一、小菜蛾、甜菜夜蛾的抗药性现状及治理对策（论文文献综述）
周雯[1]（2021）在《蔬菜害虫治理中的农户认知、决策及药剂治理现状与对策》文中指出长期以来,害虫的发生及危害一直是影响蔬菜高效、优质、安全生产的重要问题。害虫治理是蔬菜生产的重要组成部分,药剂防治在蔬菜害虫治理中起着关键作用。由于蔬菜用药的高要求、菜田生态系统的特殊性和害虫发生规律的复杂性,加之抗药性的快速发展,蔬菜害虫治理面临不小的挑战,蔬菜害虫治理中药剂的高效、安全使用成为亟需解决的现实问题。影响治理质量的因素是复杂的,实施科学治理的前提首先要明确蔬菜害虫治理中存在的问题。本文从农户主体出发,研究农户农药认知与用药决策行为,系统分析了两类重要蔬菜害虫治理中药剂利用现状,并在田间药效验证的基础上对代表性害虫提出化防药剂建议,以期为蔬菜害虫的科学药剂防治提供依据。本文研究内容分为三个部分,结论如下:1、以江苏省181个农户调查数据为案例,对农户认知与用药行为进行描述性分析,并采用二元logistic模型对农户对蔬菜害虫用药行为的影响因素进行实证分析。描述性分析结果表明,菜农对害虫和农药使用认知不理想,61.3%的农户仅认识部分害虫,58.6%的农户不关注农药防治靶标,且违规用药现象普遍,不科学不规范用药行为占比达52.5%。实证结果表明,菜农受教育程度、蔬菜种植面积、接受技术指导程度、对蔬菜害虫认知水平、对农药作用靶标的关注、对农药相关条例的关注均对合规用药行为呈正向影响,而种植年限呈负向影响;2、选择茄科和十字花科两类重要蔬菜为目标,检索归纳并比对中国农药信息网农业部登记药剂与实际生产中推荐/常用药剂,分析该两类蔬菜害虫登记农药现状和存在问题,以完善用药决策规范和依据。结果表明,截至2020年9月,茄科和十字花科蔬菜害虫登记药剂种类广泛,重要害虫药剂选择充分,但仍有部分登记药剂滞后,品种结构不合理,决策信息不充分,依然存在常发虫害无药可用、常用农药未经登记的问题,且登记数据库中化学农药、单剂农药等老旧农药占比大;3、选择前述两类重要蔬菜上代表性害虫为对象,选取几种代表性防治药剂进行田间药效试验,验证登记药剂药效并评价常用药剂的防治效果,以筛选出高效、安全、持久、经济的防治药剂种类。小青菜小菜蛾药效试验结果显示,10.5%三氟甲吡醚和60g/L乙基多杀菌素对小菜蛾防效最好,药后7d校正防效分别达94.4%和90.4%。辣椒烟粉虱药效试验结果显示,75g/L阿维·双丙环虫酯和22%螺虫·噻虫啉速效性和持效性均良好,药后7d防效均达90%以上。且部分登记药剂防效验证结果较好,部分常用或推荐药剂安全高效,复配剂的防效均显着优于其单剂,1.5倍剂量一般比田间推荐剂量防效好,化学农药见效略快,生物农药防效更持久。针对以上研究结论与存在问题,从蔬菜种植户、政府监管、市场主体、产学研合作等方面,提出以下对策建议:（1）政府部门加强指导,提高菜农用药水平;（2）农业农村部农药管理部门应完善农药登记,国家给予政策补贴;（3）建立科学智能的害虫管理决策系统,畅通防治信息渠道;（4）重视药剂防治研究,加快绿色安全高效药剂研发;（5）市场监管加大力度,规范从业人员队伍。
刘宴弟[2]（2021）在《桃小食心虫对二酰胺类杀虫剂的抗性风险评估及抗性机理研究》文中进行了进一步梳理桃小食心虫是果树生产中发生与危害最为严重的害虫之一,严重制约了果树产业的高效发展,造成了重大经济损失,目前化学农药是治理桃小食心虫的主要措施,但在化学杀虫剂的使用过程中抗药性问题较为严重,抗药性一旦发生,不仅会导致害虫肆意爆发,还需投入大量的人力、物力。氯虫苯甲酰胺、四唑虫酰胺是具有独特作用方式的新型二酰胺类杀虫剂,其中氯虫苯甲酰胺已被广泛用于桃小食心虫的防治,四唑虫酰胺还未大量投入使用。在害虫产生抗药性之前评估抗药性产生风险,有助于杀虫剂的合理使用,延缓抗药性的产生。因此,本研究在实验室条件下,预测了桃小食心虫对氯虫苯甲酰胺、四唑虫酰胺的抗药性产生风险和抗性发展速率;测定了桃小食心虫体内解毒代谢酶对氯虫苯甲酰胺、四唑虫酰胺的响应情况;获得桃小食心虫两个抗性品系与其它杀虫剂的交互抗性情况,并观察氯虫苯甲酰胺亚致死剂量对桃小食心虫生物学特性的影响。本研究主要结果如下:1.在选育压为30%80%的情况下用氯虫苯甲酰胺对桃小食心虫筛选10代后,桃小食心虫产生了8.58倍抗药性,抗性现实遗传力为0.21,那么在死亡率为50%90%、现实遗传力为0.21的情况下,桃小食心虫增加10倍的抗药性约需105代。同样的条件下,用四唑虫酰胺对桃小食心虫筛选10代,得到抗性倍数为7.86的抗性种群,估算在死亡率为50%90%、现实遗传力为0.18的情况下,桃小食心虫对四唑虫酰胺增加10倍的抗药性约需136代。2.交互抗性结果显示,筛选10代后的桃小食心虫抗氯虫苯甲酰胺品系,对高效氯氰菊酯、联苯菊酯、高效氯氟氰菊酯、四唑虫酰胺、甲维盐、阿维菌素、甲氰菊酯和氟虫腈的致死中浓度分别是敏感品系的1.81、4.06、4.89、5.32、5.19、6.94、21.06、36.59倍,与前三种拟除虫菊酯类杀虫剂未表现出明显的交互抗性,与四唑虫酰胺、甲维盐、阿维菌素存在低水平交互抗性,甲氰菊酯、氟虫腈存在中等水平交互抗性;筛选10代后的桃小食心虫抗四唑虫酰胺品系,对高效氯氰菊酯、联苯菊酯、高效氯氟氰菊酯、甲维盐以及阿维菌素不存在明显的交互抗性,与氯虫苯甲酰胺、甲氰菊酯存在低水平的交互抗性,与氟虫腈存在中等水平交互抗性。3.解毒代谢酶活测定结果显示,氯虫苯甲酰胺处理组在第10代时Car E、GSTs、CYP450活性与敏感品系并无显着差异,且三者整个选育过程中变化趋势一致,但Car E活性在整个筛选过程中波动幅度没有GSTs和CYP450明显;四唑虫酰胺选育桃小食心虫时,Car E活性只有在第2代时较其他世代差异显着,其余各世代之间无显着性差异,GSTs活性也相对稳定,CYP450活性受四唑虫酰胺影响最大,在4-8代活性持续上升,各世代之间差异较为显着。4.氯虫苯甲酰胺亚致死剂量处理的桃小食心虫的发育历期与对照敏感品系比明显延长;用LC50处理的桃小食心虫,其蛀果率、脱果率、幼虫存活率以及世代存活率显着低于对照组;CK、LC10、LC30和LC50单雌总产卵量分别为183.67±10.39a、177.66±14.81a、147.83±14.54ab和126.33±11.29b粒。LC30和LC50处理的桃小食心虫与对照相比,内禀增长率、净生殖率和周限增长率显着降低,平均世代周期和种群加倍时间延长,相对适合度降低。
李振宇,肖勇,冯夏[3]（2020）在《广东蔬菜害虫综合治理研究进展》文中研究指明蔬菜是广东省重要的经济作物,蔬菜产业是广东省农业产业化发展的重要产业之一,在农民增收和农村发展中发挥重要作用。广东省光热水资源丰富,常年温暖湿润,种植业发达,蔬菜种类丰富,可周年栽培,且复种指数高,导致蔬菜害虫连续爆发,常年为害,影响蔬菜产量和质量,制约蔬菜产业的健康发展。以小菜蛾、黄曲条跳甲、棕榈蓟马、甜菜夜蛾、斜纹夜蛾、烟粉虱、温室白粉虱、美洲斑潜蝇、豆荚螟等广东主要蔬菜害虫为对象,概述了蔬菜害虫在广东省发生危害规律和近年来抗药性及其机理研究进展,对广东省重要蔬菜害虫综合治理技术及应用进行综述,并展望了未来蔬菜害虫的研究方向。
吕楠楠,梁沛,高希武[4]（2020）在《主要农业害虫对茚虫威的抗性现状及其治理策略》文中研究说明茚虫威属于恶二嗪类杀虫剂,与大多数杀虫剂不同的是其进入害虫体内需要经活化代谢转变成N-去甲氧羰基代谢物（decarbomethoxylated metabolite,DCJW）后不可逆地阻断钠通道,进而发挥杀虫活性。茚虫威由于其作用机制不同于常见的使钠离子通道延迟关闭的菊酯类药剂而被广泛用于鳞翅目和一些同翅目、鞘翅目害虫的防治。抗药性是任何杀虫药剂使用后面临的问题,茚虫威也不例外,许多害虫对其产生了不同程度的抗性。昆虫对茚虫威产生抗性的机制包括酯酶活性、谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase,GST）和P450活性的增加以及分子靶标F1845Y、V1848I、L1014P的突变,这些对茚虫威抗性机制的研究基本都是基于抗性种群和敏感种群开展的,需要进一步验证其对抗性研究的贡献度。针对我国田间害虫种群对茚虫威的抗性现状,及时实施对茚虫威有效的抗性治理是迫切的。对于茚虫威的抗性治理除了传统的杀虫药剂轮用、混用外,需要利用其作用机制特点开展抗性治理策略研究。一是充分利用其活化代谢的特点,开展组合药剂的研究应用;二是菊酯类药剂和茚虫威的作用机制均与钠离子通道有关,但是前者是使钠离子通道关闭延迟,而后者是阻断钠离子通道,开展相关基础研究,使菊酯类药剂与茚虫威合理地用于抗性治理中。本文综述了茚虫威的抗性现状、抗性机制与交互抗性、茚虫威的抗性风险评价,针对茚虫威的抗性特点提出了抗性治理策略。
胡波[5]（2019）在《甜菜夜蛾细胞色素P450和谷胱甘肽-S-转移酶基因的转录调控机制》文中研究表明细胞色素P450和谷胱甘肽-S转移酶具有代谢不同结构杀虫剂的能力,由P450和GST介导的代谢抗性在昆虫对各类杀虫剂抗性中普遍存在。前期的解毒酶活性测定和增效剂生物测定表明甜菜夜蛾对多种杀虫剂的抗性与P450以及GST解毒能力增强有关。但抗性品系中代谢抗性的分子机理仍不清楚,是哪些解毒基因介导了杀虫剂抗性及这些基因上调表达的调控机制也是未解之谜。本研究试图挖掘出甜菜夜蛾涉及抗药性的P450基因与GST基因,并进一步解析抗药性相关基因组成型高表达与诱导表达的调控机理。研究结果将增进人们对害虫抗药性机制的理解,为研究开发抗药性治理新技术提供新的理论指导。在本研究中,我们通过基因信息分析与克隆确定了甜菜夜蛾P450和GST的基因家族,分析了这些基因在杀虫剂胁迫下的诱导表达规律,并进一步揭示了解毒酶共诱导表达上调的调控机制;通过比较抗性种群与敏感种群间解毒基因的表达差异,找出在抗性种群中组成型高表达的P450基因,对其中表达水平最高的4种P450基因通过构建转基因果蝇进行了抗药性功能验证,并进一步通过真核表达分析其对杀虫剂的代谢活性,对其中2个P450基因的组成型上调表达机制开展了深入的研究,揭示了 P450基因在转录水平上多因素调控机理,具体结果如下:1、多数甜菜夜蛾P450基因能被杀虫剂所诱导通过克隆得到了甜菜夜蛾的68个P450基因,这些基因分属于25个家族、40个亚家族。系统进化分析显示甜菜夜蛾P450家族中属CYP2 clan和线粒体clan的成员较少,而属CYP3 clan和CYP4 clan的基因成员数量较多。同时,分析了杀虫剂处理后的基因表达响应,茚虫威、氰氟虫腙、氯虫苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯和阿维菌素分别处理甜菜夜蛾脂肪体细胞后,有50个P450基因至少对其中某一种杀虫剂的胁迫会产生表达变化的响应,其中有4个基因（CYP6AE47、CYP6AB31、CYP9A9和CYP9A10）对5种杀虫剂胁迫均有表达水平的显着上调。CYP321A8在茚虫威、氰氟虫腙、氯虫苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯诱导中显着性上调,而在阿维菌素处理后显着性下调。CYP321A9、CYP6AE10和CYP321A16对茚虫威、氰氟虫腙、氯虫苯甲酰胺、高效氯氟氰菊酯诱导有显着性上调变化,对阿维菌素胁迫下没有显着性变化。