导读:本文包含了芽孢表面展示论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:芽孢表面展示,增强型绿色荧光蛋白,海藻糖合酶
芽孢表面展示论文文献综述
杨少杰[1]（2019）在《芽孢表面展示海藻糖合酶重组枯草芽孢杆菌的构建及应用》一文中研究指出表面展示是将异源多肽和蛋白质固定在噬菌体、细胞或芽孢表面的一种分子生物学技术,而目前已经完成了枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的全基因组测序,并且它具有食品安全性,其产生的芽孢也具有极高的安全性,更方便于构建芽孢表面展示系统。海藻糖具有在极端环境下保护生物大分子生命体特征的生物学功能,目前,已实现海藻糖规模化生产的方法为酶法,包括双酶法和单酶法。单酶法是在海藻糖合酶(TreS)作用下,直接将麦芽糖异构为海藻糖的方法。该方法过程简单,易于操作,引起了各国科学家的重视。针对上述内容,本文开展了以下研究工作:(1)选取了11种芽孢衣壳蛋白分别将EGFP展示在B.subtilis WB800n芽孢表面。通过Western Blot及免疫荧光分析,证明已成功将EGFP分别展示在11株重组菌的重组芽孢表面,并得到了不同衣壳蛋白所展示EGFP荧光强度大小的关系为:CotX>CotY>CotF>CotC>CotE>CotG>CotV>CotB>CotM>CotA>CotW。(2)根据测得的不同芽孢衣壳蛋白所展示绿色荧光强度的大小,分别选取了芽孢锚定蛋白CotX、CotY、CotF、CotC、CotE和CotG作为分子载体,构建了芽孢表面展示海藻糖合酶TreS的重组枯草芽孢杆菌。通过Western Blot及酶活性分析,证明已成功将海藻糖合酶TreS展示到B.subtilis WB800n芽孢表面,测得6株重组菌的单位菌体干重芽孢表面展示的酶活分别为3687.64 U/g(cotX),1791.16 U/g(cotY),862.18 U/g(cotF),886.11 U/g(cotC),621.96 U/g(cotE),484.51 U/g(cotG),与所测得的所展示绿色荧光强度大小的关系基本一致。(3)利用芽孢衣壳蛋白CotC和CotG同时作为分子载体,构建了在芽孢表面共展示TreS的重组枯草芽孢杆菌,通过激光共聚焦显微镜、Western Blot及酶活分析,证明已成功将TreS共展示到B.subtilis WB800n芽孢表面。TB培养基摇瓶发酵96 h后,测定共展示TreS的重组菌单位菌体干重芽孢表面展示的酶活为1511.6 U/g。利用Dot Blot分析,测得CotC和CotG蛋白分别和共同展示TreS时,单个芽孢所展示的TreS分子数分别为2.84×10~9(CotC)、1.38×10~9(CotG)和4.65×10~9(CotC+CotG)个。通过对TB培养基的优化,发酵总菌体数为1.66×10~9 cfu/mL,芽孢数为1.50×10~9cfu/mL,产芽孢率达90.36%,共展示TreS重组菌的单位菌体干重芽孢表面展示的酶活达2450 U/g。(4)敲除了芽孢萌发基因sleB和cwlJ,有效控制了表面展示TreS重组芽孢在转化体系中的萌发。通过对重组菌B.subtilis WB800n(△sleB,△cwlJ)/cotC-treS-cotG-treS的重组芽孢在不同条件下对麦芽糖的转化,证明其芽孢表面展示的海藻糖合酶TreS具有良好的热稳定性及pH耐受性,并且其芽孢在循环转化四次后仍能维持较高酶活。(本文来源于《齐鲁工业大学》期刊2019-06-04）
