长沙生殖医学医院（检验科）湖南长沙410205
【摘要】目的：分析男性不育患者精子线粒体膜电位及顶体酶活性检测结果。方法：研究时间：2015年5月-2018年1月；正常生育组选取50例，男性不育组选取150例，弱精子症65例，畸精子症55例，弱畸精子症30例，进行精子线粒体膜电位、顶体酶活性检测，比较两组精子PFM、PNM、MMP、顶体酶活性的检测结果。结果：和正常精子组对比，男性不育组、弱精子症组、畸精子症组、弱畸精子症组PFM、PNM、MMP、顶体酶活性明显更低，P<0.05。和弱精子症组对比，畸精子症组、弱畸精子症组PNM、MMP、顶体酶活性明显更低，P<0.05；但PFM无差异，P>0.05。和畸精子症组对比，弱畸精子症组PNM、MMP、顶体酶活性明显更低，P<0.05；但PFM无差异，P>0.05。结论：精子线粒体膜电位、顶体酶活性检测在男性生育力的诊断中意义重大，能够客观评估男性不育患者的精子质量。
【关键词】男性不育；精子线粒体膜电位；顶体酶活性
男性不育是一种发病率高的综合病症，其致病因素来自于多方面，在育龄夫妻中，占比高达10%。一直以来，常规精液分析在男性生育能力的评估中发挥着重要的作用。但是，仅仅通过常规指标难以对精子的受精能力进行全面的评估。常规检查与实际生育能力存在比较大的差距。所以，需要对男性不育患者进行精子功能试验，从而提高男性生育能力检测的全面程度和科学程度。通常而言，精子凋亡预示着精子运动能力降低和失去，因此精子运动能力和精子凋亡密切相关。精子顶体酶活性检测可更加科学、可靠评估精子受精能力，在精子生育力的评估中意义重大。本研究对我院男性不育患者进行精子线粒体膜电位及顶体酶活性检测，探讨精子线粒体膜电位及顶体酶活性检测在男性不育的诊断评估中的价值与意义。现报告如下。
1.资料与方法
1.1基本资料
研究时间：2015年5月-2018年1月；正常生育组选取50例，年龄最小20岁，最大40岁，平均28.0±3.6岁，根据WHO精液常规标准，所有纳入对象均符合标准。男性不育组选取150例，年龄最小20岁，最大42岁，平均29.0±3.5岁，排除器质性疾病、配偶不育患者。弱精子症65例，年龄最小20岁，最大40岁，平均28.8±2.6岁，畸精子症55例，年龄最小20岁，最大40岁，平均28.5±3.2岁，弱畸精子症30例，年龄最小20岁，最大40岁，平均28.5±3.0岁。
1.2方法
1.2.1采集精液
要求两组研究对象禁欲3天，使用手淫法收集精液，放在无菌杯，然后放在水浴箱中30分钟，进行液化。
1.2.2常规精液检测
使用精子分析仪（美国BDFACSCalibur），按照实验室检验手册操作规则进行改良巴氏染色和K严格精子形态分析。试剂来自于浙江星博生物科技股份有限公司。
1.2.3精子线粒体膜电位检测
对精液标本进行洗涤，离心处理，用PBS悬浮沉淀，获取精子标本，密度控制为300g*5min。加入JC-1（5ug/ml），恒温避光，10分钟后进行洗涤。再用PBS重悬沉淀。进行流式细胞仪检测。波长488mm，使用FSC和SSC，通过FL1和FL2检测光强度。MMP正常精子比例=橙红色精子百分比。
1.2.4精子顶体酶检测
用Kennedy方式检测标本，将标本分为两种管，分别为测定管、空白管。各自精子数7.5*106个，离心处理20分钟以后，祛除精浆，加入100ul抑制剂，然后祛除精浆蛋白酶抑制剂，加入1000ul反应液，在对照管中加入1000ul终止液。反应停止后，离心两管，取上清液200ul，放入空白酶标板，检测（波长405mm）。根据公式计算总顶体酶活性。
1.3观察指标
比较两组精子PFM、PNM、MMP、顶体酶活性的检测结果。
1.4统计学方法
采用SPSS20.0统计学软件进行统计分析，对正态分布的数据进行t检验，对非正态分布的数据进行卡方检验，采用平均数±标准差的形式表示数据的分布趋势，P<0.05表示数据的比较差异具有统计学意义。
2.结果
表1：比较两组精子PFM、PNM、MMP、顶体酶活性的检测结果
和正常精子组对比，男性不育组、弱精子症组、畸精子症组、弱畸精子症组PFM、PNM、MMP、顶体酶活性明显更低，P<0.05。和弱精子症组对比，畸精子症组、弱畸精子症组PNM、MMP、顶体酶活性明显更低，P<0.05；但PFM无差异，P>0.05。和畸精子症组对比，弱畸精子症组PNM、MMP、顶体酶活性明显更低，P<0.05；但PFM无差异，P>0.05。
3.讨论与结论
精子线粒体在精子获能和供能中发挥着不可替代的作用，是提供精子运动动力的重要细胞器。通常而言，在细胞无异常的代谢中，线粒体能量传递至电子，通过呼吸链传递，并且将质子送到内膜之外，电位差距由此形成。也就是形成线粒体膜电位。该电位可反映线粒体产能的状况。当MMP正常时，跨膜负电压比较高，如果降低则预示着供能受到阻滞。本研究显示男性不育患者MMP降低明显，证明MMP在一定程度可解释不育的病因。顶体酶位于精子头部的基质、内膜，属于一种丝氨酸蛋白溶解酶。随着顶体合成，该溶解酶也随之形成，并且无活性。当精子获能、与透明带结合时，顶体PH升高，顶体酶活化，为精子和卵子结合提供能量。本研究显示，男性不育患者顶体酶活性明显低于正常男性，预示着顶体酶活性异常可能是导致男性不育的重要原因，也是导致弱精子症、畸精子症、弱畸精子症的重要原因。
综上所述，精子线粒体膜电位、顶体酶活性检测在男性生育力的诊断中意义重大，能够客观评估男性不育患者的精子质量。
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