杨爱军（山东省泰安市妇幼保健院山东泰安271000）
【中图分类号】R745【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）20-0018-03
【摘要】目的探讨缺氧缺血性脑病新生大鼠发育期间海马神经元的变化与康复之间的关系。方法采用7日龄Wistar仔鼠，实验组制作缺氧缺血性脑病模型。采用形态学和形态计量学、突触体素免疫组织化学及学习记忆能力测试的方法，对生后7d到2个月，分8个时段对海马CA1区细胞形态及免疫反应阳性物质进行动态观察，对4周和2个月仔鼠进行学习记忆能力测试。结果随增龄对照组大鼠CA1区神经元数量有所减少，但突触体素阳性反应物吸光度值相对升高。实验组CA1区细胞质量明显降低，伴学习记忆能力降低，但与上一实验组比较，随增龄突触体素阳性反应物吸光度值升高（7d与72h比较t=2.012，P<0.05；2周与7d比较t=2.014，P<0.05；3周与2周比较，t=2.716，P<0.01；4周与3周比较，t=2.011，P<0.05）。结论海马区细胞减少、轴突溃变、突触损失是神经功能障碍的病理基础。早期干预可提高神经元的质量，促进神经系统功能发育。
【关键词】缺氧缺血脑神经元康复
新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）是窒息后的严重并发症,病情危重，是死亡和致残的常见疾病，存活患儿往往导致神经系统的发育障碍，是围生医学研究的热点，有关研究甚多[1]，但从围生期HIE后发育到成年，不同时段海马发育的形态学变化与智力发育之间的相关性研究少见。本实验利用WistarHIE模型仔鼠，采用免疫组织化学的方法，从缺血后6h（围生期）到成年，对海马CA1区进行细胞学分析并对学习记忆功能进行跟踪研究，为HIE康复研究提供资料。
1材料与方法
1.1材料
动物分组与HIE模型的制备：生后7dWistar仔鼠120只（孕鼠由山东中医药大学实验动物中心提供），对每窝仔鼠采用抽签法随机分成实验组和假手术组（对照组），每组60只，其中6、24、72h，7d、2周、3周对照组和实验组每时段5只，4周和2月每时间段15只（用于记忆能力的测试）。实验组仔鼠在乙醚麻醉下行颈前正中切口，分离右侧颈总动脉，1号手术线结扎，保温2h后，放入含8%氧气的氮氧混合气体的容器内2h，制成HIE模型（实验过程及后期观察过程中死亡者给予补充），假手术组只分离该血管，不结扎也不低氧处理。术后送还母鼠喂养。
1.2方法
1.2.1取材及处理光镜标本制作：于两组鼠术后6、24、72h,7d、2周、3周、4周及2月在乙醚麻醉下开胸，左心室穿刺，先用含肝素（肝素数滴/500ml）的生理盐水灌洗，待右心耳流出液清澈时，再灌注适量4%多聚甲醛，达固定目的后断头取脑。取丘脑水平冠状切面脑片厚约3mm，多聚甲醛后固定8-12h，脱水常规石蜡包埋，连续切片厚6μm，隔10片取1张，苏木素-伊红和尼式染色，光镜观察。
1.2.2免疫组织化学染色石蜡切片常规脱蜡梯度酒精浸水后，切片入3%甲醇-H2O2室温孵育10min，2%马血清室温孵育30min，加1∶100兔抗突触体素多克隆抗体（福州迈新生物公司提供）4℃冰箱过夜，依次再加入生物素标记的羊抗兔IgG工作液和链酶亲和素过氧化物酶，37℃湿盒孵育各30min（以上各步间均以0.01mol/L，pH7.4的PBS充分漂洗）—DBA显色，苏木素轻度复染。光镜观察并进行吸光度（A）图像分析。每时段取5张切片在Nikon图像分析系统下测试，每张切片随机测试海马CA1区10个视野阳性反应物的A值，同时测试同一切片胼胝体10个视野的A值，计算校正CA。
1.3学习记忆能力的测试采取避暗法分别对4周和2个月仔鼠进行一次性被动回避训练。自制回避训练箱训练开始（5只一组）时，打开明暗室间隔通道，将仔鼠放入明室适应2-3min，逃离者重新放回明室，轻击明室箱壁待其逃入暗室后，立即关闭两室间通道，接通电网板电源，以30V的电流强度电击3s。打开两室间通道鼠立即逃出，1-2min后，放回原处饲养。此后，连续3d在相同时间、条件下进行训练，测试仔鼠记忆保持成绩。以最后一次入明室后击箱壁5min不入暗室者为记忆保持者。