王利武[2]（2019）在《枯草芽孢杆菌芽孢表面展示黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶的研究》一文中研究指出农药与人们的生活息息相关。为保证农作物的产量,人们在田地中大量施放农药,造成土壤中农药累积,可能会威胁环境和食品安全。有机磷类农药是使用量最多的农药之一,会造成慢性中毒(如神经系统失调、脏器毒性、癌症、出生缺陷、生殖毒性等)。在2010年至2018年之间,已经发生多起因误食有机磷农药残留超标的蔬菜引发的食物中毒事件。国家标准规定的气相色谱检测方法需要昂贵仪器,不适用于日常快速现场检测。机磷农药可特异性地不可逆抑制动物神经系统中乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性,酶抑制法是根据AChE活性受到抑制程度来测定有机磷农药残留量的方法。具有检测快速、设备和试剂简单、成本低等特点,适合水果蔬菜有机磷农药残留量的检测。目前,AChE主要从昆虫或动物血液中提取,产量低、成本高、酶活性不稳定,严重阻碍了AChE在农药残留检测中的应用。本论文获得黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶(DmAChE)。将其基因连接到pHT43质粒中并实现大肠杆菌内复制扩增并提取,再将提取的质粒转入到枯草芽孢杆菌WB800N中获得重组菌株pHT43-ache-WB800N,经IPTG诱导表达DmAChE,并通过western blot检测成功表达DmAChE。酶学性质研究表明,DmAChE酶活力为53U/mg,Km值为0.058mmol/L;最适酶反应温度为30℃,最适pH值为7。在上述工作基础上,我们以芽孢表面展示技术实现了DmAChE的固定化,提高了该酶的环境耐受性。将黑腹果蝇的乙酰胆碱酯酶基因与六种芽孢衣壳蛋白(CotB、CotC、CotG、CotX、CotY、CotZ)共同连接到pHT43载体上,将其转化入枯草芽孢杆菌WB800N中并实现孢子化,通过观察不同孢子表面免疫荧光差异,确定最佳的锚定蛋白为CotG。酶学性质研究表明,其酶活性为0.7U/mg,然后检测了G-AChE在20-70℃温度下及pH=4.0-9.0的条件下的相对酶活性,发现其在70℃条件下仍能保存60%以上的相对酶活性,且对酸碱的耐受性也大大增加,在pH为4的条件下,相对酶活性依然能够达到60%以上,远高于DmAChE温度耐受性和酸碱耐受性。综上所述,枯草杆菌芽孢表面展示系统作为一种新型的抗逆性酶固定化技术,可以很好地解决目前酶抑制法检测有机磷农药时AChE酶活性不稳定的问题,希望通过后续研究可以研制出能够稳定检测有机磷农药的快速检测商品。(本文来源于《吉林大学》期刊2019-06-01）
丁尊丹[3]（2019）在《芽孢杆菌表面展示系统的构建及其在环境污染生物修复中的应用》一文中研究指出微生物表面展示是将蛋白质表达于细胞表面的方法,可应用于工业、农业和环境修复等领域。作为环境友好、安全的革兰氏阳性模式细菌,枯草芽孢杆菌目前已鉴定出一些锚定蛋白,可将外源蛋白展示表达于孢子的表面,但是菌体表面展示的锚定蛋白发现的很少。因此,开发优化高效的芽孢杆菌的菌体表面展示系统具有重要意义。在本项研究中,我们提出了一种基于生物信息学的系统筛选方案,来筛选枯草芽孢杆菌基因组上编码的潜在锚定蛋白,共得到了47个含有自身启动子的候选锚定蛋白。通过构建EGFP荧光报告系统,来评估所选锚定蛋白在其自身启动子作用下的细胞表面展示效率。结果发现,锚定蛋白SpoIIIJ在芽孢杆菌的细胞表面上的展示效果最好。为了确定融合蛋白的表达位置,首先通过比较培养在生孢培养基和营养丰富培养基的细胞荧光值,初步确定其在菌体上表达,再利用超分辨率共聚焦显微镜A1/SIM/STORM进行荧光定位,进一步确定了融合蛋白在菌体细胞表面表达。在锚定蛋白SpoIIIJ和EGFP之间添加连接肽,其中通过添加6个脯氨酸作为连接肽,融合蛋白可以相对增加58.3%的荧光表达量。另外还优化了表达载体,发现该展示系统也可以展示表达外源蛋白质到地衣芽孢杆菌,且表现出较高的效率。