在本研究使用的5种杀虫剂中,甜菜夜蛾P450基因表达对阿维菌素胁迫的响应明显不同于对其他4种杀虫剂的响应,而对茚虫威、氰氟虫腙、氯虫苯甲酰胺和高效氯氟氰菊酯胁迫响应的模式基本类似。2、多个甜菜夜蛾P450基因参与杀虫剂抗药性由P450介导的代谢抗性机制在昆虫对各类杀虫剂抗性中普遍存在,先前的研究表明甜菜夜蛾对多种杀虫剂的抗性与P450解毒能力增强有关。在本研究中抗性种群P450酶活性是敏感种群的2.9倍。P450抑制剂PBO显着增加了抗性种群对毒死蜱的敏感性,增效8.1倍,同时增加了拟除虫菊酯类杀虫剂的敏感。定量PCR分析表明该抗性种群有21个P450基因的表达水平较敏感种群上调2倍以上（p<0.05）,这些过表达的P450主要来源于CYP6、CYP9和CYP321家族。对其中表达水平提高最多的几个P450基因与抗药性的关系,采用2种技术进行了功能验证。首先是采用UAS/GALA二元表达系统构建表达甜菜夜蛾P450基因的转基因果蝇系,对转基因果蝇的生物测定表明,分别过表达CYP321A8、CYP321A16、CYP6AE70和CYP332A1的转基因果蝇系表现出对毒死蜱、氯氰菊酯和溴氰菊酯耐受性的显着提高,说明这4个基因的过表达提高了果蝇对这3种杀虫剂的解毒能力,可导致对这些药剂的代谢抗性。其二是利用杆状病毒表达系统对CYP321A8、CYP321A16、CYP6AE70、CYP332A1和CYP321B1进行了真核表达,体外重组蛋白具有对毒死蜱、氯氰菊酯以及溴氰菊酯的代谢能力,并进一步比较分析了这5个重组蛋白对毒死蜱的代谢动力学特性,结果显示它们均对毒死蜱都有一定的代谢活性,其中以CYP321A8和CYP321B1对毒死蜱的代谢活性最强,而CYP6AE70对毒死蜱的代谢活性相对较低。综合这些研究结果,CYP321A8、CYP321A16、CYP332A1、CYP6AE70 和 CYP321B1的组成型高表达是甜菜夜蛾对毒死蜱以及氯氰菊酯和溴氰菊酯代谢抗性的重要机制。3、顺式作用元件和反式作用因子协同调控CYP321A8和CYP321B1的组成型高表达前期的研究中发现在抗性种群中过量表达的CYP321A8和CYP321B1可以使甜菜夜蛾对毒死蜱、氯氰菊酯以及溴氰菊酯产生抗药性,然而其过量表达的调控机制尚不清楚。我们克隆了 CYP321A8和CYP321B1的上游启动子序列,并发现在这两个上游序列上存在多个转录因子结合位点。进一步分析相关转录因子在抗敏种群中的相对表达水平,结果显示抗性种群中的CncC和Maf mRNA水平分别上调5.2倍和2.8倍。荧光报告试验证实过表达的CncC和Maf可以调控CYP321A8和CYP321B1在抗性种群中的组成型高表达,同时也发现CYP321A8上游序列存在近端和远端两个有效的CncC/Maf结合位点,CYP321B1仅近端结合位点起作用。同时我们比较了抗性和敏感种群间CYP321A8和CYP321B1基因上游调控序列的差异,发现CYP321A8和CYP321B1的上游启动子区均存在多处碱基差异。荧光报告活性分析显示来自抗性种群的CYP321A8与CYP321B1上游序列启动子活性分别是敏感种群的10.4倍与1.95倍,说明抗性种群中启动子高活性也是CYP321A8和CYP321B1高表达的原因。我们还对造成抗性/敏感启动子活性差异的序列区段进行了定位,CYP321A8的启动子活性差异序列定位在-385～-142之间,CYP321B1在-258～-210之间。对该区间的碱基序列突变后再进行荧光报告活性分析,结果显示-385～-142之间M5处点突变是导致抗性CYP321A8启动子具有高活性的原因,进一步的预测发现M5处的突变位于转录因子Knirps顺式元件中,将Knirps与报告质粒共转染证明Knirps可显着上调抗性质粒P（-385/-1）-R的荧光活性,而对敏感质粒P（-385/-1）-S荧光活性没有显着性影响。这些结果表明抗性种群中CYP321A8的启动子区产生了招募转录因子Knirps的突变（M5处）,增强了 CYP321A8在抗性品系中的过表达,而敏感种群不能招募该因子,所以表达水平低。同样对CYP321B1启动子的-258～-210区间转录活性进行了比较分析,证明M2处的突变是导致抗性种群CYP321B1启动子高活性的原因。最后通过报告质粒与转录因子的共转染揭示顺式元件和反式作用因子的协同调控才是CYP321A8与CYP321B1基因在抗性种群中高表达的内在原因。4、杀虫剂通过ROS激活的CncC/Maf途径诱导GST基因的共上调表达GSTs是一类广泛分布于生物体的多功能解毒酶系,参与亲电性有毒化合物的解毒。尽管不同类型的杀虫剂诱导多个GST基因共上调表达的报道很多,但是其潜在的调控机制尚不清楚。本研究中克隆鉴定了甜菜夜蛾的31个GST基因,通过定量PCR分析了这些GST基因在甜菜夜蛾幼虫中的组织表达模式以及在杀虫剂诱导下的基因表达模式。在高效氯氟氰菊酯、毒死蜱和氯虫苯甲酰胺的胁迫下有7个GST 基因（SeGSTe9、SeGSTs6、SeGSTe1、SeGSTe6、SeGSTe8、SeGSTe14 和 SeGSTd1）均显着上调表达,暗示不同杀虫剂可能会通过类似机理介导同一 GST基因的上调表达,以及不同GST基因可通过类似机理被同一药剂所诱导。通过基因组步移的方法克隆到这7个GST基因上游约1500 bp长的启动子序列,对这些上游序列进行转录因子结合位点的预测分析发现这7个GST基因上游序列均含有CncC/Maf结合位点。进一步通过荧光报告质粒分析该位点介导的转录是否受杀虫剂胁迫的影响,将pGL3-SeGST启动子质粒转染到Sf9细胞后,杀虫剂处理能使荧光活性显着增加,将该启动子区的CncC/Maf结合位点突变后,杀虫剂处理的诱导效果显着下降。这些结果表明甜菜夜蛾利用CncC/Maf途径来响应不同杀虫剂胁迫,并诱导GST基因的表达。杀虫剂处理后细胞内活性氧显着升高,活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理可以降低杀虫剂对报告质粒pGL3-SeGST的荧光诱导活性,但不能降低杀虫剂对CncC/Maf结合位点突变体的诱导效应,说明活性氧通过CncC/Maf介导杀虫剂胁迫,从而影响GST基因的表达。以上结果表明不同类型杀虫剂可以通过ROS激活的CncC/Maf途径诱导GST基因的共上调表达。
左亚运[6]（2019）在《甜菜夜蛾对甲维盐和双酰胺类杀虫剂抗性机理的研究》文中研究表明甜菜夜蛾Spodoptera exigua（Hubner）是一种世界性的重要农业害虫,其间歇性暴发成灾的特性导致化学防治成为控制甜菜夜蛾危害的主要手段。由于甜菜夜蛾对传统的有机磷类、氨基甲酸酯类和拟除虫菊酯类杀虫剂产生了严重的抗性,甲维盐和氯虫苯甲酰胺等新型杀虫剂成为防控甜菜夜蛾的主要药剂。由于甲维盐和氯虫苯甲酰胺的广泛和大量使用,我国部分地区甜菜夜蛾种群已对甲维盐和氯虫苯甲酰胺产生了高水平抗性,但甜菜夜蛾对甲维盐和氯虫苯甲酰胺的抗性机理尚不清楚。甜菜夜蛾WH-EB品系对甲维盐的抗性为244倍,且抗性为显性遗传。本研究旨在通过遗传定位,找出甜菜夜蛾WH-EB品系对甲维盐的抗性基因,以明确该品系显性抗性的分子遗传机理。同时,通过建立近等基因系和定点突变,研究甜菜夜蛾RyR突变与双酰胺类杀虫剂的关系。这些结果有助于改进甜菜夜蛾的抗性治理策略,制定适当的抗性管理措施,以延缓甜菜夜蛾对甲维盐和氯虫苯甲酰胺的抗性进化。1.甜菜夜蛾P-糖蛋白基因敲除对阿维菌素和甲维盐敏感性的影响P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）在癌细胞的多重耐药性中起到重要的参与作用,也有研究发现昆虫P-gp基因过量表达与阿维菌素抗性相关。本研究克隆了编码甜菜夜蛾P-gp蛋白的一个基因（SeP-gp）,氨基酸序列同源比对结果显示SeP-gp和其他昆虫ABCB1转运蛋白具有共同的结构特征。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得了缺失4个核苷酸的SeP-gp敲除品系。生测结果表明,甜菜夜蛾SeP-gp敲除品系对阿维菌素和甲维盐的敏感性显着增加（～3倍）,但对其它10种化学杀虫剂（多杀菌素、溴虫氰、高效氯氰菊酯、丁硫克百威、茚虫威、毒死蜱、辛硫磷、丁醚脲、氟啶脲、氯虫苯甲酰胺）和2种Bt毒素（Cry1Ca和Cry1Fa）的敏感性无明显变化。上述结果表明甜菜夜蛾SeP-gp可能通过逆向转运作用降低靶标细胞内阿维菌素和甲维盐的浓度来提高幼虫的耐药性,并暗示该基因过量表达可能导甜菜夜蛾对阿维菌素和甲维盐产生抗性。2.甜菜夜蛾WH-EB品系甲维盐抗性基因的图位克隆及活体功能验证本研究采用遗传定位策略对甜菜夜蛾WH-EB品系甲维盐抗性基因进行图位克隆。根据鳞翅目昆虫基因组具有同线性（synteny）的特性,采用特定基因外显子单核苷酸多态性（SNP）或内含子插入缺失标记（Indel）对甜菜夜蛾的31条染色体进行标记,并将抗性基因定位于29号染色体上（Chr29）;然后,在Chr29上进一步开发分子标记,将抗性基因定位于Chr29上0-2.5 Mbp区间。在该定位区域内存在与杀虫剂解毒功能相关的CYP9A基因簇,据此推测甜菜夜蛾WH-EB品系对甲维盐的显性抗性可能与CYP9A基因簇中一个或多个P450基因点突变或表达上调有关。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术将甜菜夜蛾WH-EB抗性品系CYP9A基因簇（～130 kb）完全敲除,发现CYP9A基因簇缺失品系恢复了对甲维盐的敏感性,从而证实了甲维盐抗性基因位于CYP9A基因簇中。通过CYP9A基因簇内大片段敲除和P450基因序列比对,发现WH-EB抗性品系CYP9A58在底物结合部位SRS1区的116F氨基酸残基突变成116V可能与抗性有关。将WH-EB抗性品系CYP9A58基因完全敲除后,恢复了对甲维盐的敏感性,从而明确CYP9A58基因F116V突变是导致甜菜夜蛾WH-EB品系对甲维盐产生高水平抗性的遗传基础。3.CYP9A58氨基酸F116V突变对甲维盐和阿维菌素代谢能力的影响以及其在田间种群突变频率的检测为了明确CYP9A58氨基酸F116V突变对甲维盐解毒代谢的影响以及其在田间种群突变频率与甲维盐抗性的关系。本研究用昆虫细胞杆状病毒表达系统对甜菜夜蛾CYP9A58野生型等位基因（116F）和突变型等位基因（116V）分别进行了体外表达,测定其对甲维盐和阿维菌素的代谢能力,并于2018年从山东、河南、福建和上海4个省市采集了 5个甜菜夜蛾田间种群,对其进行了生物测定和F116V基因突变频率检测。结果表明,来自抗性品系的CYP9A58突变型（116V）对甲维盐和阿维菌素具有较强的代谢能力,而来自敏感品系的CYP9A58野生型对甲维盐和阿维菌素没有代谢能力。通过质谱进一步鉴定其代谢产物,发现CYP9A58突变型在代谢甲维盐和阿维菌素的过程中产生了羟基-和O-脱氧甲基化代谢产物。生测结果表明,5个地区的甜菜夜蛾种群均已对甲维盐产生了高水平抗性（212-388倍）,F116V的突变频率为80.36%-96.67%,其中上海QP种群的抗性水平及F116V突变频率均为最高,河南LY种群的抗性水平和F116V突变频率均为最低,不同种群的甲维盐抗性水平与抗性等位基因频率有显着的相关性（R2=0.9794）。