导读:本文包含了类去整合素结构域论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:绵羊受精素β,去整合素结构域,原核表达,抗体
类去整合素结构域论文文献综述
丽娜[1]（2009）在《绵羊受精素β去整合素结构域的表达及其特异性抗体的制备》一文中研究指出精卵结合机制的研究,一方面是动物受精生理的一个重要理论问题,另一方面在免疫避孕及免疫不孕等实际应用中也具有重要意义。受精素β作为少数几种在精卵质膜结合与融合中发挥重要作用的精子膜表面蛋白之一,是多种哺乳动物精子膜均具有的重要蛋白。它属于ADAMs家族,具有ADAMs家族的完整结构域。在受精素β的多个保守性结构域中,去整合素区域作为卵细胞上整合素的配体是其发挥重要生理功能的最主要的功能区。本研究将绵羊受精素β作为外源性抗原,通过基因重组技术将编码受精素β去整合素结构域的cDNA序列插入表达载体高拷贝质粒PGEX-4T-1中,构建重组质粒PGEX-4T-sf279并转化大肠杆菌BL21(DH3)中,成功地构建了能够稳定表达绵羊受精素β去整合素结构域蛋白的重组大肠杆菌疫苗株。本研究的主要结果和结论如下:1、根据绵羊受精素βcDNA全序列设计其去整合素结构域上下游引物,利用PCR方法扩增编码该区域的cDNA片段,将其插入原核表达载体PGEX-4T-1中,构建重组质粒PGEX-4T-sf279;2、将含绵羊受精素β去整合素结构域cDNA序列的重组质粒PGEX-4T-sf279转化入大肠杆菌BL21(DH3)中,用IPTG诱导成功表达了大量融合蛋白,然后利用GST亲和树脂层析纯化,制备了纯度很高的蛋白抗原。3、免疫6-8周龄昆明小鼠,制备了小鼠抗羊多克隆抗血清。经Western Blot分析显示,多克隆抗血清可与纯化的绵羊重组蛋白发生特异性反应,说明重组蛋白具有抗原活性。.4、本研究为进一步进行绵羊受精素β蛋白在精卵结合和融合过程中的功能研究奠定了基础。(本文来源于《内蒙古农业大学》期刊2009-05-01）
吴静[2]（2008）在《重组人ADAM15去整合素结构域蛋白的制备及其作用机理》一文中研究指出ADAM (A Disintegrin And Metalloproteinase)是一类含有七个功能结构域并在细胞间相互识别和相互作用中发挥重要作用的跨膜糖蛋白家族。ADAM15作为该家族唯一在去整合素结构域(disintegrin)含有RGD(Arg-Gly-Asp)基序的成员,在细胞外基质降解、细胞粘附、细胞内信号转导和肿瘤的病理变化等过程中发挥重要作用,但是其抗肿瘤机理需进一步阐释。本文在成功获取高表达水平的重组人ADAM15去整合素结构域蛋白片段(rhddADAM15)的基础上,以小鼠黑色素瘤细胞(B16)为研究模型,研究rhddADAM15对B16细胞体外增殖、粘附和迁移等细胞行为的影响,通过筛选rhddADAM15特异结合的12肽以及rhddADAM15在B16细胞上相互作用的靶点蛋白,探讨rhddADAM15干预肿瘤细胞行为的生理机制。主要研究结果如下:1)为获得大量具有生物活性的rhddADAM15蛋白,在详尽分析目标蛋白的cDNA序列的基础上,(1)选择能为大肠杆菌稀有密码子提供额外tRNA的大肠杆菌Escherichia coli Rosetta(DE3)作为宿主菌,将目标蛋白以GST(Glutathione-S-transferase)融合蛋白形式表达,在最佳诱导表达条件下融合蛋白GST-ADAM15浓度为298 mg/L,最佳凝血酶酶切条件下,rhddADAM15浓度为42 mg/L; (2)采用PCR体外定点突变技术将凝血酶识别序列附近稀有密码子GGA(Gly)替换为GGC,同时消除Pro-Glu-Phe残基,构建突变表达质粒,提高凝血酶酶切效率。在相同的表达和酶切条件下获得GST-△-ADAM15和rhddADAM15蛋白浓度分别为326 mg/L和68mg/L,比野生型分别提高9.4%和61.9%。