导读:本文包含了绵羊成纤维细胞论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:绵羊,IGF-Ⅰ基因,剪接异构体,细胞增殖
绵羊成纤维细胞论文文献综述
张嘉楠[1]（2019）在《绵羊IGF-Ⅰ基因Ⅰ类剪接体对成纤维细胞增殖及凋亡的影响》一文中研究指出绵羊为人类提供大量的肉、皮、毛、绒等羊产品,在我国畜牧生产中占有举足轻重的地位。IGF-Ⅰ基因在脊椎动物生长发育过程中起到重要的调控作用,同时也是培育高产、优质的肉用、毛用动物新品种时重要的候选基因。但是,IGF-Ⅰ基因在转录过程中存在可变剪接现象,由此产生多种具有不同生物学功能的剪接异构体。在IGF-Ⅰ基因所有剪接异构体中,I类剪接异构体约占IGF-Ⅰ总量的70%左右,对机体的生长发育起到主要的调控作用。而I类剪接异构体又存在Ea、Eb两种亚型,这两种剪接异构体在功能上的差异仍待未明晰。本研究首先通过基因克隆获得IGF-Ⅰ基因I类Ea型及I类Eb型剪接异构体,进行系统的生物学信息分析,并揭示它们的时空表达变化规律;随后构建两种I类剪接异构体的过表达载体和干扰SiRNA,分别转染绵羊胎儿皮肤和胎盘来源的成纤维细胞,上调或抑制两种I类剪接异构体的表达水平,分析两种I类剪接异构体对不同来源成纤维细胞增殖、活性及凋亡的影响,初步探讨IGF-1基因两种I类剪接异构体的生物学功能,研究结果如下:(1)本研究成功克隆得到绵羊IGF-Ⅰ基因I类剪接异构体Ea型及Eb型全长编码区。其中IGF-Ⅰ基因I类Ea型包含外显子1、3、4、6,扩增目的片段长534 bp,编码154个氨基酸;I类Eb型包含外显子1、3、4、5,扩增目的片段长610 bp,编码188个氨基酸。两种剪接异构体蛋白总体上呈现疏水性较弱、亲水性较强,为水溶性氨基酸。二者均含有信号肽,为分泌蛋白,大多位于分泌途径。两者结构整体相似,E结构域存在差异。(2)利用半定量RT-PCR方法对IGF-Ⅰ基因I类两种剪接异构体在胎羊、羔羊、成羊叁个时期12种组织中的表达水平进行检测,结果表明,IGF-Ⅰ基因I类Ea型在胎羊及羔羊时期表现出较高的表达水平,在心脏、肌肉、肺、肾脏、肠、胃及皮肤中的表达水平极显着高于成羊时期(P<0.01);I类Eb型在胎羊肌肉、肺及皮肤组织中的表达水平要显着高于成羊时期(P<0.05),在羔羊的胃和睾丸组织中表达水平显着高于成羊相应组织(P<0.05)。总体上,IGF-Ⅰ基因两种I类剪接异构体在胎羊及羔羊时期组织中的表达水平要高于成羊时期,且I类Ea型的表达水平高于I类Eb型,为主要的转录本类型。(3)将克隆得到的IGF-Ⅰ基因两种I类剪接异构体CDS区的全片段分别插入过表达载体pcDNA3.1-EGFP中,并设计干扰位点,利用脂质体介导的方法对过表达载体及SiRNA进行转染,转染效率约为40%左右。(4)利用MTT方法对细胞增殖进行检测,结果显示:I类Ea型过表达后,细胞的增殖能力极显着高于对照组(P<0.01),I类Eb型过表达后,细胞的增殖能力显着高于对照组(P<0.05);抑制两种剪接异构体的表达水平后,细胞的增殖能力均极显着低于对照组(P<0.01)。且IGF-Ⅰ基因对两种来源的成纤维细胞之间相比,IGF-Ⅰ基因促进胎盘成纤维细胞增殖的效应强于皮肤成纤维细胞。(5)利用CCK8方法对细胞活性进行检测,结果显示:I类Ea型过表达后,细胞的活性极显着高于对照组(P<0.01),I类Eb型过表达后,细胞活性显着高于对照组(P<0.05);抑制I类Ea的表达水平后,细胞的活性极显着低于对照组细胞(P<0.01),抑制I类Eb型表达水平后,细胞活性显着低于对照组细胞(P<0.05)。且IGF-Ⅰ基因增强胎盘成纤维细胞活性的效应强于皮肤成纤维细胞。