离体功能表达结果进一步证实,甜菜夜蛾WH-EB品系CYP9A58通过F116V点突变获得对甲维盐和阿维菌素的解毒代谢能力,从而对甲维盐和阿维菌素产生抗性。田间种群突变频率与甲维盐抗性的关系表明,可以依据CYP9A58氨基酸F1 16V突变频率预测甜菜夜蛾田间种群甲维盐抗性水平,为快速、精准选药提供科学依据。4.甜菜夜蛾鱼尼丁受体氨基酸点突变对双酰胺类杀虫剂抗性的影响双酰胺类杀虫剂是一类以昆虫鱼尼丁受体（RyR）为靶点的新型化合物。已在小菜蛾Plutella xylostella、二化螟 Chilo suppressalis 和番茄潜麦蛾 Tuta absoluta中发现RyR的C-端跨膜区G4946E和I4790M位点突变（按小菜蛾PxRyR氨基酸序列编号）导致对双酰胺类杀虫剂产生靶标抗性。在2018年采自山东潍坊的甜菜夜蛾田间品系（WF）中发现了与双酰胺类杀虫剂抗性相关的鱼尼丁受体I4743M突变（对应于PxRyR的I4790M）,但并未发现G4900E突变（对应于PxRyR的G4946E）。为了明确甜菜夜蛾鱼尼丁受体I4743M突变对双酰胺类杀虫剂的影响,通过与敏感品系杂交和分子标记辅助选择,将WF品系的I4743M等位基因导入WH-S敏感品系遗传背景中,建立纯合的I4743M突变品系（命名为4743M）。甜菜夜蛾4743M品系的遗传背景与WH-S品系为一对近等基因系,具有约94%的遗传相似性。4743M品系对氯虫苯甲酰胺（21倍）、溴氰虫酰胺（25倍）和氟虫双酰胺（22倍）的抗性处于中等水平,说明I4743M突变本身对这3种双酰胺类杀虫剂的抗性约为20倍。为了明确甜菜夜蛾鱼尼丁受体G4900E突变（对应于PxRyR的G4946E）对双酰胺类杀虫剂抗性的影响,通过CRISPR/Cas9技术将与G4900E突变成功敲入WH-S敏感品系中,建立的G4900E突变纯合品系命名为4946E。4946E品系与野生型WH-S品系相比,分别对氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺、氟虫双酰胺具有223-,336-和>1000-倍的抗性。抗性遗传分析表明,甜菜夜蛾4743M品系和4946E品系对双酰胺类杀虫剂抗性为常染色体、隐性遗传。本研究明确了甜菜夜蛾鱼尼丁受体I4743M突变（田间已发生的,导致中等水平抗性）和G4900E突变（未来可能发生的,导致高水平抗性）对双酰胺类杀虫剂抗性的不同影响,对于开发抗性分子检测技术和制订适应性的抗性治理策略具有重要意义。
黄河[7]（2019）在《甜菜夜蛾GST和UGT与杀虫剂抗性的关系》文中指出解毒代谢能力增强是导致害虫对杀虫剂产生抗性的重要机制,这种解毒能力的提高往往是因为Ⅰ相代谢酶与Ⅱ相代谢酶活性升高的结果。Ⅰ相代谢酶,如多功能氧化酶,在害虫代谢抗性中的作用已有很多的研究报道,但Ⅱ相代谢酶,如谷胱甘肽-S-转移酶（GST）与尿苷二磷酸糖基转移酶（UGT）,在害虫抗药性中所起作用的研究报道较少,尤其是在甜菜夜蛾的抗药性中Ⅱ代谢的作用尚不清楚。本研究以对多种杀虫剂均已产生高水平抗性的广东惠州甜菜夜蛾田间种群为研究对象,探讨甜菜夜蛾的GST和UGT与杀虫剂抗性的关系。首先对田间种群进行毒力测定揭示其抗药性水平,通过解毒酶活性测定与增效剂试验揭示抗药性与GST以及UGT的联系,在此基础上分析抗性种群中GST与UGT基因表达水平的差异,找到抗性种群中组成型高表达的相关基因。针对组成型高表达的GST基因进行原核表达,利用体外表达的GST酶分析其对杀虫剂的体外代谢活性,并通过HPLC方法分析对杀虫剂的降解作用。针对具有杀虫剂代谢能力并在抗性种群中高表达的GST基因,克隆其上游序列,预测分析其转录因子结合位点,并构建报告质粒,采用荧光报告质粒分析上游序列的启动子活性,以期揭示抗性种群中解毒基因组成型上调表达的调控机制。一、甜菜夜蛾谷胱甘肽-S-转移酶与杀虫剂抗性的关系采用叶片浸渍法测定了广东惠州地区甜菜夜蛾田间种群对六种常用杀虫剂的抗性水平,发现该种群对毒死蜱和氯氰菊酯的抗性倍数分别达到1155倍和931倍,属极高水平的抗药性。增效剂试验表明,谷胱甘肽-S-转移酶抑制剂DEM能明显提高毒死蜱和氯氰菊酯对抗性种群的毒力,增效倍数分别为5.5和4.1倍;比较敏感和HZ16种群间GST酶活性我们发现,HZ16种群GST酶活性是敏感种群的2.9倍,这表明GST酶活性升高在毒死蜱和氯氰菊酯抗性中起一定作用。通过定量PCR,比较HZ16和敏感种群31个SeGST基因的相对表达水平,我们发现6个GST基因（SeGSTd3,SeGSTe1,SeGSTe6,SeGSTe9,SeGSTo2 和 SeGSTs1）在 HZ16 种群中存在明显地过表达,而对于其他25个GST基因,HZ16和敏感种群之间没有显着的差异。在HZ16种群中上调表达程度最高的GST基因是SeGSTo2、SeGSTe6和SeGSTd3,分别上调109.1倍、60.7倍和34.8倍,这些上调表达的GST基因可能与毒死蜱和氯氰菊酯抗性有关。针对这3个表达上调最多的GST基因我们进行了原核表达,成功得到了纯化的GST蛋白酶。使用底物CDNB和GSH测定了这3种重组GST蛋白的动力学参数,SeGSTo2、SeGSTe6 和 SeGSTd3的最大反应速度（Vmax）分别为 1.57 μmol/min/mg、4.98 μmol/min/mg和2.77 μmol/min/mg。酶活性抑制试验显示,毒死蜱与氯氰菊酯均可抑制这3种GST酶与其底物CDNB的结合,毒死蜱对CDNB与SeGST蛋白结合的抑制率分别是GSTe6为68.0%、GSTo2为61.8%、SeGSTd3为45.8%;氯氰菊酯的抑制率是 GSTo2 为 73.7%、GSTe6为 65.5%、SeGSTd3为54.1%,这表明 SeGSTs 与杀虫剂之间存在直接相互作用。体外代谢试验显示,七种杀虫剂与重组三种GST酶孵育后,其中SeGSTd3对毒死蜱、氯氰菊酯、甲维盐、三唑磷、氯虫苯甲酰胺、茚虫威和氟铃脲的清除率分别为55.3%、37.7%、29.1%、10.1%、8.8%、1.7%和29.3%;GSTe6对以上七种杀虫剂的清除率分别为27.3%、35.4%、14.1%、5.0%、19.9%、61.1%和15.2%;GSTo2对以上七种杀虫剂的清除率分别为45.1%、33.3%、17.9%、14.5%、18.0%、3.3%和4.1%。总体来看杀虫剂与重组蛋白一起孵育后反应溶液中毒死蜱和氯氰菊酯的含量降低最为明显,而三唑磷基本上没有降低,这表明SeGSTs可以代谢毒死蜱和氯氰菊酯等杀虫剂,从而参与杀虫剂抗性的产生。我们通过基因组步移克隆了SeGSTd3、SeGSTe6和SeGSTo2基因的上游序列,虽然甜菜夜蛾HZ 16和敏感种群来自不同的来源并且具有不同的遗传背景,但是这两个种群之间SeGST基因的上游序列没有明显差异。使用在线工具JASPAR和ALGGEN预测和分析转录因子（TF）结合位点,我们发现SeGSTd3上游序列具有Dfd、BR-C和 CncC/Maf 的结合位点,SeGSTe6 具有 AhR/ARNT、HSF、CncC/Maf 和 PXR/RXR的结合位点,SeGSTo2的上游序列含有HSF、AhR/ARNT、BR-C和CncC/Maf结合位点。甜菜夜蛾HZ16种群的三个SeGST基因中均存在CncC/Maf的结合序列。这表明甜菜夜蛾SeGSTd3、SeGSTe6和SeGSTo2的转录可能受相同的顺式调节元件和转录因子CncC和Maf调控。通过定量PCR,我们分析了转录因子表达水平,与敏感种群相比,HZ16种群中CncC、Maf和AhR的mRNA水平显着上调,分别上调8.5倍、2.8倍和1.6倍,但ARNT、HR96、USP、Dfd、BR-C和HSF等转录因子的表达量无显着差异。因此,我们推测SeGST基因上游序列中具有结合位点的转录因子的上调表达能够增强HZ16种群中相应GST基因的转录。针对这3个GST基因的上游序列,分别构建了3个荧光报告质粒,这3个报告质粒均有一定的组成型荧光报告活性,以SeGSTe6上游序列的启动子活性最高,因此,选择SeGSTe6的上游序列开展进一步的研究。将CncC和/或Maf表达构建载体与SeGSTe6报告质粒共转染可显着增强启动子活性,说明CncC或Maf的上调表达可增强其上游靶标基因的转录水平。类似地,由于SeGSTe6基因的上游序列中存在AhR/ARNT结合位点,AhR和/或ARNT的表达构建体与该报告质粒共转染也明显增加荧光报告活性。分别将这2个位点突变后,CncC/Maf或AhR/ARNT表达构建体与突变报告质粒的共转染不再增加转录的活性,说明这2个转录因子的结合位点在该基因的转录中起重要作用。由于HZ16种群SeGSTd3、SeGSTe6和SeGSTo2基因上游序列与敏感种群的序列没有明显差异,而转录因子CncC、Maf以及AhR在HZ16种群中却组成型的过表达,这些转录因子的上调表达造成相关靶基因的组成型上调表达,包括多个GST基因的上调表达,这可能就是多种GST基因上调表达,并导致抗药性的分子机制。二、甜菜夜蛾尿苷二磷酸糖基转移酶对毒死蜱敏感性的影响我们已经发现广东惠州地区甜菜夜蛾田间种群对毒死蜱产生了极高水平的抗药性。抗性种群不仅具有较高的GST酶活性,还具有显着高于敏感种群的UGT酶活性,抗性幼虫UGT酶活性是敏感品系的3倍。利用实时荧光定量PCR技术对抗性与敏感幼虫的32个UGT基因表达水平进行了比较分析,我们发现32个UGT基因中有17个UGT基因在抗性种群中表达上调3倍以上,并且与敏感种群表达水平有显着差异,其中UGT33J3上调表达最高（42倍）,其次是UGT33F7（37倍）和UGT33F5（34倍）,这说明抗性种群的抗药性可能与UGT基因上调表达有关。利用UGT表达诱导物（苯巴比妥）处理抗性幼虫,我们发现单独使用苯巴比妥和毒死蜱均能够提高UGT33F5、UGT33F7、UGT33J3三个基因的表达水平,其中UGT33F5最为明显,但苯巴比妥与毒死蜱联合使用并未使基因表达水平进一步上调;同时UGT基因在外源物苯巴比妥处理24 h后,抗性种群幼虫的UGT酶活性明显增加,用毒死蜱（LC30）处理幼虫也产生类似于苯巴比妥的诱导效果,而毒死蜱与苯巴比妥联合处理后UGT酶活性又进一步显着增加,这说明UGT酶活性的增加应是UGT基因的上调表达所致。当用苯巴比妥与毒死蜱的LC50浓度联合处理时,相对于对照,敏感种群和抗性种群的死亡率分别下降了 36.6%和23.3%,这说明UGT的上调表达增加了受胁迫幼虫对毒死蜱的解毒代谢能力。采用UGT抑制剂可抑制幼虫的UGT酶活性,5-硝基脲嘧啶与苯磺唑酮对甜菜夜蛾幼虫UGT酶活性的抑制中浓度分别为348.7 μM/L和489.8 μM/L,这2种抑制剂可用于抑制甜菜夜蛾的UGT酶活性。当用2个品系的毒死蜱LC50浓度分别处理抗性与敏感幼虫时,死亡率是46.7%,当与UGT酶抑制剂5-硝基脲嘧啶或苯磺唑酮联合处理甜菜夜蛾幼虫时,敏感品系幼虫的死亡率分别升高到73.3%与83.3%,2种抑制剂分别提高毒死蜱的毒力57%和78%;抗性幼虫的死亡率分别升高到76.6%与67.7%,分别提高毒死蜱毒力64%与45%,均显着地高于毒死蜱单用时产生的死亡率,说明抗性与敏感种群中UGT酶活抑制剂均能显着地提高毒死蜱的毒力。综上所述,甜菜夜蛾体内的Ⅱ相解毒代谢酶GST与UGT均在杀虫剂抗性中发挥着一定的作用,增加了人们对甜菜夜蛾抗药性机制的理解,将有助于甜菜夜蛾抗药性治理,为探索抗性治理技术提供理论指导。
