本文主要研究内容
作者孙志杰（2019）在《抗人CTLA-4抗体的制备及功能研究》一文中研究指出：细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）是表达于T细胞表面的一种抑制T细胞活化的负调节分子,在恶性肿瘤及一些自身免疫疾病的发生发展中发挥重要作用。肿瘤细胞可以利用CTLA-4实现免疫逃逸,CTLA-4的阻断剂如单克隆抗体能够重新激活免疫系统,达到抗肿瘤的目的。本研究旨在利用鼠源及人源抗体库技术获取靶向人CTLA-4的单克隆抗体。合成人CTLA-4胞外区基因,扩增得到胞外区基因片段,插入大肠杆菌表达载体pET28a,构建了编码人CTLA-4胞外区基因的重组质粒pET28a-CTLA4。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosseta（DE3）中,在IPTG终浓度为0.5 mmol/L、于37℃诱导4 h的条件下,实现了人CTLA-4胞外区重组蛋白的高效表达,表达产物主要为包涵体。对诱导温度、诱导时间及诱导剂IPTG终浓度三个因素进行了优化,确定重组蛋白在IPTG终浓度为1 mmol/L、于25℃诱导6 h的条件下表达量最高。利用高浓度尿素溶解包涵体蛋白,通过Ni2+亲和层析获得了纯度大于90%的重组蛋白。将包涵体蛋白复性成为可溶蛋白,制备了人CTLA-4胞外区基因重组抗原。利用人CTLA-4胞外区基因重组抗原对5只BALB/c小鼠进行了4次免疫。选取血清效价最高的小鼠分离脾脏,提取总RNA,逆转录成cDNA。以cDNA为模板分别扩增得到大小约300bp的抗体轻、重链可变区基因片段,利用重叠延伸PCR将轻、重链可变区基因拼接成大小约为750bp的单链抗体片段ScFv。将ScFv插入噬菌体载体pCANTAB-5E中,转化至大肠杆菌TG1,经PCR鉴定ScFv插入率约为93.5%,构建了库容量约为1.4×106的鼠源噬菌体单链抗体库。经过3轮富集筛选,获得2株针对人CTLA-4胞外区基因重组抗原的鼠源单链抗体基因。另一方面,利用人CTLA-4胞外区基因重组抗原,对大容量的人源噬菌体单链抗体库按照“吸附、洗脱、扩增”的顺序反复进行了4轮淘选。第4轮淘选完成后,经ELISA鉴定,获得24株阳性噬菌体克隆。对该24株阳性噬菌体克隆携带的抗体序列进行分析,其中21株噬菌体克隆携带的抗体基因完全一致,重复率达87.5%,提示其为能够与抗原特异性结合的人源单链抗体基因。利用PCR分别扩增得到大小为324 bp的轻链可变区基因和351 bp的重链可变区基因,构建重组质粒pABL-VL和293H-VH,利用共转染293 F细胞,成功表达了具有完整结构的全抗体。经Protein A亲和层析纯化,获得了纯度大于90%的人源单克隆抗体。利用ELISA、Western印迹鉴定,结果表明抗体具有良好的特异性。此外,还制备了针对人突触小体相关蛋白25（SNAP25）的鼠源单克隆抗体。利用大肠杆菌成功表达了SNAP25蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,制备杂交瘤细胞。经过两轮筛选获得12株针对SNAP25的阳性杂交瘤细胞株,同时鉴定了抗体亚型。选取与抗原结合活性最高的14号杂交瘤细胞株制备腹水单抗,经Protein G亲和层析纯化,最终获得一株纯度大于90%的单克隆抗体,可用于肉毒毒素的检测。
Abstract
xi bao du xing Tlin ba xi bao xiang guan kang yuan -4（CTLA-4）shi biao da yu Txi bao biao mian de yi chong yi zhi Txi bao huo hua de fu diao jie fen zi ,zai e xing zhong liu ji yi xie zi shen mian yi ji bing de fa sheng fa zhan zhong fa hui chong yao zuo yong 。zhong liu xi bao ke yi li yong CTLA-4shi xian mian yi tao yi ,CTLA-4de zu duan ji ru chan ke long kang ti neng gou chong xin ji huo mian yi ji tong ,da dao kang zhong liu de mu de 。ben yan jiu zhi zai li yong shu yuan ji ren yuan kang ti ku ji shu huo qu ba xiang ren CTLA-4de chan ke long kang ti 。ge cheng ren CTLA-4bao wai ou ji yin ,kuo zeng de dao bao wai ou ji yin pian duan ,cha ru da chang gan jun biao da zai ti pET28a,gou jian le bian ma ren CTLA-4bao wai ou ji yin de chong zu zhi li pET28a-CTLA4。jiang chong zu zhi li zhuai hua zhi da chang gan jun Rosseta（DE3）zhong ,zai IPTGzhong nong du wei 0.5 mmol/L、yu 37℃you dao 4 hde tiao jian xia ,shi xian le ren CTLA-4bao wai ou chong zu dan bai de gao xiao biao da ,biao da chan wu zhu yao wei bao han ti 。dui you dao wen du 、you dao shi jian ji you dao ji IPTGzhong nong du san ge yin su jin hang le you hua ,que ding chong zu dan bai zai IPTGzhong nong du wei 1 mmol/L、yu 25℃you dao 6 hde tiao jian xia biao da liang zui gao 。li yong gao nong du niao su rong jie bao han ti dan bai ,tong guo Ni2+qin he ceng xi huo de le chun du da yu 90%de chong zu dan bai 。