(6)利用PI染色方法对细胞周期进行检测,结果显示:I类Ea型过表达后,G1/G0期细胞的百分率较对照组极显着减少(P<0.01),S期极显着增加(P<0.01);I类Eb型过表达后,G1/G0期细胞百分率也显着减少(P<0.05),S期显着增加(P<0.05)。两组细胞在抑制I类Ea型表达水平后,G1/G0期细胞比例极显着增加(P<0.01),S期明显减少(P<0.01);抑制I类Eb型表达水平后,处于各时期细胞的百分率也出现变化,但未达到差异显着水平(P>0.05)。且IGF-Ⅰ基因对胎盘成纤维细胞周期的调控作用强于皮肤成纤维细胞。(7)利用Annexin V-PE/7-ADD双染方法对细胞凋亡进行检测,结果显示:皮肤和胎盘来源成纤维细胞中过表达I类Ea型及I类Eb型后,凋亡率都有所下降,其中I类Ea型过表达后极显着降低(P<0.01),I类Eb型过表达后显着降低(P<0.05)。两组细胞在抑制I类Ea型表达水平后,细胞凋亡率均极显着升高(P<0.01),抑制I类Eb型表达水平后,细胞凋亡率与对照组相比无显着差异(P>0.05)。且IGF-Ⅰ基因在胎盘成纤维细胞中对细胞凋亡的抑制作用强于皮肤成纤维细胞。(本文来源于《东北农业大学》期刊2019-06-01）
魏海霞,罗健,郭延华,张译元,王立民[2]（2018）在《CRISPR/Cas9介导绵羊成纤维细胞MSTN基因突变系统的构建》一文中研究指出肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是肌肉生长负调控因子,MSTN基因突变可造成MSTN生物学功能缺陷,从而引起动物的双肌性状。本研究旨在筛选靶向绵羊(Ovis aries)MSTN基因的高效单导向RNA(single-guide RNA,sgRNA),并构建可标记表达载体,以提高CRISPR/Cas9(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)介导的绵羊MSTN基因突变效率。利用Gibson Assembly法将增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)序列与串联表达原件2A序列插入pX330质粒载体中,构建pX330-EGFP质粒载体,并将设计好的12个sgRNA寡核苷酸链以Golden Gate法分别连入pX330-EGFP质粒载体,以构建12个不同的pX330-EGFP-sgRNA质粒表达载体;将构建好的pX330-EGFP-sgRNA表达载体以电转染的方法分别转入12组绵羊成纤维细胞,48 h后提取各组部分细胞基因组,利用SURVEROR分析初选获得3个具有靶向效果的细胞群(T2,T9,Q2),其对应转染质粒为pX330-EGFP-sgRNA;之后分别提取3组细胞中的阳性转染细胞基因组,扩增MSTN基因并进行测序分析,得出sgRNA-T2、sgRNA-T9、sgRNA-Q2的打靶效率分别为40%、40%、60%。本研究通过构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的pX330-EGFP-sgRNA表达载体,成功筛选到高效靶向绵羊MSTN基因的sgRNA,并获得准确的编辑效率,为后续其他基因sgRNA的筛选提供了借鉴,并为MSTN基因编辑羊的生产提供科学依据。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2018年08期）