胡松竹[8]（2019）在《索法酮对解毒基因表达影响以及对杀虫剂的增效作用》文中认为害虫抗药性是目前生产上害虫防治面临的严峻问题,抗药性的出现严重影响了农业生产的稳定与农产品安全。通常在害虫对农药产生抗药性后只好停用该药剂,用新型药剂取代,但随着研发成本的提高以及新药安全性要求提高,农药新产品的创制越发困难,对抗性害虫的治理需要有新思维与新技术。在本实验室研究中发现甜菜夜蛾对多种药剂的多药抗性与代谢抗性有密切关系,造成代谢抗性的主要原因是多种解毒酶在抗性种群中的表达上调,并且在这些表达上调的解毒酶基因中,有许多受到转录因子CncC的调控。医学上癌细胞化疗的研究表明癌细胞耐药性提高影响了化疗效果就与解毒基因表达上调有关,可通过对CncC（哺乳动物HNF2直系基因）进行负调控抑制解毒基因的表达,从而提高化疗效果。基于这些研究背景,本研究开展了针对CncC的抑制剂筛选,分析了抑制剂对甜菜夜蛾解毒基因表达以及解毒酶活性的影响,发现索法酮对杀虫剂有显着增效作用,可以用于甜菜夜蛾抗性治理,具体研究结果如下:首先,采用含有CncC结合位点的荧光报告质粒,对13种查尔酮系列物以及常山酮等化合物对该报告质粒荧光活性的影响进行了测定,发现单独使用索法酮不可抑制该报告质粒的荧光活性,但是索法酮可抑制毒死蜱与高效氯氟氰菊酯对荧光报告活性的诱导作用。在前述细胞水平试验的基础上,进一步采用甜菜夜蛾幼虫进行测定,毒死蜱与高效氯氟氰菊酯处理可显着提高甜菜夜蛾幼虫体内P450、酯酶与GST酶的活性,而索法酮又可抑制这2种杀虫剂对这些解毒酶活性的诱导效应。然后,通过荧光定量PCR,分析了甜菜夜蛾幼虫在毒死蜱和高效氯氟氰菊酯胁迫下各类解毒酶基因表达水平的变化,以及索法酮抑制药剂胁迫下解毒基因诱导表达的效果。索法酮可抑制毒死蜱与高效氯氟氰菊酯对6个P450基因（CYP321A8、CYP321A9、CYP321A16、CYP321B1、CYP9A11、CYP9A27）、4 个 GST 基因（GSTe2、GSTe6、GSTe14、GSTo2）、2个酯酶基因（CXE1、CXE5）以及ABCB2的诱导表达,使这些基因的表达水平下降。同时还分析了索法酮对转录因子CncC与Maf表达水平的影响,与解毒酶基因一样,2种杀虫剂可诱导这2个基因显着上调表达,索法酮则可抑制这种诱导效应。因为,CncC/Maf介导抗氧化信号途径,本研究还探讨了索法酮为上述解毒基因诱导表达的影响是否与活性氧水平变化有关,测定发现毒死蜱与高效氯氟氰菊酯可使甜菜夜蛾体内活性氧水平显着提高,而索法酮则可显着地抑制杀虫剂对活性氧的诱导作用,使活性氧水平下降,说明索法酮对解毒基因在药剂胁迫下诱导表达的影响与活性氧有关,并且索法酮对基因诱导表达的抑制是通过CncC/Maf这一信号途径。最后,通过生物测定,证实索法酮可显着提高毒死蜱与高效氯氟氰菊酯对甜菜夜蛾抗性种群的毒力,具有显着增效作用,增效倍数分别为3.5倍与3.9倍,但是也发现索法酮不能显着提高氯虫苯甲酰胺对甜菜夜蛾抗性种群的毒力。这些研究结果表明,害虫的代谢抗性可以通过在转录水平的负调控来进行治理,本研究为抗性治理提出了新的理论与技术途径,索法酮通过对解毒酶基因表达的负调控可作为杀虫增效剂用于害虫抗性治理。
赵思琪[9]（2019）在《水稻二化螟的抗药性监测及对氯虫苯甲酰胺的抗性遗传特性》文中认为二化螟Chilo suppressalis（Walker）属鳞翅目螟蛾科（Lepidoptera:Pyrlidae）,其钻蛀危害水稻、茭白等寄主植物,是田间发生最为严重的害虫之一。长期以来,二化螟的防治主要依靠化学药剂,包括沙蚕毒素类杀虫剂杀虫单,有机磷类杀虫剂毒死蜱和三唑磷、大环内酯类杀虫剂阿维菌素和甲维盐,双酰胺类杀虫剂氯虫苯甲酰胺、微生物源类杀虫剂乙基多杀菌素及双酰肼类杀虫剂甲氧虫酰肼等及其混剂。但由于化学农药长期或不合理的使用,各地不断出现二化螟产生抗药性以及多种常用药剂防治效果下降的报道。为了明确二化螟种群对田间常用药剂的抗性动态,指导田间二化螟的有效防控,我们监测了七省二化螟田间种群对8种常用杀虫剂的抗性,以室内敏感品系和高抗氯虫苯甲酰胺的二化螟田间种群为研究对象,研究了二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性遗传特性,以期对制定合理的二化螟化学防治方案提供帮助。1、二化螟对8种药剂的抗性监测2017-2018年采用稻苗浸渍法监测了 7省38个田间种群对氯虫苯甲酰胺、甲氧虫酰肼及乙基多杀菌素的抗性。对氯虫苯甲酰胺,2017年湖南桃江、浙江苍南、象山、余姚及江西都昌5个二化螟田间种群表现为高水平抗性（102.9-236.5倍）,占监测种群的25.0%,其中湖南桃江种群抗性倍数最高（236.5倍）,湖南衡南、衡阳、攸县,浙江瑞安以及江西上高、南城6个种群表现为中等水平抗性（12.9-54.9倍）,占监测种群的30%,其余9个种群表现敏感至低水平抗性（2.3-9.6倍）;2018年监测的18个种群中,对氯虫苯甲酰胺表现高水平抗性（101.3-511.6倍）的种群上升到50%,中等水平抗性种群为16.7%,其余33.3%的种群对氯虫苯甲酰胺表现为敏感至低水平抗性,与2017年相比,二化螟田间种群对氯虫苯甲酰胺的抗性明显上升。甲氧虫酰肼的监测结果显示:2017年监测的10个田间种群中,90%的监测种群对甲氧虫酰肼表现为敏感至低水平抗性,抗性倍数在1.0-7.9倍之间;到2018年,敏感至低水平抗性种群只占到监测种群的25%,50%的监测种群表现为中等水平抗性（11.9-65.0倍）,而浙江瑞安和余姚两种群达到高水平抗性（188.2和201.9倍）,表明二化螟对甲氧虫酰肼抗性上升迅速。2017年监测的湖南衡南、桃江种群,安徽潜山种群、江苏仪征种群对乙基多杀菌素全部表现为敏感至低水平抗性（1.2-6.1倍）;2018年,表现敏感至低水平抗性的种群占监测种群的83.3%,浙江象山种群和安徽潜山种群监测到中等水平抗性,抗性倍数分别为17.5倍和13.7倍,表明二化螟对乙基多杀菌素的抗性处于上升趋势。2017-2018年我们使用毛细管点滴法监测了 7省32个田间种群对阿维菌素、甲维盐、毒死蜱、杀虫单、三唑磷的抗性。2017年监测的18个种群中,对阿维菌素表现敏感至低水平抗性的种群占监测种群的72.2%,抗性倍数在0.6-9.8倍之间;到2018年,二化螟田间种群对阿维菌素的抗性突升,表现敏感至低水平抗性的种群仅占监测种群的28.6%,中等水平抗性种群占35.7%,湖南攸县,浙江苍南、瑞安、象山,江西南昌种群达到高水平抗性（101.3-307.3倍）。对甲维盐,2017年监测的15个田间种群全部表现敏感至低水平抗性（0.6-10.0倍）;到2018年,二化螟种群对甲维盐抗性明显上升,仅有38.5%的种群表现敏感至低水平抗性（2.0-9.6倍）,中等水平抗性的种群已达53.8%,其中,浙江苍南种群对甲维盐已产生了 51.2倍的抗性。二化螟监测种群对毒死蜱的抗性倍数在2.0-63.8倍之间,对三唑磷的抗性倍数在3.0-223.4倍之间,监测结果显示:由于个别高抗地区对上述两种药剂的再次使用,二化螟对三唑磷的抗性迅速回升。二化螟田间种群对杀虫单抗性水平较往年仍保持稳定,抗性倍数在0.8-11.4倍之间。二化螟的抗药性呈现出明显的地域性差异。既二化螟对各类药剂表现为高水平抗性的种群主要集中在浙江、江西以及湖南三省;湖北、安徽省部分地区出现中等水平抗性种群;而江苏、四川省内各二化螟田间种群对各类药剂则表现相对敏感。2、二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性遗传特性以浙江余姚田间高抗种群（RR）和室内敏感种群（SS）为试虫,通过正交、反交、回交、自交试验,分析该田间高抗种群对氯虫苯甲酰胺的遗传特性。试验结果显示:该种群对氯虫苯甲酰胺的抗性是由位于常染色体上的不完全隐性（正、反交D值分别为-0.148和-0.127）基因控制的遗传,同时F1与抗性亲本回交或自交后代的氯虫苯甲酰胺LD-p曲线与单个主基因控制假设明显不符,表明该种群对氯虫苯甲酰胺的抗性不是由单个主基因控制,而是由两个或两个以上基因控制的。
赵钧[10]（2018）在《二化螟对氯虫苯甲酰胺的代谢抗性分子机制研究》文中研究说明二化螟 Chilo suppressalis（Walker）属于鳞翅目 Lepidoptera 螟蛾科 Pyralidae,是一种重要农业害虫。主要危害以水稻为代表的禾本科作物,对亚洲大多数地区的水稻种植造成严重的产量损失。自从上世纪70年代以来,伴随着我国水稻耕作制度的改革,尤其是杂交稻的大范围普及,使二化螟种群出现上升趋势,为害情况日趋严重。二化螟的防治主要依赖于化学农药。然而,化学防治的广泛应用导致二化螟对越来越多的杀虫剂产生了抗性,严重影响了对二化螟的防治效果。氯虫苯甲酰胺作为一种新型的双酰胺类杀虫剂,作用于鱼尼丁受体,由于其高效低毒的特性,被广泛地用于鳞翅目害虫控制。但问世不足十年,其抗药性风险在小菜蛾和二化螟上已经初见端倪。尽管如此,在世界范围内,氯虫苯甲酰胺仍然是防治二化螟和其它鳞翅目害虫的重要杀虫剂。为了更好地使用这个新型的杀虫剂和延长其服务期限,弄清其抗性的深层机制成为当务之急。二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性已有一些研究报道,发现了类似小菜蛾的靶标突变,但频率较低,与其抗性水平不尽一致,推测还有代谢抗性机制参与。为此,本研究首先检测了二化螟的三大解毒酶,同时对可能参与抗性的次级解毒代谢酶和细胞分泌排毒的相关蛋白也进行了研究。先后在组学水平克隆验证了二化螟的UDP-糖基转移酶基因家族和ABC转运蛋白基因家族,比较测定了二化螟细胞色素P450氧化酶（P450）、酯酶、谷胱甘肽S-转移酶、UDP-糖基转移酶（UGT）和ABC转运蛋白家族不同基因在抗感品系体内的表达水平,确定了可能的抗性相关基因,并对部分基因进行了抗药性功能验证,筛选出20个与二化螟抗氯虫苯甲酰胺有关的基因,证实了UDP-糖基转移酶在抗性中的作用,揭示了二化螟对氯虫苯甲酰胺的代谢抗性分子机制,为建立合理的抗性治理策略提供了理论基础。现将具体研究结果总结如下:1.P450、酯酶和谷胱甘肽转移酶与二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性的关系为了明确二化螟三大解毒代谢酶在对氯虫苯甲酰胺抗性中的贡献,本研究在田间采集对氯虫苯甲酰胺具有较高抗性的试虫,并以此为初始种群,于实验室内利用氯虫苯甲酰胺进行继代抗性筛选,以得到氯虫苯甲酰胺高抗品系;同时利用活体增效试验分别测定不同增效剂在二化螟抗性和敏感品系中对氯虫苯甲酰胺的增效作用;并对不同品系中的三大解毒酶活力进行比较测定。结果发现:经过室内抗性筛选田间种群初孵幼虫和四龄幼虫的抗性分别由55.03和51.24倍上升到了 91.80倍和74.06倍,从而获得了二化螟对氯虫苯甲酰胺高抗品系YYR;增效试验发现,PBO、TPP和DEM在高抗品系YYR中的增效比分别为3.57、1.89和1.58,而在敏感品系S中的增效比则分别是1.81、1.59和1.29,统计分析显示,仅有PBO在高抗品系中的增效显着;对抗、感品系进行酶活力测试的结果显示,YYR品系的P450、酯酶和谷胱甘肽S-转移酶活力分别是敏感品系S的3.87、2.19和1.47倍,统计分析显示P450和酯酶在高抗品系中的活力显着高于敏感品系。