这一结果表明,在充分认识目标蛋白特性的基础上定向选择表达宿主并改造表达质粒能实现外源蛋白高水平表达;2)采用MTT法测定rhddADAM15对B16、MCF-7/W以及HMEC-1细胞体外增殖的作用,采用创伤愈合实验、Matrigel基质胶以及Transwell侵袭小室法观察rhddADAM15对B16细胞体外迁移、粘附和侵袭的影响;采用台盼蓝染色法分析细胞活力、流式细胞仪检测rhddADAM15对B16细胞周期的影响。结果表明rhddADAM15对肿瘤细胞和正常内皮细胞生长均有一定的抑制作用(其IC50分别为9.5、11.8和14.9μg/mL),且明显抑制B16细胞的体外增殖、迁移、粘附和侵袭。台盼蓝染色法表明低剂量的rhddADAM15并不能导致B16细胞出现坏死,且rhddADAM15并不导致B16细胞出现典型的凋亡峰,而是将细胞阻滞于G2/ M期,并且这种作用呈剂量依赖关系;3)采用亲和甄别磁珠技术筛选rhddADAM15在B16细胞上的结合蛋白。将rhddADAM15采用蛋白生物素化方法标记生物素,借助生物素-亲和素系统,将生物素化的rhddADAM15固定于亲和素标记的免疫磁珠。从B16细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白,经浓缩富集后,采用双向电泳分离技术分离获得主要的结合蛋白点,然后对这些蛋白点进行电喷雾串联质谱技术(ESI-MS)分析,在蛋白数据库中检索,共鉴定了8个蛋白质,按功能可分为如下叁类:(1)临床应用的肿瘤标志物(苹果酸脱氢酶、磷酸甘油醛脱氢酶和谷氨酸脱氢酶);(2)能量代谢相关蛋白(烯醇酶、磷酸丙糖异构酶、原肌球蛋白和血红蛋白);(3)信号转导通路成员(p38MAPK激酶)等。在此基础上通过分子对接软件molsoft ICM模拟计算获得rhddADAM15与p38激酶相互作用的最佳模式和重要的结合位点;4)采用噬菌体展示技术筛选与rhddADAM15特异性相互作用的多肽序列。采用噬菌体随机十二肽库对固定有rhddADAM15的亲和磁珠系统进行生物淘洗,获得4条与rhddADAM15特异结合的12肽。将获得的12肽与蛋白质库进行序列比对,发现细胞周期相关蛋白如Cdc25和p53,信号通路相关蛋白/受体,如整合素αvβ3的胞外区,丝裂原活化蛋白激酶p38α等与所获得的4条12肽具有高度同源性;5)基于上述研究所获得的rhddADAM15在B16细胞上潜在的靶点蛋白,进一步研究rhddADAM15与p38MAPK激酶的体外相互作用,结合rhddADAM15对B16细胞行为的抑制作用,采用蛋白点杂交和激酶活性测定方法分析rhddADAM15在体外与重组p38激酶蛋白的结合情况,同时研究不同剂量rhddADAM15对B16细胞中p38MAPK激酶磷酸化水平的影响,并观察rhddADAM15对p38激酶活性受到部分抑制的B16细胞的增殖和细胞周期抑制作用的变化。发现:(1)rhddADAM15在离体低温条件下能够和重组p38激酶蛋白结合,但rhddADAM15(0-10μg/mL)在体外对p38MAPK激酶活性没有影响;(2)同样剂量的rhddADAM15作用于B16细胞24 h后,细胞中p38MAPK激酶的磷酸化水平提高(被激活);(3)p38激酶的特异性抑制剂SB203580(0.5 mmol/L)预处理B16细胞30 min后,rhddADAM15对细胞增殖的抑制作用减弱(IC50由未经处理的9.5μg/mL增加到11.4μg/mL),对细胞周期的阻滞作用也减弱(G2/M期细胞比率从未经处理的的28.77%降到16.59%)。上述结果表明,p38MAPK信号转导通路参与了rhddADAM15对B16细胞增殖和细胞周期的抑制作用,同时也表明生理条件下rhddADAM15与p38MAPK激酶相互作用的复杂性。(本文来源于《江南大学》期刊2008-09-01）