随后在枯草和地衣芽孢杆菌两个系统中表面展示有机磷水解酶OphC2,结果显示,融合蛋白正常表达,且在地衣芽孢杆菌中的有机磷降解酶活性比枯草芽孢杆菌高2.1倍。当在枯草芽孢杆菌中表面展示金属结合蛋白CadR时,其吸附Cd~(2+)的量几乎是原始菌株的7倍。当在枯草芽孢杆菌中表达过氧化氢酶Cat9时,其在菌体中有较高活性,SDS-PAGE结果进一步显示融合的目的蛋白条带在菌体中显示明显多于上清中,与荧光定位实验结果一致。本研究表明,构建的细胞表面展示系统可在芽孢杆菌细胞表面展示靶蛋白,为利用芽孢杆菌进行生物修复提供了材料。构建的基因工程菌株,有望应用于农药降解、生物催化、生物修复和生物传感等方面。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2019-04-01）
杨亚威,杨明明,龚月生[4]（2018）在《原位整合型枯草芽孢杆菌芽孢表面展示载体的构建》一文中研究指出为证明原位整合能否用于枯草芽孢杆菌芽孢表面展示外源蛋白,本研究将芽孢衣壳蛋白CotB、CotZ的编码序列(不含终止密码子),与绿色荧光蛋白基因重组,构建含有融合片段cotB-gfp和cotZ-gfp的原位整合型表面展示载体pEYW25、pEYW26;将上述质粒分别转入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis PY79)获得重组菌株BSYW25和BSYW26。荧光显微镜下观察上述重组菌的芽孢,只有BSYW26能检测到荧光,Western blot结果显示BSYW26的芽孢外壳蛋白中含有GFP。结果表明原位整合作为一种新的表面展示方法能够应用于枯草芽孢杆菌芽孢表面展示。(本文来源于《家畜生态学报》期刊2018年10期）
张国艳,张欢欢,员君华,杨苗苗,袁娇[5]（2018）在《基因重组型枯草芽孢杆菌芽孢表面展示技术与应用》一文中研究指出枯草芽孢杆菌是一种好氧型革兰氏阳性益生菌,在营养匮乏的环境下,可形成具有强抗逆性的芽孢。其芽孢独特的结构和生理功能使得芽孢表面展示技术相较于其他表面展示技术具有多种优势,构建的重组芽孢不但易纯化、回收率高,而且安全性好。近年来,枯草芽孢杆菌芽孢表面展示技术得到迅猛发展,已成功利用CotB、CotC、CotG、CotZ、CotA、OxdD、CotE、CotZ、CgeA等多种锚定蛋白将外源蛋白或多肽展示在芽孢表面,并应用于工业化酶、口服疫苗和药物、大分子量多聚体蛋白的生产以及环境污染的生物治理等领域。本文首先介绍了芽孢展示系统整合策略,并重点阐述了基因重组型枯草芽孢杆菌芽孢展示技术中涉及的锚定蛋白以及该技术在各领域的应用与展望。(本文来源于《广西科学》期刊2018年03期）
Jawad,Ullah[6]（2017）在《连接肽对枯草杆菌芽孢衣壳蛋白B表面展示海栖热袍菌脂肪酶Tm1350的影响》一文中研究指出工业酶是使用生物催化方法生产食品、医药、化工等产品的主要酶源。它们具有手性、立体异构和结构域特异性,并且具有在简单介质(如水)中而不是特定介质(如有机溶剂和其他溶液)中识别底物的能力。脂肪酶是α或β折叠水解酶,也是众所周知的蛋白拆分器。来自嗜热生物的脂肪酶能耐受高温,可用于工业生物过程。而且,这些酶的稳定性和表达可以通过将其展示在芽孢表面上来改善。芽孢展示技术效果显着,低成本,耗时少,因此是很有潜力的技术,可应用于环境、医疗和工业等行业中。芽孢能耐受恶劣的工业环境,包括耐热、耐碱、耐化学溶剂,易于回收和可再利用,因此芽孢展示技术工业中应用前景广泛。酵母菌和细菌(包括革兰氏阳性和阴性菌),是最常被用于展示各种蛋白质的载体,但与孢子不同,由于营养细胞对热、p H和化学物质敏感,易破裂。因此,芽孢是避免这些问题的最佳选择,并且相对于营养细胞展示技术,芽孢展示技术则具有多种应用领域。梭菌和芽孢杆菌的各种菌株都能形成芽孢,但是枯草芽孢杆菌最合适做展示载体,因为根据世卫组织认定它对人类是安全的,被认为是“GRAS”(通常被认为是安全的)。