综上所述,活体增效实验和解毒酶活力测定结果均一致证实,P450在二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性中具有重要作用,酯酶可能具有一定作用,而谷胱甘肽S-转移酶的作用则不显着。2.二化螟不同P450基因与氯虫苯甲酰胺抗性的关系为了明确二化螟不同P450基因在抗、感品系中的转录水平差异,探究其在氯虫苯甲酰胺抗性中的贡献。本研究利用实时荧光定量PCR方法测定了 69个二化螟P450基因在氯虫苯甲酰胺高抗品系YYR和敏感品系中的相对表达量。结果显示,在二化螟抗性品系中,69个P450基因均有不同程度的表达变化,其中相对于敏感品系表达倍数（RER）大于2且差异显着（p值小于0.05）的过表达基因共有14个,其中10个基因 RER 大于 3 倍,它们依次为:CsCYP9A68（RER=74.88;p=0.0189）、CsCYP6CV5（RER=10.58;p=0.0144）、CsCYP6CT1（RER=9.67;p=0.0001）、CsCYP6AB45（RER=8.08;p=0.0015）、CsCYP6（RER=7.09;p=0.0269）、CsCYP18A1（RER=6.79;p=0.0094）、CsCYP321F3（RER=6.63;p=0.0008）、CsCYP324A12（RER=4.48;p=0.0264）、CsCYP4AU11（RER=4.17;p=0.0068）和CsCYP341A15（RER=3.41;p=0.0177）。检测基因的组织表达分布发现,这10个基因主要分布在头部、中肠和脂肪体这三个组织内,其中基因CsCYP6CV5、CsCYP324A12和CsCYP321F3在中肠中相对表达量最高,CsCYP18A1、CsCYP6AB45、CsCYP6CT1、CsCYP6、CsCYP4A U11 和 CsCYP324A15在头部的表达量最高,只有CsCYP9A68在脂肪体中表达量最高。讨论认为,本研究发现多个P450基因在抗性品系中过表达,进一步证实了 P450解毒酶活力增强是二化螟对氯虫苯甲酰胺产生抗性的机制之一。发现的14个显着过表达基因均可能与二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性相关,但过量表达超过3倍的10个基因,作为抗性相关基因的可能性更大,具体证实还需进一步研究。3.二化螟不同酯酶基因与氯虫苯甲酰胺抗性的关系为了明确二化螟不同酯酶基因在不同品系中的转录水平差异,探究其在氯虫苯甲酰胺抗性中的贡献。本研究利用实时荧光定量PCR方法测定了 51个二化螟酯酶基因在氯虫苯甲酰胺高抗品系YYR和敏感品系中的相对表达量。结果显示,在二化螟抗性品系中,51个酯酶基因均有不同程度的表达变化,其中相对于敏感品系表达倍数（RER）大于2且差异显着（p值小于0.05）的过表达基因共有3个,且这3个基因RER 也均大于 4,它们依次为:CsEST36（RER=20.96;p=0.0409）、CsEST46（RER=4.83;p=0.02538）和CsEST7（RER=4.51;p=0.04496）。检测基因的组织表达分布情况发现,这3个基因均分布在头部表达量最高,其中基因CsEST7和CsEST46在中肠中相对表达量次之,CsEST36在体壁中的相对表达次之。讨论认为,本研究发现3个酯酶基因在抗性品系中显着过表达,进一步证实了酯酶解毒酶活力增强也可能是二化螟对氯虫苯甲酰胺产生抗性的机制之一。4.二化螟UDP-糖基转移酶基因的鉴定及其对氯虫苯甲酰胺抗性的贡献UDP-糖基转移酶是生物体内次级解毒代谢的重要酶类,近期发现该酶也在一些害虫抗药性中发挥作用。为了明确二化螟UDP-糖基转移酶及其在氯虫苯甲酰胺抗性中的作用,本研究利用二化螟基因组数据库,搜索鉴定了二化螟不同UDP-糖基转移酶基因;利用实时荧光定量PCR方法测定了这些基因在抗性YYR品系及敏感S品系中的表达水平,确定了抗性品系中过表达的基因,并检测其组织表达分布情况。最后用RNA干扰的方法检验候选基因对抗性的贡献。结果从二化螟基因组中鉴定出24个二化螟UGT基因并通过UGT命名委员会对其进行了系统的命名。发现其中有3个基因在氯虫苯甲酰胺抗性品系YYR中显着过表达,并发现这些基因在幼虫阶段主要集中表达分布在马氏管（CsUGT40AL1和CsUGT33AG3）和脂肪体（CsUGT40AP1）。更重要的是,当用RNA干扰的方法敲减这3个基因时,发现其中两个基因CsUGT40AL1和CsUGT33AG3的敲除,不仅都能使二化螟幼虫对氯虫苯甲酰胺更加敏感,而且发现抗性种群的敏感度比敏感品系增加得更高。综上所述,本研究在组学水平鉴定了 24个二化螟UDP-糖基转移酶基因,并且证实其中两个基因 CsUGT40AL1和CsUGT33AG3参与了二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性形成。该研究成果不仅发现了二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性的新机制,提供了昆虫UDP-糖基转移酶参与杀虫剂解毒代谢和抗性形成的又一实例,同时为研究二化螟UDP-糖基转移酶基因的功能奠定了基础。5.二化螟ABC转运蛋白基因的鉴定及其与氯虫苯甲酰胺抗性的关系ABC转运蛋白是一类参与细胞解毒代谢的重要转运蛋白,为了明确二化螟ABC转运蛋白及其在氯虫苯甲酰胺抗性中的作用,本研究利用二化螟基因组数据库,搜索鉴定了二化螟不同ABC转运蛋白基因;利用实时荧光定量PCR方法测定了这些基因在抗性YYR品系及敏感S品系中的表达水平,并检测其组织表达分布情况;同时利用活体增效试验比较了 ABC转运蛋白抑制剂维拉帕米在二化螟抗性和敏感品系中对氯虫苯甲酰的增效作用。结果从二化螟基因组中鉴定出37个二化螟ABC转运蛋白基因,并根据人类基因组机构批准的超家族基因命名规则对上述基因进行了系统的命名。定量PCR测定发现,其中有5个基因在氯虫苯甲酰胺抗性品系YYR中过表达,并发现这些抗性过表达基因在幼虫阶段主要表达分布在中肠。活体增效试验显示,维拉帕米在YYR品系中的增效显着,增效比为2.72,而在S品系中增效作用不显着（增效比1.98）。综上所述,本研究在组学水平鉴定了 37个二化螟ABC转运蛋白基因,利用增效实验证实了 ABC转运蛋白在二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性中具有重要作用,并发现其中 5 个基因CsABCA3、CsABCA5、CsABCC1、CsABCC3和CsABCD2可能参与二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性形成。该研究成果不仅提供了昆虫ABC转运蛋白参与杀虫剂解毒代谢的又一实例,同时为研究二化螟ABC转运蛋白基因的功能奠定了基础。
二、小菜蛾、甜菜夜蛾的抗药性现状及治理对策（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、小菜蛾、甜菜夜蛾的抗药性现状及治理对策（论文提纲范文）
（1）蔬菜害虫治理中的农户认知、决策及药剂治理现状与对策（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 蔬菜生产及害虫发生 |
| 1.1 我国蔬菜生产发展 |
| 1.2 蔬菜害虫发生及为害 |
| 2 蔬菜害虫药剂防治 |
| 2.1 概况 |
| 2.2 存在问题 |
| 2.2.1 过度依赖农药 |
| 2.2.2 抗药性问题严重 |
| 2.2.3 蔬菜农药残留超标 |
| 2.2.4 发生农药中毒事件 |
| 3 农户认知及用药行为 |
| 3.1 概况 |
| 3.2 存在问题 |
| 3.2.1 认知不足,农药选择不当 |
| 3.2.2 农药施用剂量、方式不规范 |
| 3.2.3 任意混合配置,机械选用不当造成浪费 |
| 3.2.4 农技指导不到位,治理对策不够规范 |
| 4 研究目的及意义 |
| 第二章 农户对蔬菜害虫及其治理的认知、决策与行为 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 概念界定及理论基础 |
| 2.1.1 相关概念界定 |
| 2.1.2 相关理论基础 |
| 2.2 调查方法 |
| 2.2.1 问卷设计 |
| 2.2.2 数据来源 |
| 2.3 模型选择 |
| 2.4 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 农户对蔬菜害虫认知及用药行为描述性分析 |
| 3.1.1 农户基本特征描述 |
| 3.1.2 相关认知特征描述 |
| 3.1.3 用药行为特征描述 |
| 3.2 农户对蔬菜害虫用药行为影响因素实证分析 |
| 3.2.1 变量与样本统计 |
| 3.2.2 模型结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 两类重要蔬菜害虫药剂分析及存在问题 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 中国农药信息网数据库调研 |
| 2.2 蔬菜害虫防治药剂文献调研 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 茄科蔬菜害虫药剂分析 |
| 3.1.1 登记农药 |
| 3.1.2 文献报道有田间药效评价的药剂 |
| 3.2 十字花科蔬菜害虫药剂分析 |
| 3.2.1 登记农药 |
| 3.2.2 文献报道有田间药效评价的药剂 |
| 4 讨论 |
| 第四章 两种重要蔬菜害虫代表性防治药剂田间药效验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 供试材料 |
| 2.1.1 小青菜小菜蛾田间药效试验 |
| 2.1.2 辣椒烟粉虱田间药效试验 |
| 2.2 试验设计 |
| 2.2.1 小青菜小菜蛾田间药效试验 |
| 2.2.2 辣椒烟粉虱田间药效试验 |
| 2.3 数据处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 小青菜小菜蛾田间药效 |
| 3.2 辣椒烟粉虱田间药效 |
| 4 讨论 |
| 第五章 提升蔬菜害虫药剂治理水平的对策与建议 |
| 1 政府部门加强指导,提高菜农用药水平 |
| 2 农业农村部完善登记,国家给予政策补贴 |
| 3 建立科学的害虫管理决策系统,畅通防治信息渠道 |
| 4 重视药剂防治研究,加快绿色高效安全药剂研发 |
| 5 市场监管加大力度,规范从业人员队伍 |
| 参考文献 |
| 附录 江苏省菜农杀虫剂使用认知和行为调查问卷 |
| 致谢 |