吴静,雷楗勇,张莲芬,花慧,金坚[3]（2008）在《改善稀有密码子和氨基酸残基限制提高重组人ADAM15去整合素结构域蛋白表达水平》一文中研究指出【目的】为提高重组人ADAM(A Disintegrin And Metalloproteinase)15去整合素结构域蛋白(rhADAM15)的表达水平。【方法】在详尽分析rhADAM15的cDNA和GST(谷胱甘肽-S-转移酶)-ADAM15结构的基础上,选择表达宿主菌并对表达质粒进行改造。【结果】(1)选择能为大肠杆菌稀有密码子提供额外tRNA的Escherichia coli.Rosetta(DE3)作为宿主菌,将质粒pGEX-ADAM15转化于其中在最佳诱导表达条件下获得298mg/L融合蛋白GST-ADAM15;(2)采用PCR体外定点突变技术将目标蛋白编码区稀有密码子GGA(Gly425)替换为GGC,使融合蛋白表达水平提高9.4%;(3)通过消除凝血酶识别序列附近的Pro-Glu-Phe残基,提高凝血酶酶切效率,使rhADAM15产量提高了35.7%;(4)在GGA替换为GGC基础上切除"Pro-Glu-Phe"残基,使rhADAM15产量提高到68mg/L,比分别切除"Pro-Glu-Phe"残基、GGA替换为GGC和野生型提高了19.2%、51.1%和61.9%。【结论】这一结果表明,在充分认识目标蛋白特性的基础上定向选择表达宿主并改造表达质粒能实现外源蛋白高水平表达。(本文来源于《微生物学报》期刊2008年08期）
张军,靳风烁,江军,李彦锋[4]（2004）在《表达人受精素β去整合素结构域的重组沙门菌疫苗株的构建》一文中研究指出目的 构建表达人受精素 β去整合素结构域的重组沙门菌疫苗株。 方法 应用PCR方法获得人受精素 β去整合素结构域的cDNA片断 ,将其插入高拷贝表达载体pYA3 3 3 9中 ,构建重组质粒pYA3 3 3 9 hf2 79,将该重组质粒转入鼠沙门菌疫苗株X45 5 0 ,获得重组菌株X45 5 0 (pYA3 3 3 9 hf2 79)。结果 该重组疫苗株可稳定表达能被抗人受精素 β多克隆抗体识别的重组蛋白HF93 ,其分子量约为 16× 10 3。结论 该疫苗株的构建为进一步研究以人受精素 β为靶抗原的免疫避孕疫苗打下了基础(本文来源于《第叁军医大学学报》期刊2004年06期）
张军[5]（2003）在《表达人受精素β去整合素结构域的重组沙门菌疫苗株的构建》一文中研究指出理想的避孕措施应该具有高效、廉价、安全且可逆的特点，基于精子抗原的避孕疫苗就是符合这一要求的极具潜力的免疫避孕方法。事实上，随着人们在这一领域内认识的不断深入，开发这样的疫苗已经逐渐成为可能，并且天然存在的人类免疫不育的模型也为此项研究提供了研究对象和理论依据。免疫避孕将成为二十一世纪最有应用潜力的避孕途径。精子与卵透明带和卵细胞膜的相互作用是受精过程的两个重要环节，能够阻断这两个过程的精子抗原可能成为用于免疫避孕研究的候选抗原。目前已经筛选出了许多具有较强免疫原性的精子特异性抗原，受精素β作为其中最早定性的ADAM蛋白家族成员得到深入研究。人精子膜蛋白受精素β在精子发生顶体反应后定位于精子头后部区域，即精-卵融合的特定区域，它主要作为一种粘附分子介导了精子与卵透明带的结合以及与精-卵膜的结合和融合。该蛋白由多个保守性结构域构成。IVF试验发现含有去整合素结构域的重组受精素β(βDCE)能够抑制精-卵结合，而去除了去整合素结构域的受精素β(βCE)则不能够抑制精-卵结合。缺乏去整合素结构域的受精素β也丧失了在精-卵相互作用中的生理功能，所以去整合素结构域是其最重要的功能区。目前国内外对于受精素β的研究主要集中于基因-功能关系上，尚无应用减毒沙门菌构建重组疫苗株表达人受精素β去整合素结构域蛋白的报道。传统的免疫方法是将完整抗原直接注射免疫人体，此种免疫方法用于免疫避孕的主要缺陷为难以诱导生殖道内的特异性分泌型抗体产生，且应用不便。为此，近年来有部分学者正致力于开发可口服的免疫避孕疫苗。已有研究发现，沙门菌疫苗株可诱导机体产生高水平的粘膜免疫、细胞免疫和体液免疫应答，是疫苗开发中具有突出应用前景的载运系统。