芽孢表面展示技术在工业、疫苗开发、环境等方面有着各种应用,细胞表面展示增强了蛋白质表达稳定性和活性,合适的连接肽会使展示的融合蛋白活性和稳定性增强。在本研究中,以海栖热袍菌和枯草芽孢杆菌染色体基因组作为模板进行PCR扩增脂肪酶Tm1350和Cot B基因,在Tm1350和Cot B之间融合了一系列具有不同长度、刚柔性和残基位置的连接肽基因,将所需基因插入大肠杆菌B.subtilis穿梭载体PHS,构建了重组质粒。将重组质粒PHS-Cot B-LxTm1350转化到枯草芽孢杆菌中并诱导芽孢形成。纯化芽孢,通过western印迹分析证实了Cot B-Lx-Tm1350的表达。检测了各种温度(40-80℃),不同p H(范围4.0-10)和不同有机溶剂对含各种连接肽的芽孢表面展示酶生物活性的影响。结果表明所有芽孢展示的融合蛋白的最适温度为75℃,L8和L10的最适p H为8.5,对于L0,L5,L6和L9,最适p H为9.0,而对于L1,L2,L3,L4和L7最适p H为9.5。在最佳温度和p H下,具有较长柔性连接肽L9(GGGGS-GGGGS-GGGGS-GGGGS)和L7(GGGGS-GGGGS-EAAAK-EAAAK-GGGGS-GGGGS)的融合蛋白具有比原始活性高1.29和1.16倍的活性。此外,在80℃下,孵育5小时后,具有连接肽L3(EAAAKGGGGS)和L9(GGGGS-GGGGS-GGGGS-GGGGS)的展示酶热稳定性最好,分别比原来的活性高1.40和1.35倍。测定了不同氨基酸残基位置取向和长度的连接肽的展示酶生物活性,其中L5,L6和L7含有30个不同氨基酸残基取向的连接肽的测定结果表明L7展示酶的活性分别是L6和L5的1.05和1.27倍。研究了0.1%蛋白酶K和菠萝蛋白酶,20%乙醇和30%甲醇对含连接肽的重组芽孢活性的影响。具有适当甘氨酸残基(柔性)的连接肽展示比丙氨酸残基(刚性)具有更高的活性。综上所述,为了提高工业过程中展示酶的活性和稳定性,通过在一定程度上优化连接肽的氨基酸残基位置取向和刚柔性,能达到改善效果。(本文来源于《江苏大学》期刊2017-06-05）
赵一瑾[7]（2017）在《枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC表面展示海藻糖合酶的技术研究》一文中研究指出海藻糖是由两分子葡萄糖通过半缩醛羟基缩合而成的,自然界中普遍存在的一种非还原性双糖,是一种极好的天然干燥剂和保鲜剂。海藻糖合酶(Trehalose synthase,TreS)属于糖苷水解酶第13家族,能够催化麦芽糖直接转化为海藻糖,该酶在催化反应中的底物特异性和专一性较高,不需要消耗高能物质,是生产海藻糖的首选。为获得具有良好表面展示效果的海藻糖合酶,本研究将其高效稳定的展示于枯草芽孢杆菌芽孢表面,实验先后分别选取增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和海藻糖合酶(TreS)作为模型蛋白,首先以来自枯草芽孢杆菌的芽孢衣壳蛋白Cot C、Cot B、Cot G、Cot X作为枯草芽杆菌表面展示的增强型绿色荧光蛋白进行表面展示研究。利用流式细胞仪和荧光显微镜分析EGFP在芽孢表面展示的情况,结果表明上述芽孢衣壳蛋白均可以将EGFP固定在芽孢的表面。然后将荧光蛋白基因egfp通过酶切替换为海藻糖合酶基因tres,将重组菌株使用pH 7.5的缓冲液清洗并重悬,与底物浓度为30%的麦芽糖在40℃水浴条件下作用2h,反应产物利用HPLC检测,能够检测到海藻糖峰,说明海藻糖合酶基因通过与芽孢衣壳蛋白Cot C融合后可被展示在芽孢的表面。通过对重组菌的产芽孢培养基在碳源、氮源和无机盐方面的优化,可知在添加量为2%的麸皮、2%的大豆蛋白胨、0.1%的CaCl_2和0.002%的MnSO_4·H_2O,在pH7.5,40℃条件下芽孢形成率最高。根据优化后的酶促反应条件为pH 7.5,40℃时,表面展示海藻糖合酶的酶活最高为27.2U/mL。40℃-45℃温度范围内保温6h其相对酶活在83%以上,在pH 7.0-7.5范围内处理6h其相对酶活仍保持在70%以上。(本文来源于《齐鲁工业大学》期刊2017-05-12）