（2）桃小食心虫对二酰胺类杀虫剂的抗性风险评估及抗性机理研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 桃小食心虫研究概况 |
| 1.1.1 桃小食心虫的生物学特性 |
| 1.1.2 桃小食心虫的危害与防治 |
| 1.2 二酰胺类杀虫剂研究概述 |
| 1.2.1 二酰胺类杀虫剂的研发及作用机理 |
| 1.2.2 二酰胺类杀虫剂的应用现状 |
| 1.3 抗药性机理研究 |
| 1.3.1 行为抗性 |
| 1.3.2 表皮穿透速率降低 |
| 1.3.3 解毒代谢酶活性增强 |
| 1.3.4 靶标敏感性下降 |
| 1.4 抗药性治理研究 |
| 1.4.1 抗性风险评估 |
| 1.4.2 交互抗性 |
| 1.4.3 抗性生理生化机制 |
| 1.4.4 杀虫剂的亚致死效应 |
| 1.5 立题依据及目的意义 |
| 第二章 桃小食心虫对二酰胺类杀虫剂的抗性风险评估 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试昆虫及饲养 |
| 2.1.2 供试药剂 |
| 2.1.3 抗性筛选及室内生物测定 |
| 2.1.4 抗性风险评估 |
| 2.1.5 数据处理 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 两种杀虫剂对桃小食心虫的抗性筛选 |
| 2.2.2 桃小食心虫对两种杀虫剂的抗性风险评估 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 交互抗性研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试昆虫及饲养 |
| 3.1.2 供试药剂 |
| 3.1.3 交互抗性测定 |
| 3.1.4 数据处理 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 桃小食心虫抗氯虫苯甲酰胺品系与其它杀虫剂的交互抗性 |
| 3.2.2 桃小食心虫抗四唑虫酰胺种群与其它杀虫剂的交互抗性 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 桃小食心虫对二酰胺类杀虫剂抗性生理生化机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试昆虫及饲养 |
| 4.1.2 供试药剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 解毒代谢酶活性测定 |
| 4.1.5 数据处理 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 氯虫苯甲酰胺处理对桃小食心虫解毒酶活性的影响 |
| 4.2.2 四唑虫酰胺处理对桃小食心虫解毒酶活性的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 氯虫苯甲酰胺亚致死剂量对桃小食心虫生物学特性的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试昆虫及饲养 |
| 5.1.2 供试药剂 |
| 5.1.3 氯虫苯甲酰胺亚致死剂量饲养桃小食心虫 |
| 5.1.4 氯虫苯甲酰胺亚致死剂量对桃小食心虫生长发育的影响 |
| 5.1.5 氯虫苯甲酰胺亚致死剂量作用下桃小食心虫种群生命表的组建 |
| 5.1.6 数据处理 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 氯虫苯甲酰胺对桃小食心虫的亚致死浓度 |
| 5.2.2 氯虫苯甲酰胺亚致死剂量对桃小食心虫发育历期和幼虫重的影响 |
| 5.2.3 氯虫苯甲酰胺亚致死剂量对桃小食心虫存活率的影响 |
| 5.2.4 氯虫苯甲酰胺亚致死剂量对桃小食心虫繁殖力及性比的影响 |
| 5.2.5 氯虫苯甲酰胺亚致死剂量对桃小食心虫种群生命表参数的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）广东蔬菜害虫综合治理研究进展（论文提纲范文）
| 1 蔬菜害虫种类及发生规律 |
| 1.1 小菜蛾 |
| 1.2 黄曲条跳甲 |
| 1.3 甜菜夜蛾和斜纹夜蛾 |
| 1.4 蓟马和斑潜蝇 |
| 1.5 烟粉虱和温室白粉虱 |
| 2 重要蔬菜害虫抗药性及其机理 |
| 2.1 小菜蛾 |
| 2.2 黄曲条跳甲 |
| 2.3 甜菜夜蛾和斜纹夜蛾 |
| 2.4 其他蔬菜害虫 |
| 3 重要蔬菜害虫综合治理技术 |
| 3.1 农业防治技术 |
| 3.2 生物防治技术 |
| 3.3 物理防治技术 |
| 3.4 化学生态调控技术 |
| 3.5 化学防治技术 |
| 4 蔬菜害虫防治技术展望 |
| 4.1 智能监测预警技术 |
| 4.2 精准施药技术 |
| 4.3 生态调控技术 |
（4）主要农业害虫对茚虫威的抗性现状及其治理策略（论文提纲范文）
| 1 主要农业害虫茚虫威的抗性现状 |
| 1.1 小菜蛾对茚虫威的抗性现状 |
| 1.2 甜菜夜蛾对茚虫威的抗性现状 |
| 1.3 斜纹夜蛾对茚虫威的抗性现状 |
| 1.4 棉铃虫对茚虫威的抗性现状 |
| 2 主要农业害虫对茚虫威的抗性机制 |
| 3 茚虫威抗性品系对其它药剂的交互抗性 |
| 4 茚虫威的抗性风险 |
| 5 对害虫采取的抗性治理策略 |
| 5.1 我国茚虫威近期抗性数据的普查 |
| 5.2 选择合适的轮用组合 |
| 5.3 充分利用活化代谢，开展药剂混用 |
| 5.4 合理选择增效剂 |
| 6 展望 |
（5）甜菜夜蛾细胞色素P450和谷胱甘肽-S-转移酶基因的转录调控机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 甜菜夜蛾的抗药性 |
| 1.1.1 甜菜夜蛾的发生与危害 |
| 1.1.2 甜菜夜蛾的化学防治与抗药性 |
| 1.2 害虫对杀虫剂抗性的机制 |
| 1.2.1 靶标抗性 |
| 1.2.2 代谢抗性 |
| 1.3 细胞色素P450 |
| 1.3.1 细胞色素P450 |
| 1.3.2 NADPH-细胞色素P450还原酶 |
| 1.3.3 昆虫细胞色素P450基因的可诱导性 |
| 1.3.4 昆虫细胞色素P450在昆虫抗药性中的作用 |
| 1.3.5 昆虫P450基因的功能验证 |
| 1.4 昆虫谷胱甘肽-S-转移酶 |
| 1.4.1 谷胱甘肽-S-转移酶的分类及一般特性 |
| 1.4.2 谷胱甘肽-S-转移酶的生化特性 |
| 1.4.3 谷胱甘肽-S-转移酶与抗药性的关系 |
| 1.5 昆虫解毒基因表达的调控机制 |
| 1.5.1 诱导表达调控机制 |
| 1.5.2 组成型高表达调控机制 |
| 1.6 本论文的研究目的和意义 |
| 第二章 甜菜夜蛾P450的克隆与表达规律 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试虫源 |
| 2.1.2 试剂与试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 样品准备与总RNA提取 |
| 2.1.5 cDNA合成 |
| 2.1.6 基因克隆 |
| 2.1.7 基因末端扩增 |
| 2.1.8 生物信息学分析 |
| 2.1.9 细胞培养与处理 |
| 2.1.10 MTT测定 |
| 2.1.11 基因表达水平分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 甜菜夜蛾P450家族基因的克隆 |
| 2.2.2 甜菜夜蛾P450超家族系统进化分析 |
| 2.2.3 甜菜夜蛾P450组织表达谱 |
| 2.2.4 杀虫剂处理对CYP450基因表达的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 P450介导甜菜夜蛾抗药性 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试虫源 |
| 3.1.2 试剂与试剂盒 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 甜菜夜蛾的生物测定 |
| 3.1.5 P450酶活性测定 |
| 3.1.6 基因表达水平分析 |
| 3.1.7 转基因果蝇的构建 |
| 3.1.8 转基因果蝇的生物测定 |
| 3.1.9 真核表达 |
| 3.1.10 还原型CO差异光谱分析 |
| 3.1.11 P450酶活性测定 |
| 3.1.12 杀虫剂的体外代谢 |
| 3.1.13 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 甜菜夜蛾的抗药性水平与生化机制 |
| 3.2.2 P450在抗性种群和敏感种群中的表达差异 |
| 3.2.3 P450过表达对果蝇杀虫剂敏感性的影响 |
| 3.2.4 P450的真核表达与杀虫剂代谢 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 甜菜夜蛾CYP321A8和CYP321B1组成型高表达的调控机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 供试虫源 |
| 4.1.2 试剂与试剂盒 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 甜菜夜蛾RNA提取 |
| 4.1.5 cDNA第一链合成 |
| 4.1.6 转录因子的克隆 |
| 4.1.7 转录因子的表达水平分析 |
| 4.1.8 上游启动子区的克隆与序列分析 |
| 4.1.9 荧光报告质粒的构建 |
| 4.1.10 突变体构建 |
| 4.1.11 转录因子过表达载体构建 |
| 4.1.12 报告质粒的细胞转染 |
| 4.1.13 报告质粒荧光活性测定 |
| 4.1.14 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 CYP321A8的转录调控机制 |
| 4.2.2 CYP321B1的转录调控机制 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 甜菜夜蛾谷胱甘肽-S-转移酶基因诱导表达的调控机制 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 供试虫源 |
| 5.1.2 试剂与试剂盒 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 甜菜夜蛾不同组织样本的收集 |
| 5.1.5 GST基因克隆 |
| 5.1.6 生物信息学分析 |
| 5.1.7 基因表达水平分析 |
| 5.1.8 昆虫细胞培养与药剂处理 |
| 5.1.9 上游启动子区的克隆与预测分析 |
| 5.1.10 荧光报告质粒构建 |
| 5.1.11 报告质粒的细胞转染 |