在该疫苗株中，利用沙门菌的平衡致死系统进行营养选择，既保证了外源抗原的稳定表达，又可避免应用在活疫苗中有潜在危险的常用抗生素抗性基因，这对人用疫苗研究非常重要。本研究将人受精素β作为外源性抗原，通过基因重组技术将编码受精素β去整合素结构域的cDNA序列插入表达载体高拷贝质粒pYA3339中，构建重组质粒pYA3339/hf279，并利用沙门氏菌asd＋/asd－平衡致死系统，成功地构建了能稳定表达<WP=8>受精素β去整合素结构域蛋白的重组沙门菌减毒疫苗株X4550(pYA3339/hf279)。本研究的主要结果和结论如下：一、以含人精子膜蛋白受精素β cDNA序列的质粒pT7-7/hf为模板，通过PCR扩增编码其去整合素结构域的cDNA序列，将该段基因插入表达载体pYA3339，成功构建了重组质粒pYA3339/hf279；二、将含人受精素β去整合素结构域cDNA序列的重组质粒pYA3339/hf279最终转化入减毒沙门氏鼠伤寒菌X4550中，成功构建了重组减毒沙门菌疫苗株X4550(pYA3339/hf279)；叁、免疫印迹分析显示重组疫苗株X4550(pYA3339/hf279)可成功表达能被抗人受精素β多克隆抗体识别的重组蛋白HF93。重组蛋白分子量约为16KDa，薄层扫描分析该蛋白约占菌体总蛋白的6％；四、本研究为开发可能应用于人类的口服免疫性避孕疫苗提供重要的靶抗原和载运系统选择依据，并为进一步进行蛋白质功能鉴定和动物试验研究奠定了基础。(本文来源于《第叁军医大学》期刊2003-05-01）
类去整合素结构域论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
ADAM (A Disintegrin And Metalloproteinase)是一类含有七个功能结构域并在细胞间相互识别和相互作用中发挥重要作用的跨膜糖蛋白家族。ADAM15作为该家族唯一在去整合素结构域(disintegrin)含有RGD(Arg-Gly-Asp)基序的成员,在细胞外基质降解、细胞粘附、细胞内信号转导和肿瘤的病理变化等过程中发挥重要作用,但是其抗肿瘤机理需进一步阐释。本文在成功获取高表达水平的重组人ADAM15去整合素结构域蛋白片段(rhddADAM15)的基础上,以小鼠黑色素瘤细胞(B16)为研究模型,研究rhddADAM15对B16细胞体外增殖、粘附和迁移等细胞行为的影响,通过筛选rhddADAM15特异结合的12肽以及rhddADAM15在B16细胞上相互作用的靶点蛋白,探讨rhddADAM15干预肿瘤细胞行为的生理机制。主要研究结果如下:1)为获得大量具有生物活性的rhddADAM15蛋白,在详尽分析目标蛋白的cDNA序列的基础上,(1)选择能为大肠杆菌稀有密码子提供额外tRNA的大肠杆菌Escherichia coli Rosetta(DE3)作为宿主菌,将目标蛋白以GST(Glutathione-S-transferase)融合蛋白形式表达,在最佳诱导表达条件下融合蛋白GST-ADAM15浓度为298 mg/L,最佳凝血酶酶切条件下,rhddADAM15浓度为42 mg/L; (2)采用PCR体外定点突变技术将凝血酶识别序列附近稀有密码子GGA(Gly)替换为GGC,同时消除Pro-Glu-Phe残基,构建突变表达质粒,提高凝血酶酶切效率。在相同的表达和酶切条件下获得GST-△-ADAM15和rhddADAM15蛋白浓度分别为326 mg/L和68mg/L,比野生型分别提高9.4%和61.9%。这一结果表明,在充分认识目标蛋白特性的基础上定向选择表达宿主并改造表达质粒能实现外源蛋白高水平表达;2)采用MTT法测定rhddADAM15对B16、MCF-7/W以及HMEC-1细胞体外增殖的作用,采用创伤愈合实验、Matrigel基质胶以及Transwell侵袭小室法观察rhddADAM15对B16细胞体外迁移、粘附和侵袭的影响;采用台盼蓝染色法分析细胞活力、流式细胞仪检测rhddADAM15对B16细胞周期的影响。