本文主要研究内容
作者王诗卉（2019）在《进化工程改造芽孢杆菌生产3-羟基丁酮》一文中研究指出：3-羟基丁酮是一种具有特殊的奶油香气的平台化学品,广泛应用于食品添加剂、制药和化工等领域。微生物发酵法生产3-羟基丁酮由于满足可持续发展理念而日益受到瞩目。多数芽孢杆菌作为一般认为安全的（GRAS）菌株具有天然合成3-羟基丁酮的代谢路径,但其产量由于菌株耐受性等因素的限制还不能达到工业化制备的要求。本研究通过结合进化工程策略和代谢工程方法,对解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）进行传统复合诱变、自主适应性进化,强化了3-羟基丁酮的耐受表型,提高了工程菌株3-羟基丁酮的生产性能。主要研究内容如下:1.高产3-羟基丁酮芽孢杆菌的传统突变选育。采用常压室温等离子体（ARTP）和60Coγ射线对B.amyloliquefaciens FMME088进行复合诱变,以3-羟基丁酮产量为分析指标,通过摇瓶水平的两轮筛选获得最优突变株B.amyloliquefaciens H-5,3-羟基丁酮产量为68.2 g·L-1。为实现3-羟基丁酮的高效生产,进一步对此突变株进行5-L发酵罐水平的培养条件优化,并于30-L发酵罐上进行放大培养,最终3-羟基丁酮产量达85.2 g·L-1,较出发菌株B.amyloliquefaciens FMME088提高了26.8%。2.自主进化突变系统（AEMS）的设计与构建。首先,为了确定启动子PsrfA是否满足群体感应（quorum sensing,QS）的自诱导性能,在B.subtilis 168中表达了由PsrfA启动的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）,其荧光表达强度随细胞生长状态的变化而变化,并在细胞生长至对数中后期（812 h）,OD600为1.02.2时表达显著增加。其次,为了提高启动子PsrfA的转录活性,使用保守序列TTGACA和TATAAT替换PsrfA的-35区和-10区,通过检测荧光表达强度发现,由-35区被替换的启动子PTH11启动的EGFP荧光强度提高了40%。另外,对PTH11的上游序列进行不同长度的截断,其中PJD15（-136+291）启动的EGFP荧光强度最大,提高了48%。第三,为了实现对启动子PJD15的精细调控以及减轻泄漏表达,将启动子PJD15和木糖操纵子相结合,设计了由细胞密度和木糖共同诱导的杂合启动子PsrfAxylOm。为了扩展其调控范围,结合由IPTG诱导的杂合启动子PgraclacO,构建了分层动态调控系统,并借助蛋白酶降解过程的SspB连接蛋白和ssrA标签,实现单一层级的自我调控和双层级间的转换调控。第四,以3-羟基丁酮的耐受性为检验指标,研究损伤修复基因（mutL、alkA、mutS和mutH）的缺失和重组修复基因（recA、ssbA、bstG、polY1）的过表达对B.subtilis 168在适应性进化中突变频率的影响。结果表明,双基因mutL、alkA敲除菌株B.subtilis HS114和双基因ssbA、bstG过表达菌株B.subtilis HS119突变频率较B.subtilis 168分别提高了14.6倍和26.5倍。因此,选择mutL和alkA作为高保真模块（HFM）,选择ssbA和bstG作为突变模块（MUM）。最后,将HFM和MUM与分层动态调控系统相结合,借助启动子PgraclacO调控HFM和PsrfAxylOm调控MUM,构建自主进化突变系统（AEMS）。3.自主进化突变系统（AEMS）的应用。首先,将AEMS应用于适应性进化筛选3-羟基丁酮耐受性表型,以60 g·L-1 3-羟基丁酮作为筛选压力,细胞存活率作为筛选指标,正突变率达到了44.8%,获得最优耐受性突变株HS013。其次,将AEMS应用于适应性进化筛选3-羟基丁酮高产菌株。在HS013中过表达3-羟基丁酮生物合成路径上的三个关键酶——6-磷酸果糖激酶（PFKA）、α-乙酰乳酸合成酶（ALS）和α-乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）,获得重组菌株B.subtilis HS014。在此基础上,利用AEMS对HS014进行适应性进化,以3-羟基丁酮产量作为筛选指标,筛选获得最优突变株B.subtilis HS016,3-羟基丁酮产量达到64.5 g·L-1。再次在HS016中,进一步过表达正向调控3-羟基丁酮合成的转录调控子CcpA和AlsR,并利用AEMS进行自主进化,筛选获得3-羟基丁酮高产菌株B.subtilis HS019,3-羟基丁酮产量达到76.3 g·L-1。最后,在5-L发酵罐中对突变株HS019进行分批补料培养,3-羟基丁酮的产量、产率和生产强度分别为69.2 g·L-1、0.39 g·g-1和1.33 g·（L·h）-1。另外,将HS019进行30-L发酵罐的扩大培养,3-羟基丁酮的产量、产率和生产强度分别达到82.5 g·L-1,0.46 g·g-1和1.59 g·（L·h）-1,与5-L发酵罐水平相比,分别增加了19.2%,17.5%和19.3%。
Abstract
3-qiang ji ding tong shi yi chong ju you te shu de nai you xiang qi de ping tai hua xue pin ,an fan ying yong yu shi pin tian jia ji 、zhi yao he hua gong deng ling yu 。wei sheng wu fa jiao fa sheng chan 3-qiang ji ding tong you yu man zu ke chi xu fa zhan li nian er ri yi shou dao zhu mu 。duo shu ya bao gan jun zuo wei yi ban ren wei an quan de （GRAS）jun zhu ju you tian ran ge cheng 3-qiang ji ding tong de dai xie lu jing ,dan ji chan liang you yu jun zhu nai shou xing deng yin su de xian zhi hai bu neng da dao gong ye hua zhi bei de yao qiu 。