魏军昌,陈创夫,乔军,侯晓旭,马齐蔓[3]（2018）在《表达靶向牛病毒性腹泻病毒shRNA的绵羊胎儿成纤维细胞的制备和鉴定》一文中研究指出为了获得具有抗牛病毒性腹泻病毒(BVDV)能力的绵羊胎儿成纤维细胞,采用组织块和酶消化法分离培养绵羊胎儿成纤维细胞,利用脂质体转染法将shRNA转基因表达载体转染绵羊胎儿成纤维细胞,经抗性筛选获得抗性细胞克隆,利用PCR方法对获得的细胞克隆进行鉴定,用BVDV侵染转基因细胞,利用real-time PCR和病毒滴定测定法分析不同细胞克隆抑制BVDV复制的能力。结果显示:试验成功构建了靶向BVDV表达shRNA的转基因表达载体pNeo-2loxp-u6-sh BVDV,经抗性筛选共获得22个抗性细胞克隆;22个细胞克隆中12个细胞克隆含有目的基因,为转基因细胞,其中5个转基因细胞克隆具有明显的抗BVDV复制的能力,最高抗病毒效率达到90.7%。结论:在细胞水平能有效抑制BVDV病毒增殖的转基因绵羊胚胎成纤维细胞的获得,为进一步利用体细胞核移植技术制备转基因绵羊提供了合适的供体细胞。(本文来源于《畜牧与兽医》期刊2018年06期）
刘腾,董丹丹,张莉,朱杰,缪秋红[4]（2018）在《永生化绵羊肺成纤维细胞系的构建及鉴定》一文中研究指出为了利用携带人源端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,h TERT)基因的慢病毒表达系统将原代绵羊肺成纤维细胞进行永生化。本研究利用PCR技术从p Babe-neo-h TERT中扩增h TERT基因,并利用infusion技术构建重组慢病毒表达载体p LOV-puro-h TERT。将重组慢病毒叁质粒系统共转染293T细胞,拯救出慢病毒颗粒并感染原代绵羊肺成纤维细胞,经嘌呤霉素抗性筛选获得阳性克隆,分别应用RT-PCR和Western blot方法检测传代细胞系中h TERT基因的转录和表达水平。筛选获得的阳性克隆,命名为SLT细胞系。SLT细胞系连续传代后RT-PCR及Western blot检测均显示h TERT稳定表达。本研究表明,我们成功构建了永生化绵羊肺成纤维细胞系。(本文来源于《中国动物传染病学报》期刊2018年02期）
冯新宇,袁超,郭婷婷,刘建斌,郭健[5]（2018）在《利用CRISPR/Cas9系统敲除绵羊皮肤成纤维细胞Wnt2基因的研究》一文中研究指出为了研究无翅基因相关整合位点2(Wnt2)在绵羊毛囊发育中的作用,通过CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术在绵羊原代皮肤成纤维细胞中敲除Wnt2基因,经T7E1酶切试验进行敲除结果验证,实时荧光定量PCR分析Wnt2、E-钙黏蛋白(CDH1)、半光天冬氨酸酶3(Caspase3)和成纤维细胞生长因子5(FGF5)在敲除后的表达量变化。结果显示:绵羊原代皮肤成纤维细胞中Wnt2基因敲除成功,编辑效率约14.35%;Wnt2相对表达量极显着下调(P<0.01),CDH1相对表达量极显着上调(P<0.01),Caspase3及FGF5表达上调显着(P<0.05)。结果表明:Wnt2基因对毛囊的生长发育具有促进作用。(本文来源于《畜牧与兽医》期刊2018年02期）
吴宪,荆乾鸽,王凤梅,贺小英,马利兵[6]（2019）在《绵羊皮肤成纤维细胞对G418及Blasticidin S抗性的研究》一文中研究指出抗生素常被用于对转基因动物、植物及微生物细胞进行筛选。在进行抗生素抗性筛选前,需要摸索合适的抗生素使用浓度,其原因在于:过低的筛选浓度无法抑制非转基因细胞的生长;反之,过高的筛选浓度会导致转基因细胞死亡。为了摸索绵羊皮肤成纤维细胞(sheep skin fibroblasts, SSFs)对G418及Blasticidin S的抗性,本实验以体外培养的SSFs为实验材料,采用不同浓度的上述两种抗生素处理SSFs,采用活细胞计数的方式检测SSFs对上述两种抗生素的抗性。单独使用G418或Blasticidin S导致SSFs全部死亡的最低致死浓度分别为200μg/mL及4μg/mL;当两种抗生素联合使用时,其最低致死浓度为100μg/mL G418+3μg/mL Blasticidin S或150μg/mL G418+2μg/mL Blasticidin S。该实验为采用这两种抗生素筛选转基因SSFs提供了理论基础。(本文来源于《基因组学与应用生物学》期刊2019年03期）