结果表明rhddADAM15对肿瘤细胞和正常内皮细胞生长均有一定的抑制作用(其IC50分别为9.5、11.8和14.9μg/mL),且明显抑制B16细胞的体外增殖、迁移、粘附和侵袭。台盼蓝染色法表明低剂量的rhddADAM15并不能导致B16细胞出现坏死,且rhddADAM15并不导致B16细胞出现典型的凋亡峰,而是将细胞阻滞于G2/ M期,并且这种作用呈剂量依赖关系;3)采用亲和甄别磁珠技术筛选rhddADAM15在B16细胞上的结合蛋白。将rhddADAM15采用蛋白生物素化方法标记生物素,借助生物素-亲和素系统,将生物素化的rhddADAM15固定于亲和素标记的免疫磁珠。从B16细胞裂解液中钓出与之相互作用的蛋白,经浓缩富集后,采用双向电泳分离技术分离获得主要的结合蛋白点,然后对这些蛋白点进行电喷雾串联质谱技术(ESI-MS)分析,在蛋白数据库中检索,共鉴定了8个蛋白质,按功能可分为如下叁类:(1)临床应用的肿瘤标志物(苹果酸脱氢酶、磷酸甘油醛脱氢酶和谷氨酸脱氢酶);(2)能量代谢相关蛋白(烯醇酶、磷酸丙糖异构酶、原肌球蛋白和血红蛋白);(3)信号转导通路成员(p38MAPK激酶)等。在此基础上通过分子对接软件molsoft ICM模拟计算获得rhddADAM15与p38激酶相互作用的最佳模式和重要的结合位点;4)采用噬菌体展示技术筛选与rhddADAM15特异性相互作用的多肽序列。采用噬菌体随机十二肽库对固定有rhddADAM15的亲和磁珠系统进行生物淘洗,获得4条与rhddADAM15特异结合的12肽。将获得的12肽与蛋白质库进行序列比对,发现细胞周期相关蛋白如Cdc25和p53,信号通路相关蛋白/受体,如整合素αvβ3的胞外区,丝裂原活化蛋白激酶p38α等与所获得的4条12肽具有高度同源性;5)基于上述研究所获得的rhddADAM15在B16细胞上潜在的靶点蛋白,进一步研究rhddADAM15与p38MAPK激酶的体外相互作用,结合rhddADAM15对B16细胞行为的抑制作用,采用蛋白点杂交和激酶活性测定方法分析rhddADAM15在体外与重组p38激酶蛋白的结合情况,同时研究不同剂量rhddADAM15对B16细胞中p38MAPK激酶磷酸化水平的影响,并观察rhddADAM15对p38激酶活性受到部分抑制的B16细胞的增殖和细胞周期抑制作用的变化。发现:(1)rhddADAM15在离体低温条件下能够和重组p38激酶蛋白结合,但rhddADAM15(0-10μg/mL)在体外对p38MAPK激酶活性没有影响;(2)同样剂量的rhddADAM15作用于B16细胞24 h后,细胞中p38MAPK激酶的磷酸化水平提高(被激活);(3)p38激酶的特异性抑制剂SB203580(0.5 mmol/L)预处理B16细胞30 min后,rhddADAM15对细胞增殖的抑制作用减弱(IC50由未经处理的9.5μg/mL增加到11.4μg/mL),对细胞周期的阻滞作用也减弱(G2/M期细胞比率从未经处理的的28.77%降到16.59%)。上述结果表明,p38MAPK信号转导通路参与了rhddADAM15对B16细胞增殖和细胞周期的抑制作用,同时也表明生理条件下rhddADAM15与p38MAPK激酶相互作用的复杂性。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
类去整合素结构域论文参考文献
[1].丽娜.绵羊受精素β去整合素结构域的表达及其特异性抗体的制备[D].内蒙古农业大学.2009
[2].吴静.重组人ADAM15去整合素结构域蛋白的制备及其作用机理[D].江南大学.2008
[3].吴静,雷楗勇,张莲芬,花慧,金坚.改善稀有密码子和氨基酸残基限制提高重组人ADAM15去整合素结构域蛋白表达水平[J].微生物学报.2008
[4].张军,靳风烁,江军,李彦锋.表达人受精素β去整合素结构域的重组沙门菌疫苗株的构建[J].第叁军医大学学报.2004
[5].张军.表达人受精素β去整合素结构域的重组沙门菌疫苗株的构建[D].第叁军医大学.2003