杨亚威[8]（2017）在《枯草芽孢杆菌芽孢表面展示载体的构建及卷曲乳杆菌S层蛋白在芽孢表面的展示》一文中研究指出乳酸杆菌S层蛋白已被证实在乳酸菌的粘附功能中起主要作用,枯草芽孢杆菌及其芽孢均对动物机体有益,但在动物肠道中停留时间短,因此通过在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示S层蛋白可增强枯草芽孢杆菌对肠道上皮细胞的粘附能力从而延长在肠道中的停留时间,最大限度地发挥枯草芽孢杆菌的益生特性。枯草芽孢杆菌芽孢表面展示载体类型包括质粒型、单交叉同源重组和双交叉同源重组。比较常用的为双交叉同源重组,常用的整合位点为淀粉酶基因位点,但这种方法存在展示效率低的缺点。本试验分别构建了叁种不同方式的表面展示载体,探索叁种方式的优缺点,并尝试将卷曲乳杆菌S层蛋白通过叁种不同方式展示在枯草芽孢杆菌芽孢的表面。试验内容与结果如下:1.引物退火生成多克隆位点片段,构建带有Pglv启动子和多克隆位点的穿梭表达载体pLLF-2,利用该载体在枯草芽孢杆菌中成功表达了绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶,证明了穿梭表达载体构建成功并成功地表达外源蛋白。2.扩增芽孢衣壳蛋白编码基因cot B和cotZ,并在3'端引入连结肽,扩增绿色荧光蛋白基因分别与芽孢衣壳蛋白的3'端连接,通过相应的酶切位点插入穿梭表达载体pLLF-2中,构建质粒型表面展示载体pEYGJ52和pEYW27,转化枯草芽孢杆菌,获得重组菌BSYGJ52和BSYW27,诱导重组菌产生芽孢,均不能在芽孢表面观察到绿色荧光,表明质粒型表面展示载体不适用于以CotB和CotZ作锚定蛋白来展示外源蛋白。3.融合片段cot B-gfp和cotZ-gfp通过相应的酶切位点插入到单交叉整合质粒pLX-2上,得到单交叉整合载体pEYW25和pEYW26,转化枯草芽孢杆菌得到重组菌BSYW25和BSYW26,只在重组菌BSYW26的芽孢表面观察到绿色荧光,表明通过单交叉整合的方式能使CotZ作锚定蛋白来展示外源蛋白,重组菌BSYW25表面展示失败可能与芽孢衣壳蛋白在芽孢结构中的位置有关。4.在单交叉整合载体试验结果的基础上,只构建以CotZ作锚定蛋白,gfp作报告基因的双交叉整合载体,通过相应的酶切位点将融合基因cotZ-gfp插入到双交叉整合质粒pLX-2AmyE中,得到双交叉整合载体pEYW68,转化枯草芽孢杆菌,得到重组菌BSYW68,在重组菌BSYW68的芽孢表面能观察到绿色荧光,说明通过淀粉酶异位整合也能使CotZ作为锚定蛋白展示外源蛋白。5.扩增卷曲乳酸杆菌S层蛋白的编码基因sip,通过相应的酶切位点替换质粒型表面展示载体pEYGJ52和pEYW27,单交叉整合载体pEYW25和pEYW26,双交叉整合载体pEYW68中的gfp基因分别得到融合有sip基因的载体pEYW10、pEYW14、pEYW20、pEYW21和p EYW72,转化枯草芽孢杆菌得到重组菌BSYW10、BSYW14、BSYW20、BSYW21和BSYW72,诱导重组菌生成芽孢,提取芽孢外壳蛋白,Western blot检测卷曲乳酸杆菌S层蛋白,以上叁种形式的表面展示方式均没有成功展示卷曲乳杆菌S层蛋白,这可能与S层蛋白本身的性质有很大关系。综上所述,本研究主要构建了质粒型表面展示载体、单交叉整合表面展示载体和双交叉整合表面展示载体,同时,尝试将卷曲乳杆菌S层蛋白通过这些载体展示在枯草芽孢杆菌芽孢的表面。初步了解了叁种不同展示方式的可行性和优缺点,为实验室的下一步相关工作提供平台和依据。(本文来源于《西北农林科技大学》期刊2017-05-01）