张娜[7]（2016）在《可逆永生化绵羊成纤维细胞系的建立及其应用研究》一文中研究指出体外培养的动物细胞在生物学研究、细胞治疗、转基因及动物克隆等领域均有非常重要的应用价值。但是,从动物组织分离的原代细胞增殖寿命有限,不利于体外连续传代培养,从而也不利于它们在基因打靶、转基因克隆等领域的应用。研究证明,在正常体细胞中异位表达人端粒酶逆转录酶基因(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)可以重构端粒酶活性,延长细胞寿命。然而,组成型表达hTERT会导致克隆胚胎发育停滞等问题。因此,本文试图通过条件性表达hTERT,建立可逆永生化绵羊成纤维细胞系,用于今后家畜体细胞转基因克隆及其它生物学研究。基于Tet-on系统,构建了hTERT可诱导表达质粒载体pTet-onhTEKT。利用电击转染的方法,将线性化的pTet-on hTERT转染到绵羊胎儿成纤维细胞中。在Dox (doxycyline)的诱导下,最终获得了6个稳定表达hTERT的细胞克隆。6个细胞克隆从96孔板扩增到60mm时,各分成两组：一组培养液中持续添加Dox,记为h(+)组；一组培养液中撤销Dox,记为h(-)组。用RT-PCR和Western blot分别检测了两组细胞中hTERT mRNA和hTERT蛋白质的表达水平,检测结果显示h(+)细胞中高表达hTERT mRNA和hTERT蛋白质。用TRPA (telomeric repeat amplification protocol)法检测了两组细胞中的端粒酶活性,结果证明在h(+)细胞中能够重构端粒酶活性。经过120天的连续传代培养,h(-)组细胞种群增长速率逐渐变慢直至衰老死亡,而h(+)组细胞种群增长速率一直保持稳定且细胞状态良好。这些结果证明了,异位表达hTERT能够使绵羊胎儿成纤维细胞永生化。随后,将h(+)组细胞又分成两组：一组培养液中仍添加Dox,仍记为h(+)组：另一组培养液中撤销Dox,记为h(+-)组。又经过130天的连续传代培养,h(+)组细胞种群增长速率仍保持不变且细胞状态良好,而h(+-)组细胞种群增长速率逐渐变慢且细胞形态扁平,证明了撤销Dox能够使永生化细胞发生逆转。对连续传代培养共250天左右的h(+)组细胞进行软琼脂克隆形成实验和染色体核型分析,结果证明永生化细胞未发生恶性转化。除此之外,将肌分化因子MyoD转染连续传代培养200天的h2(+)细胞。经过又一轮的细胞克隆筛选后,得到13个整合了MyoD的细胞克隆。通过RT-PCR,检测了这13个克隆中MyoD及其它肌肉特异性基因的表达。这一实验表明,寿命延长的h(+)细胞可以进行再一轮的转基因操作,因此可用于基因修饰和基础细胞学研究等。成年成纤维细胞较胎儿成纤维细胞取材更方便且不涉及伦理问题,更重要的是成年成纤维细胞作为核供体可以用于优良性状动物个体的克隆以及珍稀和濒危动物的扩繁及保种。但是,与胎儿成纤维细胞相比,成年成纤维细胞的增殖能力更差,核移植效率也更低。为了解决这一问题,本文又将pTet-on hTERT转染成年绵羊成纤维细胞,筛选得到了寿命延长的细胞克隆A3h38(+)。用连续传代培养136天的A3h38(+)细胞与原代成年成纤维细胞分别进行细胞集落形成实验,结果表明,A3h38(+)细胞的单细胞集落形成能力及集落扩增能力都显着高于原代成年绵羊成纤维细胞。然后,用连续传代培养80天的A3h38(+)细胞与原代成年成纤维细胞分别作为核供体进行核移植,结果显示A3h38(+)细胞作为核供体的克隆胚胎囊胚率比原代成年成纤维细胞显着提高。因此,建立永生化成纤维细胞系将为家畜体细胞的基因修饰及转基因克隆提供宝贵材料。(本文来源于《中国农业大学》期刊2016-11-01）