jiang bao han ti dan bai fu xing cheng wei ke rong dan bai ,zhi bei le ren CTLA-4bao wai ou ji yin chong zu kang yuan 。li yong ren CTLA-4bao wai ou ji yin chong zu kang yuan dui 5zhi BALB/cxiao shu jin hang le 4ci mian yi 。shua qu xie qing xiao jia zui gao de xiao shu fen li pi zang ,di qu zong RNA,ni zhuai lu cheng cDNA。yi cDNAwei mo ban fen bie kuo zeng de dao da xiao yao 300bpde kang ti qing 、chong lian ke bian ou ji yin pian duan ,li yong chong die yan shen PCRjiang qing 、chong lian ke bian ou ji yin pin jie cheng da xiao yao wei 750bpde chan lian kang ti pian duan ScFv。jiang ScFvcha ru shi jun ti zai ti pCANTAB-5Ezhong ,zhuai hua zhi da chang gan jun TG1,jing PCRjian ding ScFvcha ru lv yao wei 93.5%,gou jian le ku rong liang yao wei 1.4×106de shu yuan shi jun ti chan lian kang ti ku 。jing guo 3lun fu ji shai shua ,huo de 2zhu zhen dui ren CTLA-4bao wai ou ji yin chong zu kang yuan de shu yuan chan lian kang ti ji yin 。ling yi fang mian ,li yong ren CTLA-4bao wai ou ji yin chong zu kang yuan ,dui da rong liang de ren yuan shi jun ti chan lian kang ti ku an zhao “xi fu 、xi tuo 、kuo zeng ”de shun xu fan fu jin hang le 4lun tao shua 。di 4lun tao shua wan cheng hou ,jing ELISAjian ding ,huo de 24zhu yang xing shi jun ti ke long 。dui gai 24zhu yang xing shi jun ti ke long xie dai de kang ti xu lie jin hang fen xi ,ji zhong 21zhu shi jun ti ke long xie dai de kang ti ji yin wan quan yi zhi ,chong fu lv da 87.5%,di shi ji wei neng gou yu kang yuan te yi xing jie ge de ren yuan chan lian kang ti ji yin 。li yong PCRfen bie kuo zeng de dao da xiao wei 324 bpde qing lian ke bian ou ji yin he 351 bpde chong lian ke bian ou ji yin ,gou jian chong zu zhi li pABL-VLhe 293H-VH,li yong gong zhuai ran 293 Fxi bao ,cheng gong biao da le ju you wan zheng jie gou de quan kang ti 。jing Protein Aqin he ceng xi chun hua ,huo de le chun du da yu 90%de ren yuan chan ke long kang ti 。li yong ELISA、Westernyin ji jian ding ,jie guo biao ming kang ti ju you liang hao de te yi xing 。ci wai ,hai zhi bei le zhen dui ren tu chu xiao ti xiang guan dan bai 25（SNAP25）de shu yuan chan ke long kang ti 。li yong da chang gan jun cheng gong biao da le SNAP25dan bai ,chun hua hou mian yi BALB/cxiao shu ,zhi bei za jiao liu xi bao 。jing guo liang lun shai shua huo de 12zhu zhen dui SNAP25de yang xing za jiao liu xi bao zhu ,tong shi jian ding le kang ti ya xing 。shua qu yu kang yuan jie ge huo xing zui gao de 14hao za jiao liu xi bao zhu zhi bei fu shui chan kang ,jing Protein Gqin he ceng xi chun hua ,zui zhong huo de yi zhu chun du da yu 90%de chan ke long kang ti ,ke yong yu rou du du su de jian ce 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自辽宁大学的孙志杰，发表于刊物辽宁大学2019-09-05论文，是一篇关于单克隆抗体论文,噬菌体抗体库论文,辽宁大学2019-09-05论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自辽宁大学2019-09-05论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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