戴茜茜,谷笑笑,张飞燕,王振华,张娇[9]（2016）在《枯草杆菌芽孢表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白保护性抗原片段研究》一文中研究指出本研究将猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白保护性抗原片段COE_1与枯草杆菌芽孢外层衣壳蛋白基因cotB进行融合,构建表面展示S蛋白保护性抗原片段的重组芽孢。通过将cotB基因与COE1编码序列进行重组,构建融合表达cotB-COE_1的整合型重组质粒,重组质粒与枯草芽孢杆菌淀粉酶基因amyE双交叉,获得重组枯草芽孢杆菌,对重组枯草芽孢杆菌进行淀粉酶活性分析、PCR扩增鉴定,提取重组芽孢衣壳总蛋白进行Westernblot分析及对重组芽孢进行免疫荧光显微镜观察。通过淀粉酶活性分析与PCR鉴定结果表明该融合基因成功整合于枯草芽孢杆菌染色体上;Western blot分析结果在67.78kDa处获得一条特异性的蛋白杂交带;使用生物素标记抗体免疫荧光显微镜观察重组芽孢具有特异性荧光信号。结果表明PEDV S蛋白保护性抗原片段COE_1成功地展示于枯草杆菌芽孢表面。(本文来源于《中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第五届第十二次全国学术研讨会论文集》期刊2016-11-04）
刘明刚,刘红露,戴茜茜,徐毓琴,张飞燕[10]（2016）在《以CotB作为融合基序在枯草杆菌芽孢表面展示鸡白痢沙门氏菌OmpC的研究》一文中研究指出本文旨在通过使用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotB作为融合基序,构建表面展示鸡白痢沙门氏菌外膜蛋白OmpC的重组芽孢,为防控沙门氏菌感染提供新的思路。分别PCR扩增鸡白痢沙门氏菌OmpC编码基因与含自身启动子的芽孢衣壳蛋白CotB编码基因,以质粒pDG364为基础进行二者融合并构建整合型重组质粒pDG364-cotB-ompC,将融合基因整合于枯草芽孢杆菌168 amyE基因位点,通过淀粉酶活性、PCR技术、免疫荧光显微镜进行分析。以芽孢衣壳蛋白CotB为融合基序,成功构建获得携带CotB和OmpC融合基因的整合型重组质粒pDG364-cotB-ompC,并经同源双交叉重组将其整合于枯草芽孢杆菌168基因组上,通过淀粉酶活性分析与PCR鉴定表明该融合基因成功整合于amyE基因位点,使用OmpC特异性抗体探测的免疫荧光显微镜分析检测到特异性的荧光信号。结果表明,鸡白痢沙门氏菌OmpC以具有生物活性的形式成功表达并展示于枯草芽孢杆菌168芽孢表面。(本文来源于《中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第五届第十二次全国学术研讨会论文集》期刊2016-11-04）
芽孢表面展示论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
