本文主要研究内容
作者朱红晓（2019）在《猪流行性腹泻病毒PCR-ELISA检测方法的建立》一文中研究指出：猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒引起的一种急性、接触性肠道传染病,能够引起猪的腹泻、呕吐、脱水,对哺乳仔猪的致死率可达80%-100%。2010年以来,该病在我国暴发流行,给生猪养殖业造成了巨大的经济损失。目前,PEDV的防控主要包括病原监测、免疫防控、生物安全、加强畜群营养管理、临床诊断等综合措施,其中病原的的PCR-ELISA方法用以该病的早期监测。对GenBank公布的PEDV的ORF3基因序列,进行比对分析,针对保守序列设计合成一对RT-PCR特异性引物,通过PCR扩增获得PEDV ORF3目的基因片段,将其克隆至pMD19-T载体上,构建pMD19-T-ORF3重组质粒,质粒经PCR鉴定和测序,完成目的基因的鉴定。对该上下游引物的5’端分别标记地高辛和生物素,合成一对带有标记物的引物。以构建好的质粒为模板,用带有标记物的引物在相同条件下进行PCR扩增,得到两端带有标记物的PCR产物。按照PCR-ELISA的操作步骤对PCR-ELISA所用链霉亲和素的包被浓度、BSA封闭液的封闭浓度、PCR产物的作用时间、酶标二抗的工作稀释浓度以及作用时间、显色时间等进行优化,进而确定反应的最佳条件,取经PCR鉴定为PEDV阴性的35份样品,进行PCR-ELISA检测,测其OD450nm值,依据公式校正值=平均值（??）+3×标准方差（SD）确定PCR-ELISA检测方法的临界值。将PEDV的基因组cDNA进行倍比稀释,进行PCR-ELISA检测,确定其敏感性。以PRRSV、PRV、CSFV、PCV-2、猪乙型脑炎的DNA为模板,在最佳反应条件下进行PCR-ELISA检测其特异性。通过用不同的病料对同一时间包被的酶标板进行批内重复性检测和不同时间包被的酶标板进行批间重复性检测,确定该检测方法的重复性。通过与普通PCR检测和Q-PCR的检测结果比较其符合性。结果显示,常规PCR扩增出条带大小为227bp,经测序分析,与GenBank上发布的PEDV ORF3基因的同源性为100%,证明扩增的目的片段为PEDV ORF3基因。对PCR-ELISA各个试验条件进行优化,筛选出最佳反应条件:1:800稀释的链霉亲和素（1mg/mL）4℃包被过夜,2%的BSA封闭液37℃条件下封闭15min,1:50稀释的PCR产物37℃作用15min,2000倍稀释的酶标二抗（1mg/mL）37℃反应15min,显色5min。将已知PEDV阴性的35份样品,经PCR-ELIAS检测,样本OD450nm值大于等于0.35的判定为阳性,小于0.29判定为阴性,介于二者之间为可疑样品。本试验建立的PCR-ELISA可检测到阳性质粒的最低检测限3.94×103copies/μL,而常规PCR可以检测到的最低限为3.94×106copies/μL,由结果可以看出,PCR-ELISA敏感性比常规PCR高1000倍,并与PRRSV、PRV、CSFV、PCV-2、猪乙型脑炎无交叉反应,说明其特异性好。对64份临床样品进行检测,PCR检测出31份阳性,阳性检出率为48.4%,PCR-ELISA检测出36份阳性样品,阳性检出率为56.2%,Q-PCR检测出36份阳性。将PCR鉴定为阴性PCR-ELISA和Q-PCR检测为阳性的5份样品进行病毒分离培养、IFA鉴定,结果均为阳性,说明建立的PCR-ELISA检测方法准确度高,与荧光定量PCR的符合率为100%。总之,本试验建立了一种高效、快速、特异、灵敏、安全的PEDV检测方法,为进一步组装试剂盒或研制试纸条用于PEDV的流行病学调查、猪场的环境监测以及诊断提供技术支撑。
Abstract
zhu liu hang xing fu xie shi you zhu liu hang xing fu xie bing du yin qi de yi chong ji xing 、jie chu xing chang dao chuan ran bing ,neng gou yin qi zhu de fu xie 、ou tu 、tuo shui ,dui bu ru zai zhu de zhi si lv ke da 80%-100%。2010nian yi lai ,gai bing zai wo guo bao fa liu hang ,gei sheng zhu yang shi ye zao cheng le ju da de jing ji sun shi 。mu qian ,PEDVde fang kong zhu yao bao gua bing yuan jian ce 、mian yi fang kong 、sheng wu an quan 、jia jiang chu qun ying yang guan li 、lin chuang zhen duan deng zeng ge cuo shi ,ji zhong bing yuan de de PCR-ELISAfang fa yong yi gai bing de zao ji jian ce 。dui GenBankgong bu de PEDVde ORF3ji yin xu lie ,jin hang bi dui fen xi ,zhen dui bao shou xu lie she ji ge cheng yi dui RT-PCRte yi xing yin wu ,tong guo PCRkuo zeng huo de PEDV ORF3mu de ji yin pian duan ,jiang ji ke long zhi pMD19-Tzai ti shang ,gou jian pMD19-T-ORF3chong zu zhi li ,zhi li jing PCRjian ding he ce xu ,wan cheng mu de ji yin de jian ding 。dui gai shang xia you yin wu de 5’duan fen bie biao ji de gao xin he sheng wu su ,ge cheng yi dui dai you biao ji wu de yin wu 。yi gou jian hao de zhi li wei mo ban ,yong dai you biao ji wu de yin wu zai xiang tong tiao jian xia jin hang PCRkuo zeng ,de dao liang duan dai you biao ji wu de PCRchan wu 。