1.4数据处理对所获数据用x-±s表示，SPSS8.0软件分析，两两比较用t检验，结果用P值表示。
2结果
2.1海马CA1区细胞的形态学变化对照组各时间点取材的海马各部结构清晰，分布有序，细胞形态正常。随增龄神经元胞体、胞核及核仁均增大，Nissle体密集。实验组各时间点海马各区细胞数量及形态变化甚大。主要表现为神经元胞体严重皱缩深染、核缩小染色质浓缩边聚、核仁不清，甚至细胞缺失，以6h和24h组细胞损伤严重。用图像分析系统在高倍镜下（×600）观察计数自CA1区开始250μm长的颗粒层区核形正常的细胞，并对颗粒层的厚度进行测量，每组计10张切片。对免疫组织化学染色CA1区阳性反应物A值进行测试。核形正常细胞个数配对组间比较，6h、24hP<0.01,72h、7d、3周、4周、2月P<0.05；阳性反应物A值6h、24h、72h、7d、2周、3周、4周、2月P<0.01；阳性反应物A值与上组实验组比较，24h、7d、4周P<0.05，3周P<0.01；核形正常细胞个数和颗粒层厚度，对照组7d～2月与对照组6h比较，P<0.05，各实验组与对照组6h比较，P<0.01。
2.2学习记忆能力测试结果相同时间点第2次和3次测试结果百分比的组间比较，4周P<0.01，2个月P<0.01。
3讨论
正常情况下，中枢神经系统内存在一些功能不活动的突触，但在神经损伤后可以活跃起来。另外，损伤的神经元再生并与靶细胞形成突触联系。脑损伤早期，脑的异常功能尚未固化，有较强的可塑性，较易纠正恢复[2]。本实验提示，大鼠自出生至成熟期，海马的发育乃至脑的发育经历了由量变到质变的过程。
海马是人类学习记忆功能神经环路的主要组成部分之一，其4个区中CA1、CA3尤为重要，而海马对缺氧缺血具有选择性易损性。因此，海马结构遭受破坏，会导致脑发育过程中学习记忆功能和行为的异常。实验结果表明，实验组与对照组相比记忆保持者明显减少，但随增龄及训练记忆能力有所提高，训练结果显示，实验组第3次记忆功能训练，比第2次记忆保持者明显升高，这与发育过程中的学习有关。生后7d仔鼠HIE引起海马CA1区严重的细胞损伤，乃至细胞数量减少，颗粒层厚度降低。随着脑水肿的消退，损伤轻的神经细胞形态功能渐趋正常，虽然在数量上仍不及对照组，但与上一试验组比较有增多的趋势。有关细胞减少的分子机制，极为复杂。起因是缺氧缺血双重因素，导致酸性代谢产物的堆积。有资料指出大脑皮质的PO2在缺血30—150s内就下降到零，同时乳酸、丙酮酸等显著升高，使线粒体膜上一些通道开放，进而释放凋亡诱导因子，引起细胞凋亡。本研究表明长时间的脑缺氧对脑细胞的损伤是严重的，甚至是不可逆的。
本实验结果表明，同时段组间比较免疫阳性反应物的密度明显降低，HIE后一个月阳性反应物的密度有所升高，与对照组相比仍有明显差异，但与上一实验组比较有增多的趋势。关于SYN表达降低原因，笔者认为主要与神经元损伤，细胞减少，轴突溃变、突触损失有关。
小儿生后1—3岁，大脑处于发育最快的时期，是树突发育、突触建立和重塑的重要时期，此期对患儿进行良性或有效干预刺激，可使潜力得到最大恢复和开发，促使脑的代偿适应能力大大增强，减少或遏制神经系统后遗症的发生。大鼠2周以后至4周脑还在发育，此期约相当于2岁以内幼儿，因此是幼儿早期启蒙教育、开发智力最佳时期的形态学依据。随动物的增龄，外界环境刺激可使突触形成，突触体素阳性反应物光密度值比上一实验组升高，说明处于发育阶段的大脑具有较强的可塑性，是HIE康复治疗的最佳时期。虽然本实验用于组织学和免疫组织化学分析的视野较多，但实验所用动物偏少，在某些程度上影响了数据的准确性，有待在今后的实验中给予补充。
参考文献
[1]陈建清，平晓丽，江淑爱，等.早期抚触对缺氧缺血性脑病新生儿神经行为康复的影响.中国临床康复，2006，10：27-29.
[2]蔡文琴,李海标.发育神经生物学.北京：科学出版社，1999：40-116.