1.武警总医院药剂科北京100039；
2.北京中医药大学北京100102；
3.江西省药品检验检测研究院(江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心)江西南昌330029
【摘要】目的：优选出脑血康丸中总氨基酸的最佳测定工艺。方法：采用L9(34)正交试验设计，以水解温度、水解时间和盐酸浓度为考察因素，脑血康丸中总氨基酸的含量和得率为考察指标，确定脑血康丸中总氨基酸的最佳提取条件。结果：最佳测定工艺为水解温度100℃，水解时间为22h，盐酸浓度为6mol?L-1。结论：该优化测定工艺可用于脑血康丸中总氨基酸的测定，为脑血康丸的进一步研究提供了参考。
【关键词】正交设计；脑血康丸；总氨基酸；含量测定
【中图分类号】R927.2【文献标识码】B【文章编号】1674-8999（2015）6-0142-02
脑血康丸水蛭经加工制成的丸，能活血化瘀，破血散结。本品收载于《国家食品药品监督管理局国家药品标准》YBZ11972005-2009Z，只有一个薄层鉴别，难以控制质量。本文建立了脑血康丸的含量测定方法，采用正交设计法对脑血康丸中总氨基酸的测定方法[1～4]进行改进，提高有效成分的提出率，可用于质量控制。
1仪器与试药
德国syknm公司S7130Aminoacidreagentorganizer全自动氨基酸分析仪。SartoriusBT25S型十万分之一电子天平，混合氨基酸对照品(sigma公司，H型，批号:02090110)，脑血康丸(四川康特能药业有限公司，批号为:20130509、20130510、20130511)。水为超纯水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱:磺基强酸性阳离子交换树脂LCAK06/Na,(150mm×4.6mm,5μm)，缓冲液A（称取柠檬酸三钠11.8g、柠檬酸6.0g和苯酚0.5g，加适量水溶解，再加甲醇65ml、37%盐酸5.6ml和辛酸0.1ml用水稀释至1L，加氢氧化钠调节pH至3.45并通过0.45?m滤膜过滤）、缓冲液B（取二水柠檬酸三钠19.6g、氢氧化钠3.1g、硼酸5.0g加适量水溶解，再加辛酸0.1ml用水稀释至1L，加37%盐酸调节pH至10.85并通过0.45?m滤膜过滤）、再生液（称取氢氧化钠20.0g、EDTA0.2g，用水稀释至1L并通过0.45?m滤膜过滤）、样品稀释液（称取柠檬酸三钠11.8g、柠檬酸6.0g和苯酚2.0g，加适量水溶解，再加37%盐酸10.4ml和辛酸0.1ml用水稀释至1L，加氢氧化钠调节pH至2.20并通过0.45?m滤膜过滤）、茚三酮试剂（称取茚三酮20g和苯酚2.0g，用400ml钠钾缓冲液和600ml甲醇溶解）。检测波长为440nm（脯氨酸）和570nm（其他氨基酸）；进样量：50?l。流速：A泵（缓冲液）0.45ml/nim，M泵（茚三酮试剂泵）0.25ml/nim，梯度洗脱结果见表1，程序升温见表2。在上述色谱条件下，分别取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液依法测定，结果见图1～图6。
2.2对照品及供试品溶液的制备
2.2.1对照品溶液
精密量取混合氨基酸对照品1ml，置25ml量瓶中，加样品稀释液至刻度，摇匀，即得。
2.2.2供试品溶液
取装量差异项下的本品，研细，取约0.25g，精密称定，置厌氧水解管中，加入6mol?L-1盐酸溶液(含0.1%苯酚)10ml，将样品全部浸没，置冰块(冰水)中冷冻10min。充高纯氮气1～2min，注意保持水解管竖直，不要将液面溅起，移开氮气后立即盖好软塞，旋紧密封盖。将水解管置于(100±1)℃恒温烘箱中水解22h。水解完成后，冷却，混匀，精密吸取水解液0.2ml，于60℃以下浓缩至干。加入3ml样品稀释液，震荡混匀，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.3脑血康丸中总氨基酸含量测定方法的建立
2.3.1标准曲线的制备