张娜,张硕,侯健[8]（2016）在《可逆永生化绵羊成纤维细胞系的构建及其应用》一文中研究指出引言/目的研究表明,在人或动物体细胞中异位表达人端粒酶基因(hTERT)能够重构端粒酶活性,延长细胞寿命。本研究引入四环素可诱导表达系统(Tet-on)来构建可诱导表达的hTERT载体系统,建立可逆永生化的绵羊成纤维细胞系,并探索这种永生化细胞作为转基因细胞材料和体细胞核移植的核供体的可行性。材料方法首先,构建了hTERT基因的可诱导表达质粒载体pTet-on hTERT;然后,分别转染绵(本文来源于《中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十八届学术研讨会暨中日韩第四届动物繁殖学术交流会论文集》期刊2016-08-18）
王伟,王玉霜,黄兰兰,简子健,王新华[9]（2016）在《siRNA干扰绵羊胚胎成纤维细胞Lig4基因增加同源重组载体重连修复效率》一文中研究指出在动物细胞中,抑制非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)修复途径,可以提高同源重组(Homologous recombination,HR)修复基因组双链断裂(Double-strand brakes,DSBs)的发生概率。为了提高绵羊胚胎成纤维细胞的HR效率,针对NHEJ修复途径中的关键因子Lig4(DNA ligase 4)基因,本文设计合成4个具有靶向性的siRNA(Small interfering RNA)。绵羊胚胎成纤维细胞经电转染导入si RNA,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blotting检测,筛选出有效抑制Lig4基因表达的2个siRNA。应用质粒重连法检测HR修复效率,将I-SceⅠ酶线性化的HR质粒和si RNA共转染绵羊胚胎成纤维细胞,经72 h培养及流式细胞仪检测,与对照组细胞比较,结果表明HR质粒重连效率提高了3~4倍。瞬间干扰Lig4基因的表达可提高HR质粒重连效率,为改善绵羊胚胎成纤维细胞基因打靶效率提供理论基础。(本文来源于《遗传》期刊2016年09期）
安铁洙,李昊,王春生,王子竹,宋红卫[10]（2016）在《转B2C/拟蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊成纤维细胞株的筛选》一文中研究指出为了建立绵羊被毛特异表达蜘蛛拖丝蛋白基因的方法,研究利用前期工作获得的绵羊高硫角蛋白结合蛋白基因B2C启动子和人工合成的拟蜘蛛拖丝蛋白基因二聚体(2S),构建真核表达载体pc DNA3.1-B2C-2S,进行线性化后,采用脂质体法转染进绵羊成纤维细胞并经G418筛选获得转基因阳性细胞,再进行PCR检测和冷冻复苏后进行生物学特性检测。结果表明:成功构建真核表达载体pc DNA3.1-B2C-2S,将其整合入转基因阳性细胞的基因组中;转基因阳性细胞经冷冻复苏后,其细胞形态仍保持成纤维细胞的梭形形态,且在续培养中呈现正常细胞相近的"S"型生长曲线。说明试验成功获得转pc DNA3.1-B2C-2S绵羊成纤维细胞株。(本文来源于《黑龙江畜牧兽医》期刊2016年07期）