| 5.1.12 荧光测定 |
| 5.1.13 ROS测定 |
| 5.1.14 数据分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 甜菜夜蛾GST家族基因的克隆 |
| 5.2.2 甜菜夜蛾GST的系统进化 |
| 5.2.3 GSH结合位点和底物结合位点 |
| 5.2.4 组织特异性表达谱 |
| 5.2.5 GST家族基因对杀虫剂的响应 |
| 5.2.6 上游序列转录因子结合位点的预测 |
| 5.2.7 杀虫剂通过CncC/Maf途径调控GST基因的共表达 |
| 5.2.8 ROS介导杀虫剂对GST基因的诱导表达 |
| 5.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 创新点与尚有待解决的问题 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 攻读学位期间发表的论文 |
| 附录Ⅱ 攻读学位期间获得奖励及参加学术会议 |
| 致谢 |
（6）甜菜夜蛾对甲维盐和双酰胺类杀虫剂抗性机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 甜菜夜蛾危害及对甲维盐和氯虫苯甲酰胺抗药性概况 |
| 2 阿维菌素类杀虫剂抗性机理的研究现状 |
| 2.1 靶标抗性 |
| 2.2 代谢抗性 |
| 2.3 穿透抗性 |
| 2.4 P-gp蛋白 |
| 3 双酰胺杀虫剂抗性机理研究现状 |
| 3.1 靶标突变 |
| 3.2 其他抗性机理 |
| 4 细胞色素P450 |
| 4.1 P450的结构 |
| 4.2 细胞色素P450突变与功能的关系 |
| 5 CRISPR/Cas9系统 |
| 5.1 CRISPR/Cas9系统的简介 |
| 5.2 CRISPR/Cas9作用原理 |
| 5.3 CRISPR/Cas9基因编辑在昆虫中的应用 |
| 6 本研究的目的与意义 |
| 第二章 甜菜夜蛾P-糖蛋白基因敲除对杀虫剂敏感性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 克隆SeP-gp |
| 1.3 生物信息学分析 |
| 1.4 sgRNA的体外转录 |
| 1.5 胚胎显微注射 |
| 1.6 基因组DNA提取和突变鉴定 |
| 1.7 杀虫剂和t毒素 |
| 1.8 生物测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 SeP-gp的克隆和特性描述 |
| 2.2 CRISPR/Cas9介导的SeP-gp敲除品系 |
| 2.3 SeP-gp敲除品系对杀虫剂和Bt毒素敏感性的影响 |
| 3 讨论 |
| 第三章 甜菜夜蛾WH-EB品系甲维盐抗性基因的图位克隆及活体功能验证 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 图位克隆定位 |
| 1.3 体外转录sgRNA |
| 1.4 显微注射 |
| 1.5 品系纯化 |
| 1.6 生测测定 |
| 1.7 克隆CYP9A亚家族基因并分析其进化 |
| 2 结果 |
| 2.1 染色体定位 |
| 2.2 染色体区间定位 |
| 2.3 甜菜夜蛾CYP9A各基因的相对位置 |
| 2.4 WH-EB-dA9品系纯化及其对甲维盐和阿维菌素的敏感性 |
| 2.5 WH-EB-dA52-59品系纯化及其对甲维盐和阿维菌素的敏感性 |
| 2.6 克隆CYP9A58基因并分析WH-EB和WH-S品系之间的差异 |
| 2.7 WH-EB-A58-KO品系纯化及其对甲维盐和阿维菌素的敏感性 |
| 3 讨论 |
| 第四章 CYP9A58氨基酸F116V突变对甲维盐和阿维菌素代谢能力的影响以及其在田间种群突变频率的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试甜菜夜蛾 |
| 1.2 供试药剂 |
| 1.3 甜菜夜蛾总RNA的提取及第一链cDNA的合成 |
| 1.4 甜菜夜蛾CYP9A58表达载体及重组Bacmid的构建 |
| 1.5 Bacmid的转染与杆状病毒载体的制备 |
| 1.6 CYP9A58体外表达 |
| 1.7 甲维盐和阿维菌素的体外代谢 |
| 1.8 生物测定方法 |
| 1.9 田间种群CYP9A58 F116V突变频率检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 甜菜夜蛾CYP9A58和CPR基因的克隆与载体构建 |
| 2.2 标准曲线的建立 |
| 2.3 在High Five细胞中表达P450s |
| 2.4 CYP9A58突变型和野生型的重组蛋白对甲维盐和阿维菌素的代谢 |
| 2.5 鉴定代谢产物 |
| 2.6 甜菜夜蛾田间种群对甲维盐的抗性水平 |
| 2.7 F116V抗性等位基因频率及与甲维盐抗性水平的关系分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 甜菜夜蛾鱼尼丁受体氨基酸点突变对双酰胺类杀虫剂抗性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 昆虫品系和饲养 |
| 1.2 杀虫剂和生测 |
| 1.3 甜菜夜蛾SeRyR基因突变鉴定 |
| 1.4 田间品系14743M抗性等位基因频率检测 |
| 1.5 SeRyR I4743M突变导入WH-S品系中 |
| 1.6 利用CRISPR/Cas9技术将G4900E敲入甜菜夜WH-S品系中 |
| 1.7 4743M和4946E品系对双酰胺类杀虫剂的抗性遗传分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 田间品系对氯虫苯甲酰胺的敏感性 |
| 2.2 检测田间SeRyR突变位点并分析其突变频率 |
| 2.3 甜菜夜蛾I4743M突变对双酰胺杀虫剂敏感性的影响 |
| 2.4 4946E品系的建立与纯化 |
| 2.5 甜菜夜蛾SeRyR G4900E突变对双酰胺杀虫剂敏感性的影响 |
| 2.6 4743M品系和4946E品系对双酰胺类杀虫剂的抗性遗传分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 基金项目 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（7）甜菜夜蛾GST和UGT与杀虫剂抗性的关系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 害虫抗药性 |
| 1.2 害虫抗药性的机理 |
| 1.2.1 行为抗性 |
| 1.2.2 穿透抗性 |
| 1.2.3 靶标抗性 |
| 1.2.4 代谢抗性 |
| 1.3 昆虫解毒代谢酶 |
| 1.3.1 Ⅰ相 解毒代谢 |
| 1.3.2 Ⅱ相解毒代谢 |
| 1.4 甜菜夜蛾抗药性 |
| 1.4.1 国内外甜菜夜蛾抗性现状 |
| 1.4.2 甜菜夜蛾抗药性机制 |
| 1.4.3 甜菜夜蛾抗药性研究存在问题 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 谷胱甘肽-S-转移酶介导杀虫剂抗性及表达调控机制 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 杀虫剂毒力测定 |
| 2.1.5 基因克隆 |
| 2.1.6 SeGST基因上游启动子序列的克隆与预测 |
| 2.1.7 实时荧光定量PCR |
| 2.1.8 GST基因的原核表达与蛋白纯化 |
| 2.1.9 原核表达GSTs酶的活性测定 |
| 2.1.10 GST酶对杀虫剂的代谢活性 |
| 2.1.11 杀虫剂代谢的HPLC分析 |
| 2.1.12 荧光报告质粒构建与荧光报告活性分析 |
| 2.2 结果分析 |
| 2.2.1 增效剂DEM对抗性水平的影响 |
| 2.2.2 敏感和HZ16种群之间的GST酶活性差异 |
| 2.2.3 敏感和HZ16种群GST基因表达水平差异 |
| 2.2.4 SeGSTs的原核表达和蛋白纯化 |
| 2.2.5 GST对杀虫剂的代谢作用 |
| 2.2.6 SeGSTs转录因子结合位点的预测 |
| 2.2.7 转录因子的表达水平 |
| 2.2.8 CncC和Maf增加SeGST启动子的转录活性 |
| 2.2.9 AhR和ARNT上调SeGST启动子的转录活性 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 甜菜夜蛾尿苷二磷酸糖基转移酶对毒死蜱敏感性的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试昆虫 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 杀虫剂生物测定 |
| 3.1.5 实时荧光定量PCR |
| 3.1.6 UGT酶活性测定 |
| 3.1.7 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 甜菜夜蛾抗性种群对毒死蜱的抗性水平与UGT酶活性 |
| 3.2.2 抗性种群UGT基因的表达水平 |
| 3.2.3 甜菜夜蛾UGT基因的诱导表达 |
| 3.2.4 UGT诱导表达对毒死蜱毒力的影响 |
| 3.2.5 UGT酶抑制剂对毒死蜱毒力的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录: 攻读硕士学位期间学术论文发表情况 |
| 致谢 |
（8）索法酮对解毒基因表达影响以及对杀虫剂的增效作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1. 文献综述 |
| 1.1 害虫化学防治与抗药性 |
| 1.2 害虫抗药性机制 |
| 1.2.1 行为抗性 |
| 1.2.2 穿透抗性 |
| 1.2.3 靶标抗性 |
| 1.2.4 代谢抗性 |
| 1.3 解毒基因表达调控机制 |
| 1.3.1 哺乳动物解毒基因表达调控 |
| 1.3.2 昆虫解毒基因表达调控 |
| 1.4 害虫抗药性治理 |
| 1.5 甜菜夜蛾的危害、防治与抗药性 |
| 1.6 拟解决的科学问题以及本研究的目的意义 |
| 2. 材料与方法 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 仪器设备 |
| 2.3 供试昆虫 |
| 2.4 昆虫细胞培养 |
| 2.5 构建荧光报告质粒 |
| 2.6 细胞毒性检测 |
| 2.7 转录抑制剂的筛选 |
| 2.8 索法酮抑制杀虫剂胁迫细胞荧光水平 |
| 2.9 解毒酶活性测定 |
| 2.9.1 样品制备 |
| 2.9.2 缓冲液配制与粗酶液制备 |
| 2.9.3 总蛋白测定 |
| 2.9.4 P450酶活性测定 |