ben yan jiu tong guo jie ge jin hua gong cheng ce lve he dai xie gong cheng fang fa ,dui jie dian fen ya bao gan jun （Bacillus amyloliquefaciens）he ku cao ya bao gan jun （Bacillus subtilis）jin hang chuan tong fu ge you bian 、zi zhu kuo ying xing jin hua ,jiang hua le 3-qiang ji ding tong de nai shou biao xing ,di gao le gong cheng jun zhu 3-qiang ji ding tong de sheng chan xing neng 。zhu yao yan jiu nei rong ru xia :1.gao chan 3-qiang ji ding tong ya bao gan jun de chuan tong tu bian shua yo 。cai yong chang ya shi wen deng li zi ti （ARTP）he 60Coγshe xian dui B.amyloliquefaciens FMME088jin hang fu ge you bian ,yi 3-qiang ji ding tong chan liang wei fen xi zhi biao ,tong guo yao ping shui ping de liang lun shai shua huo de zui you tu bian zhu B.amyloliquefaciens H-5,3-qiang ji ding tong chan liang wei 68.2 g·L-1。wei shi xian 3-qiang ji ding tong de gao xiao sheng chan ,jin yi bu dui ci tu bian zhu jin hang 5-Lfa jiao guan shui ping de pei yang tiao jian you hua ,bing yu 30-Lfa jiao guan shang jin hang fang da pei yang ,zui zhong 3-qiang ji ding tong chan liang da 85.2 g·L-1,jiao chu fa jun zhu B.amyloliquefaciens FMME088di gao le 26.8%。2.zi zhu jin hua tu bian ji tong （AEMS）de she ji yu gou jian 。shou xian ,wei le que ding qi dong zi PsrfAshi fou man zu qun ti gan ying （quorum sensing,QS）de zi you dao xing neng ,zai B.subtilis 168zhong biao da le you PsrfAqi dong de zeng jiang xing lu se ying guang dan bai （EGFP）,ji ying guang biao da jiang du sui xi bao sheng chang zhuang tai de bian hua er bian hua ,bing zai xi bao sheng chang zhi dui shu zhong hou ji （812 h）,OD600wei 1.02.2shi biao da xian zhe zeng jia 。ji ci ,wei le di gao qi dong zi PsrfAde zhuai lu huo xing ,shi yong bao shou xu lie TTGACAhe TATAATti huan PsrfAde -35ou he -10ou ,tong guo jian ce ying guang biao da jiang du fa xian ,you -35ou bei ti huan de qi dong zi PTH11qi dong de EGFPying guang jiang du di gao le 40%。ling wai ,dui PTH11de shang you xu lie jin hang bu tong chang du de jie duan ,ji zhong PJD15（-136+291）qi dong de EGFPying guang jiang du zui da ,di gao le 48%。di san ,wei le shi xian dui qi dong zi PJD15de jing xi diao kong yi ji jian qing xie lou biao da ,jiang qi dong zi PJD15he mu tang cao zong zi xiang jie ge ,she ji le you xi bao mi du he mu tang gong tong you dao de za ge qi dong zi PsrfAxylOm。wei le kuo zhan ji diao kong fan wei ,jie ge you IPTGyou dao de za ge qi dong zi PgraclacO,gou jian le fen ceng dong tai diao kong ji tong ,bing jie zhu dan bai mei jiang jie guo cheng de SspBlian jie dan bai he ssrAbiao qian ,shi xian chan yi ceng ji de zi wo diao kong he shuang ceng ji jian de zhuai huan diao kong 。