an zhao PCR-ELISAde cao zuo bu zhou dui PCR-ELISAsuo yong lian mei qin he su de bao bei nong du 、BSAfeng bi ye de feng bi nong du 、PCRchan wu de zuo yong shi jian 、mei biao er kang de gong zuo xi shi nong du yi ji zuo yong shi jian 、xian se shi jian deng jin hang you hua ,jin er que ding fan ying de zui jia tiao jian ,qu jing PCRjian ding wei PEDVyin xing de 35fen yang pin ,jin hang PCR-ELISAjian ce ,ce ji OD450nmzhi ,yi ju gong shi jiao zheng zhi =ping jun zhi （??）+3×biao zhun fang cha （SD）que ding PCR-ELISAjian ce fang fa de lin jie zhi 。jiang PEDVde ji yin zu cDNAjin hang bei bi xi shi ,jin hang PCR-ELISAjian ce ,que ding ji min gan xing 。yi PRRSV、PRV、CSFV、PCV-2、zhu yi xing nao yan de DNAwei mo ban ,zai zui jia fan ying tiao jian xia jin hang PCR-ELISAjian ce ji te yi xing 。tong guo yong bu tong de bing liao dui tong yi shi jian bao bei de mei biao ban jin hang pi nei chong fu xing jian ce he bu tong shi jian bao bei de mei biao ban jin hang pi jian chong fu xing jian ce ,que ding gai jian ce fang fa de chong fu xing 。tong guo yu pu tong PCRjian ce he Q-PCRde jian ce jie guo bi jiao ji fu ge xing 。jie guo xian shi ,chang gui PCRkuo zeng chu tiao dai da xiao wei 227bp,jing ce xu fen xi ,yu GenBankshang fa bu de PEDV ORF3ji yin de tong yuan xing wei 100%,zheng ming kuo zeng de mu de pian duan wei PEDV ORF3ji yin 。dui PCR-ELISAge ge shi yan tiao jian jin hang you hua ,shai shua chu zui jia fan ying tiao jian :1:800xi shi de lian mei qin he su （1mg/mL）4℃bao bei guo ye ,2%de BSAfeng bi ye 37℃tiao jian xia feng bi 15min,1:50xi shi de PCRchan wu 37℃zuo yong 15min,2000bei xi shi de mei biao er kang （1mg/mL）37℃fan ying 15min,xian se 5min。jiang yi zhi PEDVyin xing de 35fen yang pin ,jing PCR-ELIASjian ce ,yang ben OD450nmzhi da yu deng yu 0.35de pan ding wei yang xing ,xiao yu 0.29pan ding wei yin xing ,jie yu er zhe zhi jian wei ke yi yang pin 。ben shi yan jian li de PCR-ELISAke jian ce dao yang xing zhi li de zui di jian ce xian 3.94×103copies/μL,er chang gui PCRke yi jian ce dao de zui di xian wei 3.94×106copies/μL,you jie guo ke yi kan chu ,PCR-ELISAmin gan xing bi chang gui PCRgao 1000bei ,bing yu PRRSV、PRV、CSFV、PCV-2、zhu yi xing nao yan mo jiao cha fan ying ,shui ming ji te yi xing hao 。dui 64fen lin chuang yang pin jin hang jian ce ,PCRjian ce chu 31fen yang xing ,yang xing jian chu lv wei 48.4%,PCR-ELISAjian ce chu 36fen yang xing yang pin ,yang xing jian chu lv wei 56.2%,Q-PCRjian ce chu 36fen yang xing 。jiang PCRjian ding wei yin xing PCR-ELISAhe Q-PCRjian ce wei yang xing de 5fen yang pin jin hang bing du fen li pei yang 、IFAjian ding ,jie guo jun wei yang xing ,shui ming jian li de PCR-ELISAjian ce fang fa zhun que du gao ,yu ying guang ding liang PCRde fu ge lv wei 100%。zong zhi ,ben shi yan jian li le yi chong gao xiao 、kuai su 、te yi 、ling min 、an quan de PEDVjian ce fang fa ,wei jin yi bu zu zhuang shi ji he huo yan zhi shi zhi tiao yong yu PEDVde liu hang bing xue diao cha 、zhu chang de huan jing jian ce yi ji zhen duan di gong ji shu zhi cheng 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自河南科技学院的朱红晓，发表于刊物河南科技学院2019-07-06论文，是一篇关于猪流行性腹泻病毒论文,荧光定量论文,河南科技学院2019-07-06论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自河南科技学院2019-07-06论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。