绵羊成纤维细胞论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)是肌肉生长负调控因子,MSTN基因突变可造成MSTN生物学功能缺陷,从而引起动物的双肌性状。本研究旨在筛选靶向绵羊(Ovis aries)MSTN基因的高效单导向RNA(single-guide RNA,sgRNA),并构建可标记表达载体,以提高CRISPR/Cas9(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)介导的绵羊MSTN基因突变效率。利用Gibson Assembly法将增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)序列与串联表达原件2A序列插入pX330质粒载体中,构建pX330-EGFP质粒载体,并将设计好的12个sgRNA寡核苷酸链以Golden Gate法分别连入pX330-EGFP质粒载体,以构建12个不同的pX330-EGFP-sgRNA质粒表达载体;将构建好的pX330-EGFP-sgRNA表达载体以电转染的方法分别转入12组绵羊成纤维细胞,48 h后提取各组部分细胞基因组,利用SURVEROR分析初选获得3个具有靶向效果的细胞群(T2,T9,Q2),其对应转染质粒为pX330-EGFP-sgRNA;之后分别提取3组细胞中的阳性转染细胞基因组,扩增MSTN基因并进行测序分析,得出sgRNA-T2、sgRNA-T9、sgRNA-Q2的打靶效率分别为40%、40%、60%。本研究通过构建表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的pX330-EGFP-sgRNA表达载体,成功筛选到高效靶向绵羊MSTN基因的sgRNA,并获得准确的编辑效率,为后续其他基因sgRNA的筛选提供了借鉴,并为MSTN基因编辑羊的生产提供科学依据。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
绵羊成纤维细胞论文参考文献
[1].张嘉楠.绵羊IGF-Ⅰ基因Ⅰ类剪接体对成纤维细胞增殖及凋亡的影响[D].东北农业大学.2019
[2].魏海霞,罗健,郭延华,张译元,王立民.CRISPR/Cas9介导绵羊成纤维细胞MSTN基因突变系统的构建[J].农业生物技术学报.2018
[3].魏军昌,陈创夫,乔军,侯晓旭,马齐蔓.表达靶向牛病毒性腹泻病毒shRNA的绵羊胎儿成纤维细胞的制备和鉴定[J].畜牧与兽医.2018
[4].刘腾,董丹丹,张莉,朱杰,缪秋红.永生化绵羊肺成纤维细胞系的构建及鉴定[J].中国动物传染病学报.2018
[5].冯新宇,袁超,郭婷婷,刘建斌,郭健.利用CRISPR/Cas9系统敲除绵羊皮肤成纤维细胞Wnt2基因的研究[J].畜牧与兽医.2018
[6].吴宪,荆乾鸽,王凤梅,贺小英,马利兵.绵羊皮肤成纤维细胞对G418及BlasticidinS抗性的研究[J].基因组学与应用生物学.2019
[7].张娜.可逆永生化绵羊成纤维细胞系的建立及其应用研究[D].中国农业大学.2016
[8].张娜,张硕,侯健.可逆永生化绵羊成纤维细胞系的构建及其应用[C].中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十八届学术研讨会暨中日韩第四届动物繁殖学术交流会论文集.2016
[9].王伟,王玉霜,黄兰兰,简子健,王新华.siRNA干扰绵羊胚胎成纤维细胞Lig4基因增加同源重组载体重连修复效率[J].遗传.2016
[10].安铁洙,李昊,王春生,王子竹,宋红卫.转B2C/拟蜘蛛拖丝蛋白基因绵羊成纤维细胞株的筛选[J].黑龙江畜牧兽医.2016