本文主要研究内容
作者杨文婷（2019）在《抗猪流行性腹泻病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备及功能验证》一文中研究指出：猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种以脱水、腹泻、肠绒毛严重萎缩为主要病变的传染病。2010年以来,PEDV变异株在世界多国猪场相继暴发流行,其对哺乳仔猪致病性强、死亡率高,一周龄以下的仔猪感染后其致死率可高达100%。该PEDV变异株的出现在我国及全球造成重大经济损失,严重威胁着养猪业的健康发展,开发用于检测PEDV感染的制剂和相应方法显得尤为重要且紧迫。核衣壳蛋白(N)在不同的PEDV毒株间高度保守、且在宿主感染早期合成,因此,PEDV N蛋白是作为感染早期检测的理想靶标。为有助于开发一系列检测PEDV感染的方法,本研究制备了抗PEDV N蛋白的单克隆抗体,并测试了其在不同检测方法中的应用前景。首先,本研究从PEDV LJX/2014毒株中采用RT-PCR方法扩增获得了N基因,随后将其因克隆至pET-30a(+)原核表达载体,获得了表达PEDV N蛋白的重组表达质粒,并将其命名为pET-N。将pET-N转化至BL-21(DE3)感受态细胞中表达N蛋白,结果表明,该目标蛋白以分泌型及包涵体形式同时表达。经优化表达条件,最终获得大量分泌型表达的N蛋白。采用镍柱亲和层析技术对所获得的重组N蛋白进行纯化,结果显示,本研究获得高纯度的PEDV N蛋白。将200μg纯化后的PEDV N蛋白与ISA15佐剂混合后于背部皮下多点免疫BALB/c小鼠,每两周以相同剂量及方式进行加强免疫。第三次免疫一周后,采用等量N蛋白于腹腔注射进行加强免疫,3 d后处死小鼠,取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选获得杂交瘤细胞。杂交瘤细胞经过三轮亚克隆筛选后,共获得6株稳定分泌抗PEDV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经单克隆抗体分型试剂盒鉴定,该6株单克隆抗体(mAbs)的重链均为IgG1亚类,轻链为?链。制备6株mAbs的腹水,其抗体滴度均在稀释度128000倍以上。除采用ELISA检测纯化后的PEDV N蛋白与mAbs的反应性外,我们还采用IFA和流式细胞术检测PEDV LJX/2014毒株接种的Vero-E6细胞与6株mAbs的反应性,同时用Western blotting检测其细胞裂解物与mAbs的反应性,上述结果均显示,本课题制备的mAbs均能用于间接免疫荧光(IFA)、Western blotting以及流式细胞术的检测分析。采用截短表达的策略,对mAb进行表位鉴定,采用间接ELISA方法分析这6株mAbs的表位所在区段。结果表明,3F12单抗株识别线性表位VAAKDALKSLGI,推测其余单抗株分别识别N181-379区段内的不同构象表位。综上所述,本研究成功制备了6株针对PEDV N蛋白的mAbs;测定了6株mAbs的亚型及其亲和性;分析了它们在ELISA、IFA、Western blotting和流式细胞术等方法中的应用;制备了6株mAbs的腹水,鉴定了mAbs的抗原表位。
Abstract
zhu liu hang xing fu xie shi you zhu liu hang xing fu xie bing du (PEDV)yin qi de yi chong yi tuo shui 、fu xie 、chang rong mao yan chong wei su wei zhu yao bing bian de chuan ran bing 。2010nian yi lai ,PEDVbian yi zhu zai shi jie duo guo zhu chang xiang ji bao fa liu hang ,ji dui bu ru zai zhu zhi bing xing jiang 、si wang lv gao ,yi zhou ling yi xia de zai zhu gan ran hou ji zhi si lv ke gao da 100%。gai PEDVbian yi zhu de chu xian zai wo guo ji quan qiu zao cheng chong da jing ji sun shi ,yan chong wei xie zhao yang zhu ye de jian kang fa zhan ,kai fa yong yu jian ce PEDVgan ran de zhi ji he xiang ying fang fa xian de you wei chong yao ju jin pai 。he yi ke dan bai (N)zai bu tong de PEDVdu zhu jian gao du bao shou 、ju zai su zhu gan ran zao ji ge cheng ,yin ci ,PEDV Ndan bai shi zuo wei gan ran zao ji jian ce de li xiang ba biao 。wei you zhu yu kai fa yi ji lie jian ce PEDVgan ran de fang fa ,ben yan jiu zhi bei le kang PEDV Ndan bai de chan ke long kang ti ,bing ce shi le ji zai bu tong jian ce fang fa zhong de ying yong qian jing 。shou xian ,ben yan jiu cong PEDV LJX/2014du zhu zhong cai yong RT-PCRfang fa kuo zeng huo de le Nji yin ,sui hou jiang ji yin ke long zhi pET-30a(+)yuan he biao da zai ti ,huo de le biao da PEDV Ndan bai de chong zu biao da zhi li ,bing jiang ji ming ming wei pET-N。