农药与人们的生活息息相关。为保证农作物的产量,人们在田地中大量施放农药,造成土壤中农药累积,可能会威胁环境和食品安全。有机磷类农药是使用量最多的农药之一,会造成慢性中毒(如神经系统失调、脏器毒性、癌症、出生缺陷、生殖毒性等)。在2010年至2018年之间,已经发生多起因误食有机磷农药残留超标的蔬菜引发的食物中毒事件。国家标准规定的气相色谱检测方法需要昂贵仪器,不适用于日常快速现场检测。机磷农药可特异性地不可逆抑制动物神经系统中乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性,酶抑制法是根据AChE活性受到抑制程度来测定有机磷农药残留量的方法。具有检测快速、设备和试剂简单、成本低等特点,适合水果蔬菜有机磷农药残留量的检测。目前,AChE主要从昆虫或动物血液中提取,产量低、成本高、酶活性不稳定,严重阻碍了AChE在农药残留检测中的应用。本论文获得黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶(DmAChE)。将其基因连接到pHT43质粒中并实现大肠杆菌内复制扩增并提取,再将提取的质粒转入到枯草芽孢杆菌WB800N中获得重组菌株pHT43-ache-WB800N,经IPTG诱导表达DmAChE,并通过western blot检测成功表达DmAChE。酶学性质研究表明,DmAChE酶活力为53U/mg,Km值为0.058mmol/L;最适酶反应温度为30℃,最适pH值为7。在上述工作基础上,我们以芽孢表面展示技术实现了DmAChE的固定化,提高了该酶的环境耐受性。将黑腹果蝇的乙酰胆碱酯酶基因与六种芽孢衣壳蛋白(CotB、CotC、CotG、CotX、CotY、CotZ)共同连接到pHT43载体上,将其转化入枯草芽孢杆菌WB800N中并实现孢子化,通过观察不同孢子表面免疫荧光差异,确定最佳的锚定蛋白为CotG。酶学性质研究表明,其酶活性为0.7U/mg,然后检测了G-AChE在20-70℃温度下及pH=4.0-9.0的条件下的相对酶活性,发现其在70℃条件下仍能保存60%以上的相对酶活性,且对酸碱的耐受性也大大增加,在pH为4的条件下,相对酶活性依然能够达到60%以上,远高于DmAChE温度耐受性和酸碱耐受性。综上所述,枯草杆菌芽孢表面展示系统作为一种新型的抗逆性酶固定化技术,可以很好地解决目前酶抑制法检测有机磷农药时AChE酶活性不稳定的问题,希望通过后续研究可以研制出能够稳定检测有机磷农药的快速检测商品。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
芽孢表面展示论文参考文献
[1].杨少杰.芽孢表面展示海藻糖合酶重组枯草芽孢杆菌的构建及应用[D].齐鲁工业大学.2019
[2].王利武.枯草芽孢杆菌芽孢表面展示黑腹果蝇乙酰胆碱酯酶的研究[D].吉林大学.2019
[3].丁尊丹.芽孢杆菌表面展示系统的构建及其在环境污染生物修复中的应用[D].中国农业科学院.2019
[4].杨亚威,杨明明,龚月生.原位整合型枯草芽孢杆菌芽孢表面展示载体的构建[J].家畜生态学报.2018
[5].张国艳,张欢欢,员君华,杨苗苗,袁娇.基因重组型枯草芽孢杆菌芽孢表面展示技术与应用[J].广西科学.2018
[6].Jawad,Ullah.连接肽对枯草杆菌芽孢衣壳蛋白B表面展示海栖热袍菌脂肪酶Tm1350的影响[D].江苏大学.2017
[7].赵一瑾.枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC表面展示海藻糖合酶的技术研究[D].齐鲁工业大学.2017
[8].杨亚威.枯草芽孢杆菌芽孢表面展示载体的构建及卷曲乳杆菌S层蛋白在芽孢表面的展示[D].西北农林科技大学.2017
[9].戴茜茜,谷笑笑,张飞燕,王振华,张娇.枯草杆菌芽孢表面展示猪流行性腹泻病毒S蛋白保护性抗原片段研究[C].中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第五届第十二次全国学术研讨会论文集.2016
[10].刘明刚,刘红露,戴茜茜,徐毓琴,张飞燕.以CotB作为融合基序在枯草杆菌芽孢表面展示鸡白痢沙门氏菌OmpC的研究[C].中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第五届第十二次全国学术研讨会论文集.2016