血液病患者真菌感染DNA测序检测方法的建立

血液病患者真菌感染DNA测序检测方法的建立

宋小彦蔚利纳(郑州市第一人民医院450000)

【摘要】目的建立快速鉴定本院血液病患者感染真菌菌种的方法。方法收集本院2009年1月-2013年1月住院血液病患者血液样本,经BacT/ALERT3D血培养仪培养血琼脂培养基及沙保弱培养基分离培养真菌,对其进行总基因组DNA提取,并在真菌ITS保守区设计引物,对血液样本中的真菌DNA测序,建立真菌感染DNA测序检测方法。结论初步建立了本院血液真菌感染标本DNA测序检测方法,并可对个性化用药提供指导。

【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2013)32-0207-01

感染真菌的血液病患者免疫功能低下,容易发生严重感染,常有多系统功能紊乱,感染后易出现多器官功能衰竭[1]。为了了解血液真菌感染的种群分布,为临床用药提供指导,我们对本院2009年1月-2013年1月住院血液病人血液样本进行了真菌分布鉴定。

1材料和方法

1.1试剂基因组DNA提取试剂盒(FungalgDNAkit,Biomiga),PCR胶回收试剂盒(DNAGel/PCRPurificationMiniprepkit,Biomiga),TaqDNA聚合酶(2XTaqPCRMasterMix,Biomiga),95%酒精(Sigma),甲酰胺,HiDi,BigDye3.1kit均购自lifetechnologies,引物由Genscript合成,沙保罗琼脂培养基(麦芽糖40g,蛋白胨10g,琼脂20g,蒸馏水1L)

1.2培养及分离将取1~2ml血液标本接种于沙保罗琼脂培养基,冷却至45℃左右沙保琼脂混合,倾注接种平板[2]。置35℃恒温箱内培养48h。发现真菌及酵母样可疑菌落,转种沙保菌斜面,获得纯培养后进行基因组DNA提取[3]。

1.3ITS片段的PCR扩增

PCR通用引物检测方法的建立:以2×TaqPCRMasterMix建立50μl反应体系,体系如下:

1.4PCR产物纯化及测序

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后,根据DNAGel/PCRPurificationMiniprepkit使用说明进行PCR产物纯化,然后采用ABI3130xlDNA序列分析仪进行测序。1/8测序反应体系如下:DNA1?L,BigDye(2.5×)1?L,SeqBuffer(5×)1.5μl,引物ITS1(3.2pmol/?l)1?L,去离子灭菌水5.5?L,总体积10?L;测序PCR循环条件:96℃1min→(96℃10sec→50℃5sec→60℃4min)x25个循环→4℃保存。

1.4序列分析

测序结果在NCBIBlast进行序列同源比对搜索,同源率为100%即认为该菌种。

2结果

2.1测序结果经ITS1,ITS2引物双向测序,测序背景信号低,无套峰、杂峰。通过Seqman软件比对,在引物下游20bp后,序列100%一致。

2.2真菌菌种分布血液病患者临床标本分离出640株真菌菌种,包括4个菌属的15个菌种。以白色假丝酵母菌、曲霉菌属、热带假丝酵母菌、克柔假丝酵母菌及光滑假丝酵母菌等5种菌为主,分布为白色假丝酵母菌325株占50.8%,曲霉菌属122株占19.1%,热带假丝酵母菌77株12.0%,克柔假丝酵母菌50株占7.8%,光滑假丝酵母菌39株占6.1%,其余27株为其它真菌占4.2%。

3讨论

血液病并发侵袭性真菌感染在世界的致死率不断攀升[4]。放疗和化疗后机体的免疫防御系统受到损伤,导致真菌感染成为致死的一个主要原因[5]。

利用ITSDNA测序法进行菌种鉴定是目前较多采用的方法。ITS是内源转录间隔(InternallyTranscribedSpacer)的英文缩写,位于rRNA编码基因18S,5.8S和28S之间的小基因片段。利用rDNA通用引物能够很容易被扩增出来;同时包含保守与变异序列,能根据保守序列中的变异位点设计特殊引物进行特异性扩增比较,可实现真菌的快速分类与鉴定[6]。本研究针对我院640例病例根据ITSDNA测序法进行序列比对分析,结果达到预期期望,表明ITS1和ITS2引物对真菌有较强的特异性。基于测序结果分析,对比病例,本研究证明次方法可以准确的鉴定感染真菌的种属。

本实验最终以分离培养获得单一菌种的方法获得必要的基因组DNA。另外,由于本实验所用的真菌总DNA提取试剂盒效率较低,需要扩大培养,如果能够从分离步骤就可以获得微量基因组DNA,或者实现真菌菌斑直接PCR方法,对于提高鉴定效率可以大大提高。

本研究以ITSDNA测序法检测鉴定血液病并发侵染性真菌感染菌种,准确度,灵敏度极高,重复性高,从提取样本DNA到完成DNA测序,4小时左右完成鉴定。在本研究建立的鉴定方法上,进一步快速获得单一分离感染真菌菌种DNA或者PCR产物,完全可以形成一套快速,准确鉴定感染真菌菌种的检测体系。

参考文献

[1]沈建箴,傅海英.应重视血液病侵袭性真菌感染的诊治[J].中华内科杂志,2005,44(6):401-402.

[2]卫生部医政司.全国临床检验操作规程[s].第3版.南京:东南大学出版社,2006.736-753.

[3]魏权,陈艳红,邱植栋.262株真菌的分离及耐药性分析[J].福建医药杂志,2005,27(3):51-52.

[4]马爱瑛,张琇,刘晓飞.血液病患者合并侵袭性真菌感染的临床研究[J].生物技术通报,2010,11:234-237.

[5]张淑彩,郭晓,魏晓丽.恶性血液病患者医院感染的研究进展[J].中华医院感染学杂志,2005,15(12):1435-1437.

[6]王华民,王英,陈锦龙.应用rDNAITS测序检测海南岛条件致病性真菌[J].海南医学院学报,2008,4(1):1-3.

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