jiang pET-Nzhuai hua zhi BL-21(DE3)gan shou tai xi bao zhong biao da Ndan bai ,jie guo biao ming ,gai mu biao dan bai yi fen bi xing ji bao han ti xing shi tong shi biao da 。jing you hua biao da tiao jian ,zui zhong huo de da liang fen bi xing biao da de Ndan bai 。cai yong nie zhu qin he ceng xi ji shu dui suo huo de de chong zu Ndan bai jin hang chun hua ,jie guo xian shi ,ben yan jiu huo de gao chun du de PEDV Ndan bai 。jiang 200μgchun hua hou de PEDV Ndan bai yu ISA15zuo ji hun ge hou yu bei bu pi xia duo dian mian yi BALB/cxiao shu ,mei liang zhou yi xiang tong ji liang ji fang shi jin hang jia jiang mian yi 。di san ci mian yi yi zhou hou ,cai yong deng liang Ndan bai yu fu qiang zhu she jin hang jia jiang mian yi ,3 dhou chu si xiao shu ,qu mian yi xiao shu de pi xi bao yu xiao shu gu sui liu xi bao (SP2/0)jin hang rong ge ,cai yong mei lian mian yi xi fu shi yan (ELISA)shai shua huo de za jiao liu xi bao 。za jiao liu xi bao jing guo san lun ya ke long shai shua hou ,gong huo de 6zhu wen ding fen bi kang PEDV Ndan bai chan ke long kang ti de za jiao liu xi bao zhu 。jing chan ke long kang ti fen xing shi ji he jian ding ,gai 6zhu chan ke long kang ti (mAbs)de chong lian jun wei IgG1ya lei ,qing lian wei ?lian 。zhi bei 6zhu mAbsde fu shui ,ji kang ti di du jun zai xi shi du 128000bei yi shang 。chu cai yong ELISAjian ce chun hua hou de PEDV Ndan bai yu mAbsde fan ying xing wai ,wo men hai cai yong IFAhe liu shi xi bao shu jian ce PEDV LJX/2014du zhu jie chong de Vero-E6xi bao yu 6zhu mAbsde fan ying xing ,tong shi yong Western blottingjian ce ji xi bao lie jie wu yu mAbsde fan ying xing ,shang shu jie guo jun xian shi ,ben ke ti zhi bei de mAbsjun neng yong yu jian jie mian yi ying guang (IFA)、Western blottingyi ji liu shi xi bao shu de jian ce fen xi 。cai yong jie duan biao da de ce lve ,dui mAbjin hang biao wei jian ding ,cai yong jian jie ELISAfang fa fen xi zhe 6zhu mAbsde biao wei suo zai ou duan 。jie guo biao ming ,3F12chan kang zhu shi bie xian xing biao wei VAAKDALKSLGI,tui ce ji yu chan kang zhu fen bie shi bie N181-379ou duan nei de bu tong gou xiang biao wei 。zeng shang suo shu ,ben yan jiu cheng gong zhi bei le 6zhu zhen dui PEDV Ndan bai de mAbs;ce ding le 6zhu mAbsde ya xing ji ji qin he xing ;fen xi le ta men zai ELISA、IFA、Western blottinghe liu shi xi bao shu deng fang fa zhong de ying yong ;zhi bei le 6zhu mAbsde fu shui ,jian ding le mAbsde kang yuan biao wei 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自中国农业科学院的杨文婷，发表于刊物中国农业科学院2019-07-05论文，是一篇关于猪流行性腹泻病毒论文,核衣壳蛋白论文,单克隆抗体论文,中国农业科学院2019-07-05论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自中国农业科学院2019-07-05论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。