| 2.9.5 谷胱甘肽-S-转移酶活性测定 |
| 2.9.6 酯酶活性测定 |
| 2.10 基因表达水平分析 |
| 2.10.1 杀虫剂与化合物处理甜菜夜蛾 |
| 2.10.2 虫体RNA提取 |
| 2.10.3 实时荧光定量PCR |
| 2.10.3.1 引物设计 |
| 2.10.3.2 反转录 |
| 2.10.3.3 实时荧光定量PCR反应 |
| 2.11 活性氧测定 |
| 2.11.1 虫体样品制备 |
| 2.11.2 活性氧测定 |
| 2.12 室内生物测定 |
| 2.13 数据统计分析 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 转录抑制剂筛选 |
| 3.2 细胞毒性检测 |
| 3.3 索法酮抑制杀虫剂诱导的基因转录 |
| 3.4 索法酮对解毒酶活性的影响 |
| 3.5 索法酮对杀虫剂胁迫下解毒基因表达的影响 |
| 3.5.1 索法酮对杀虫剂胁迫下P450表达的影响 |
| 3.5.2 索法酮对杀虫剂胁迫下GST基因表达的影响 |
| 3.5.3 索法酮对杀虫剂胁迫下酯酶基因表达的影响 |
| 3.5.4 索法酮对杀虫剂胁迫下ABC基因表达的影响 |
| 3.5.5 索法酮对杀虫剂胁迫下UGT基因表达的影响 |
| 3.6 索法酮对杀虫剂胁迫下转录因子CncC与Maf表达的影响 |
| 3.7 索法酮对杀虫剂胁迫下活性氧水平的影响 |
| 3.8 索法酮对杀虫剂的增效作用 |
| 4. 结论与讨论 |
| 4.1 杀虫剂可诱导解毒酶基因的表达 |
| 4.2 杀虫剂对解毒酶基因的诱导表达是可被抑制的 |
| 4.3 索法酮对杀虫剂具有增效作用 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（9）水稻二化螟的抗药性监测及对氯虫苯甲酰胺的抗性遗传特性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 水稻二化螟的发生和为害 |
| 2 我国水稻二化螟抗药性研究概况 |
| 2.1 二化螟抗药性发展 |
| 2.2 二化螟的抗药性治理 |
| 3 二化螟新型防治药剂概况 |
| 3.1 氯虫苯甲酰胺 |
| 3.2 甲氧虫酰肼 |
| 3.3 多杀菌素 |
| 4 主要鳞翅目昆虫的抗药性遗传 |
| 5 本研究的目的及意义 |
| 第二章 水稻二化螟的抗药性监测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 供试药剂 |
| 1.3 生物测定方法 |
| 1.3.1 稻苗浸渍法: |
| 1.3.2 毛细管点滴法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 二化螟田间种群对氯虫苯甲酰胺的抗性 |
| 2.2 二化螟田间种群对甲氧虫酰肼的抗性 |
| 2.3 二化螟田间种群对乙基多杀菌素的抗性 |
| 2.4 二化螟田间种群对阿维菌素的抗性 |
| 2.5 二化螟田间种群对甲维盐的抗性 |
| 2.6 二化螟田间种群对毒死蜱的抗性 |
| 2.7 二化螟田间种群对三唑磷的抗性 |
| 2.8 二化螟田间种群对杀虫单的抗性 |
| 3 讨论 |
| 第三章 二化螟对氯虫苯甲酰胺的抗性遗传特性 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试昆虫 |
| 1.2 供试药剂 |
| 1.3 生物测定方法 |
| 1.4 抗性遗传分析 |
| 2 结果分析 |
| 3 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（10）二化螟对氯虫苯甲酰胺的代谢抗性分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 二化螟概况 |
| 1.1.1 二化螟发生现状及危害 |
| 1.1.2 二化螟抗药性问题严重 |
| 1.2 氯虫苯甲酰胺概况 |
| 1.2.1 氯虫苯甲酰胺与其基本性能 |
| 1.2.2 在农业生产上的应用及抗性发展状况 |
| 1.3 昆虫对杀虫剂抗性分子机理 |
| 1.3.1 昆虫的代谢抗性机制 |
| 1.3.2 昆虫细胞色素P450酶 |
| 1.3.3 昆虫酯酶 |
| 1.3.4 昆虫谷胱甘肽S-转移酶 |
| 1.3.5 昆虫UDP-葡萄糖基转移酶 |
| 1.3.6 昆虫ABC转运蛋白 |
| 1.4 二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性研究现状 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 P450、酯酶和谷胱甘肽转移酶与二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性的关系 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试虫源 |
| 1.2 供试药剂 |
| 1.3 仪器与设备 |
| 1.4 毒力测定 |
| 1.5 增效作用测定 |
| 1.6 酶活力测定 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同品系的抗性水平测定 |
| 2.2 不同品系的增效作用测定 |
| 2.3 不同品系的三种酶活力测定 |
| 3 讨论与结论 |
| 第三章 二化螟不同P450基因与氯虫苯甲酰胺抗性的关系 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试虫源 |
| 1.2 样品收集 |
| 1.3 供试药剂 |
| 1.4 仪器设备 |
| 1.5 二化螟总RNA的提取 |
| 1.6 二化螟第一链cDNA的合成 |
| 1.7 二化螟P450基因序列的获得 |
| 1.8 二化螟P450基因定量引物的设计与合成 |
| 1.9 实时荧光定量PCR实验条件 |
| 1.10 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 二化螟不同P450基因在抗、感品系中的表达量 |
| 2.2 二化螟P450基因在幼虫不同组织内的表达分布情况 |
| 3 讨论与结论 |
| 第四章 二化螟不同酯酶基因与氯虫苯甲酰胺抗性的关系 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试虫源 |
| 1.2 样品收集 |
| 1.3 供试药剂与试剂 |
| 1.4 仪器与设备 |
| 1.5 二化螟总RNA的提取 |
| 1.6 二化螟第一链cDNA的合成 |
| 1.7 二化螟酯酶基因序列的获得 |
| 1.8 二化螟酯酶基因定量引物的设计与合成 |
| 1.9 实时荧光定量PCR实验条件 |
| 1.10 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 二化螟不同酯酶基因在抗、感品系中的表达量 |
| 2.2 二化螟酯酶基因在幼虫不同组织内的表达分布情况 |
| 3 讨论与结论 |
| 第五章 二化螟UDP-糖基转移酶基因的鉴定及其对氯虫苯甲酰胺抗性的贡献 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试虫源 |
| 1.2 样品收集 |
| 1.3 供试药剂与试剂 |
| 1.4 仪器与设备 |
| 1.5 二化螟RNA的提取及cDNA的合成 |
| 1.6 二化螟UGT基因的搜索和鉴定 |
| 1.7 二化螟UGT基因的命名与进化分析 |
| 1.8 二化螟UGT基因定量引物的设计与筛选 |
| 1.9 实时荧光定量PCR实验条件 |
| 1.10 dsRNA合成及引物设计 |
| 1.11 目的基因的RNA干扰 |
| 1.12 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 二化螟UGT基因的搜索、鉴定、命名和特性分析 |
| 2.2 二化螟UDP-糖基转移酶基因的进化分析 |
| 2.3 二化螟不同UGT基因在抗、感品系中的表达量 |
| 2.4 二化螟UGT基因在幼虫不同组织内的表达分布情况 |
| 2.5 二化螟基因RNAi的时间效应 |
| 2.6 二化螟基因RNAi干扰的死亡率统计 |
| 4 讨论与结论 |
| 第六章 二化螟ABC转运蛋白基因的鉴定及其与氯虫苯甲酰胺抗性的关系 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试虫源 |
| 1.2 样品收集 |
| 1.3 供试药剂与试剂 |
| 1.4 仪器与设备 |
| 1.5 增效作用测定 |
| 1.6 二化螟RNA的提取与cDNA的合成 |
| 1.7 二化螟ABC转运蛋白基因的搜索和鉴定 |
| 1.8 二化螟ABC转运蛋白基因的进化分析 |
| 1.9 二化螟ABC转运蛋白基因定量引物的设计与筛选 |
| 1.10 实时荧光定量PCR实验条件 |
| 1.11 数据统计 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 二化螟ABC转运蛋白基因的的搜索、命名与鉴定 |
| 2.2 二化螟ABC转运蛋白基因的分类与进化分析 |
| 2.3 增效作用测定 |
| 2.4 二化螟不同ABC转运蛋白基因在抗、感性品系中的表达量 |
| 2.5 二化螟ABC转运蛋白基因在幼虫不同组织内的表达分布情况 |
| 3 讨论与结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文及参加的学术会议 |
| 致谢 |
四、小菜蛾、甜菜夜蛾的抗药性现状及治理对策（论文参考文献）
- [1]蔬菜害虫治理中的农户认知、决策及药剂治理现状与对策[D]. 周雯. 扬州大学, 2021(09)
- [2]桃小食心虫对二酰胺类杀虫剂的抗性风险评估及抗性机理研究[D]. 刘宴弟. 中国农业科学院, 2021
- [3]广东蔬菜害虫综合治理研究进展[J]. 李振宇,肖勇,冯夏. 广东农业科学, 2020(12)
- [4]主要农业害虫对茚虫威的抗性现状及其治理策略[J]. 吕楠楠,梁沛,高希武. 植物保护学报, 2020(06)
- [5]甜菜夜蛾细胞色素P450和谷胱甘肽-S-转移酶基因的转录调控机制[D]. 胡波. 南京农业大学, 2019(08)
- [6]甜菜夜蛾对甲维盐和双酰胺类杀虫剂抗性机理的研究[D]. 左亚运. 南京农业大学, 2019(08)
- [7]甜菜夜蛾GST和UGT与杀虫剂抗性的关系[D]. 黄河. 南京农业大学, 2019(08)
- [8]索法酮对解毒基因表达影响以及对杀虫剂的增效作用[D]. 胡松竹. 南京农业大学, 2019(08)
- [9]水稻二化螟的抗药性监测及对氯虫苯甲酰胺的抗性遗传特性[D]. 赵思琪. 南京农业大学, 2019(08)
- [10]二化螟对氯虫苯甲酰胺的代谢抗性分子机制研究[D]. 赵钧. 南京农业大学, 2018(08)