di si ,yi 3-qiang ji ding tong de nai shou xing wei jian yan zhi biao ,yan jiu sun shang xiu fu ji yin （mutL、alkA、mutShe mutH）de que shi he chong zu xiu fu ji yin （recA、ssbA、bstG、polY1）de guo biao da dui B.subtilis 168zai kuo ying xing jin hua zhong tu bian pin lv de ying xiang 。jie guo biao ming ,shuang ji yin mutL、alkAqiao chu jun zhu B.subtilis HS114he shuang ji yin ssbA、bstGguo biao da jun zhu B.subtilis HS119tu bian pin lv jiao B.subtilis 168fen bie di gao le 14.6bei he 26.5bei 。yin ci ,shua ze mutLhe alkAzuo wei gao bao zhen mo kuai （HFM）,shua ze ssbAhe bstGzuo wei tu bian mo kuai （MUM）。zui hou ,jiang HFMhe MUMyu fen ceng dong tai diao kong ji tong xiang jie ge ,jie zhu qi dong zi PgraclacOdiao kong HFMhe PsrfAxylOmdiao kong MUM,gou jian zi zhu jin hua tu bian ji tong （AEMS）。3.zi zhu jin hua tu bian ji tong （AEMS）de ying yong 。shou xian ,jiang AEMSying yong yu kuo ying xing jin hua shai shua 3-qiang ji ding tong nai shou xing biao xing ,yi 60 g·L-1 3-qiang ji ding tong zuo wei shai shua ya li ,xi bao cun huo lv zuo wei shai shua zhi biao ,zheng tu bian lv da dao le 44.8%,huo de zui you nai shou xing tu bian zhu HS013。ji ci ,jiang AEMSying yong yu kuo ying xing jin hua shai shua 3-qiang ji ding tong gao chan jun zhu 。zai HS013zhong guo biao da 3-qiang ji ding tong sheng wu ge cheng lu jing shang de san ge guan jian mei ——6-lin suan guo tang ji mei （PFKA）、α-yi xian ru suan ge cheng mei （ALS）he α-yi xian ru suan tuo suo mei （ALDC）,huo de chong zu jun zhu B.subtilis HS014。zai ci ji chu shang ,li yong AEMSdui HS014jin hang kuo ying xing jin hua ,yi 3-qiang ji ding tong chan liang zuo wei shai shua zhi biao ,shai shua huo de zui you tu bian zhu B.subtilis HS016,3-qiang ji ding tong chan liang da dao 64.5 g·L-1。zai ci zai HS016zhong ,jin yi bu guo biao da zheng xiang diao kong 3-qiang ji ding tong ge cheng de zhuai lu diao kong zi CcpAhe AlsR,bing li yong AEMSjin hang zi zhu jin hua ,shai shua huo de 3-qiang ji ding tong gao chan jun zhu B.subtilis HS019,3-qiang ji ding tong chan liang da dao 76.3 g·L-1。zui hou ,zai 5-Lfa jiao guan zhong dui tu bian zhu HS019jin hang fen pi bu liao pei yang ,3-qiang ji ding tong de chan liang 、chan lv he sheng chan jiang du fen bie wei 69.2 g·L-1、0.39 g·g-1he 1.33 g·（L·h）-1。ling wai ,jiang HS019jin hang 30-Lfa jiao guan de kuo da pei yang ,3-qiang ji ding tong de chan liang 、chan lv he sheng chan jiang du fen bie da dao 82.5 g·L-1,0.46 g·g-1he 1.59 g·（L·h）-1,yu 5-Lfa jiao guan shui ping xiang bi ,fen bie zeng jia le 19.2%,17.5%he 19.3%。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自江南大学的王诗卉，发表于刊物江南大学2019-10-21论文，是一篇关于芽孢杆菌论文,羟基丁酮论文,自主进化突变系统论文,进化工程论文,代谢工程论文,江南大学2019-10-21论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自江南大学2019-10-21论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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