精密吸取混合氨基酸对照品溶液80，125，125，60，80μl分别置10，10，5，1，1ml量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。分别精密吸取上述对照品溶液50μl，注入氨基酸测定仪进行测定。以峰面积为纵坐标，以进样浓度为横坐标，绘制标准曲线。
2.3.2精密度试验
精密吸取混合对照品溶液50μl注入氨基酸分析仪中进行测定重复测定6次，测得天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸和脯氨酸峰面积的RSD分别为1.5%，2.0%，1.7%，1.6%，1.1%，1.4%，1.5%，0.8%，1.3%，1.2%，1.0%，1.1%，1.5%，1.7%，1.4%和1.2%，说明仪器精密度良好。
2.3.3稳定性试验
精密吸取供试品溶液(批号20130510)，按“2.1”项下色谱条件，分别在0，2，4，8，12，24h进样一次，测得天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸和脯氨酸峰面积的ＲSD分别为2.1%，1.6%，2.4%，1.6%，1.5%，2.3%，3.5%，2.1%，1.8%，1.6%，3.5%，2.4%，3.8%，1.6%，1.8%和2.4%，说明供试品溶液中总氨基酸在24h内峰面积无明显变化。
2.3.4重复性试验
取脑血康丸样品6份(批号:20130510)，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测得总氨基酸的平均含量为84.1864g?g-1(n=6)，RSD=1.2%，表明该方法的重复性良好。
2.3.5回收率试验
精密称取已知含量的本品(批号:20130510)0.05g共9份，精密称取总氨基酸含量为16.23mg?ml-1的混合氨基酸对照品溶液，分别加入150，300，500μl各3份，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定含量，计算回收率。结果显示总氨基酸的平均回收率为101.3%，RSD为2.9%。
2.4正交试验设计
以脑血康丸中总氨基酸的含量为考察指标，取同一批号的脑血康丸样品进行正交试验，主要因素为水解温度、水解时间和盐酸浓度。根据氨基酸类成分的提取有关文献和正交设计有关文献，选择L9(34)正交表进行试验，因素水平见表3。
由方差分析结果可知:在脑血康丸总氨基酸的水解过程中，上述三种因素表现的差异均无统计学意义。由正交试验结果表的直观分析可知，其影响因素大小为B(水解时间)＞C(盐酸浓度)＞A(水解温度)。为保证提取完全，并参考氨基酸分析仪的其他样品的水解条件，确定本品提取方法为A2B2C2:水解温度100℃，水解时间为22h，盐酸浓度为6mol?L-1。
2.5最佳方案的验证试验
取脑血康丸，经重现性试验，采用优化后工艺进行脑血康丸中总氨基酸的含量测定，其测定结果准确，重复性好,可用于脑血康丸质量标准控制。
3讨论
水蛭的化学成分以大分子蛋白质、多肽等物质为主。也是现在研究的主流范围，而微量元素等小分子物质则研究较少.目前文献报道了一系列水蛭具有抗凝作用的多肽类成分，包括水蛭素、肝素、组织胺、氨基酸和其他多肽类物质等。刘晓帆等[5]认为，水蛭素只存在于新鲜水蛭的唾液中，经过煎煮和人口服后，会损失殆尽，水蛭素作为水蛭的有效成分，缺乏科学依据。另外，水蛭含有多种氨基酸，包括人体必需的8种氨基酸，因而本文采用氨基酸仪测定脑血康丸中的总氨基酸含量，对控制本品质量具有很大意义。
参考文献
[1]郑盈莹、万林春等．柱前衍生HPLC法测定脑血康颗粒中亮氨酸和异亮氨.江西中医药,2011,42(339):69～70.
[2]吴毅、许妍、郑盈莹等.正交设计优选乳宁丸中总氨基酸的测定工艺.中国药师,2014,,17(5):775～778.
[3]童玉林，谢有良，刘常青，等．正交设计优选青天葵中总黄酮的提取工艺［J］．中国药师，2013，16(2):193～196.
[4]刘阳等.柱前衍生HPLC法测定水蛭、地龙中氨基酸的含量.湖南中医杂志，2012，28(3):138～140.
[5]刘晓帆等.中药水蛭生药学与化学成分的研究进展与展望［J］．环球中医药，2012，5（8）：637～640.
[6]瞿新艳[6]等