异性检验牛病毒性腹泻病毒(BVDV)标准种毒 |
| 4.1.4 主要试验仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 CSFV 抗原传统检验方法（兔体定型热反应检测） |
| 4.2.2 CSFV 抗原检测试剂盒方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 试剂盒应用于HCLV 半成品细胞苗的检测 |
| 4.3.2 试剂盒在成品 HCLV 疫苗的检测中的应用 |
| 4.3.3 CSFV 抗原检测试剂盒的特异性检验 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要科研成果 |
（7）河南猪群HCV感染及防疫的流行病学调查（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 实验及调查内容 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 猪瘟的研究现状及进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表论文 |
| 致谢 |
（9）猪瘟兔化弱毒（C株）和鸡马立克火鸡疱疹病毒（HVT）病毒保护剂的研究（论文提纲范文）
| 第一部分 猪瘟兔化弱毒(C株)病毒保护剂的研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 文献综述与研究背景 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 分析与讨论 |
| 5 小结与展望 |
| 6 主要参考文献 |
| 第二部分 鸡马立克氏病火鸡疱疹病毒(HVT)病毒保护剂的研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究背景与文献综述 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 分析与讨论 |
| 5 小结与展望 |
| 6 主要参考文献 |
| 附录一: 缩略语一览表 |
| 附录二: 硕士期间发表与拟发表的文章 |
| 致谢 |
四、低温保存犊牛睾丸组织生产猪瘟细胞苗效果观察（论文参考文献）
- [1]牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的原核表达及间接ELISA检测方法的建立[D]. 陈昕迪. 内蒙古农业大学, 2019(01)
- [2]CSFV/BVDV双重荧光RT-PCR检测方法的建立与山东地区CSFV的分子生物学研究[D]. 韦雪华. 山东农业大学, 2017(02)
- [3]不同冷冻保护剂对犊牛睾丸组织冷冻保存效果的研究[D]. 王春伟. 西北农林科技大学, 2014(02)
- [4]猪瘟疫苗的研究现状及正确使用方法[J]. 白成友,陈天泽,郑玉晏,谢晓燕,谢君庆. 吉林农业, 2012(07)
- [5]猪源牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及表达BVDV保护性抗原重组猪痘病毒的构建[D]. 蒙明璐. 南京农业大学, 2012(01)
- [6]猪瘟细胞苗生产工艺的优化及ELISA法在抗原定量测定中的应用[D]. 刘艳. 山东轻工业学院, 2011(10)
- [7]河南猪群HCV感染及防疫的流行病学调查[D]. 陶海静. 郑州大学, 2006(12)
- [8]低温保存犊牛睾丸组织生产猪瘟细胞苗效果观察[J]. 赵守友,孙洪丽,郑若龙. 现代畜牧兽医, 2004(12)
- [9]猪瘟兔化弱毒（C株）和鸡马立克火鸡疱疹病毒（HVT）病毒保护剂的研究[D]. 朱良全. 中国兽医药品监察所, 2004(06)