导读:本文包含了表皮降解蛋白酶基因论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:蜡蚧菌,蛋白酶基因,遗传转化,拷贝数检测
表皮降解蛋白酶基因论文文献综述
张晓林[1]（2016）在《外源表皮降解蛋白酶基因（Cdep1）转化蜡蚧菌及其酶活性增强效果评价》一文中研究指出蜡蚧菌是一种重要的虫生真菌,对于温室害虫具有良好的防治效果,但是由于其作用过程慢、效果容易受环境的影响,所以在实际应用中受到很大的限制。在蜡蚧菌侵染害虫的过程中,其分泌的蛋白酶、几丁质酶等胞外酶具有重要作用。研究发现,增加生防真菌胞外酶的分泌,能显着地提高真菌的毒力水平。本研究从白僵菌中克隆得到一个蛋白酶基因,将其导入蜡蚧菌中,提高蜡蚧菌的蛋白酶分泌水平,以此改良蜡蚧菌菌株。主要研究结果如下:1.克隆外源蛋白酶基因。从一株性状优良的球孢白僵菌中克隆蛋白酶基因Cdep1,根据GenBank中已有的白僵菌蛋白酶基因设计引物,同源克隆得到了白僵菌的蛋白酶基因Cdep1。经Blast比对,其与白僵菌蛋白酶基因(HQ840791)的序列同源性为99%。其对应的氨基酸序列与碱性丝氨酸蛋白酶(KGQ12177)的同源性为99%,其中第128位的氨基酸由丝氨酸突变为酪氨酸,239位氨基酸由缬氨酸突变为丙氨酸。2.构建了Cdep1蛋白酶的真菌表达载体。以质粒pAN7-1为模板,分别克隆得到启动子GdpA、终止子TrpC。采用重迭PCR的方法,结合降落PCR,构建片段GdpA-Cdep1-TrpC(4021bp)。质粒pBht2和连接片段经过Kpn I和HindIII酶切后,使用T4连接酶将该片段与真菌表达质粒pBht2连接,构建了其表达的重组质粒。3.应用了农杆菌转化法和原生质体转化法转化蜡蚧菌。使用重组质粒转化农杆菌感受态,阳性农杆菌在与蜡蚧菌分生孢子共培养2天后转接到抗性平板中,培养至可见单菌落进行验证,结果获得大量的转化子,随机挑选100个转化子做进一步的鉴定。对蜡蚧菌的原生质体转化的条件进行了优化,结果表明蜡蚧菌孢子以1.5×108的浓度接种到土豆液体培养基中,培养24小时,按照1:40的比例加入复配的30mg/mL的裂解液(溶菌酶:纤维素酶:蜗牛酶=2:1:1),酶解3小时,蜡蚧菌的原生质体数量可以达到1.8×107个/g。4.转化子拷贝数鉴定。根据已报道的单拷贝基因EF1α设计扩增内参引物,采用Beacon Designer设计目的基因引物AM-3,使用荧光定量PCR技术,对28个转化子进行拷贝数检测。在消除扩增效率和扩增片段大小的差异后,结果显示转化子中单拷贝的有9株,两拷贝和叁拷贝的各有1株。保留单拷贝的菌株用于酶活性评价。5.转化子酶生物活力评价。使用紫外分光光度计,通过对蛋白酶水解酪素产生的酪氨酸含量的测定,检测阳性菌株的蛋白酶活力,结果显示,转化子酶活性最高比出发菌株提高了10倍,具有进一步研究的价值。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2016-04-01）
宋妍[2]（2007）在《绿僵菌MA4菌株对椰心叶甲的防效及其表皮降解蛋白酶基因Pr1A的克隆表达和抗血清研究》一文中研究指出外来入侵生物椰心叶甲(Brontispa longissima (Gestro))是亚太地区棕榈科植物的毁灭性害虫,近年传入我国海南省等地后对当地的椰子、槟榔等棕榈科植物的生长造成严重危害,并导致重大经济和生态损失。本文通过室内毒力测定的方法,筛选出一株对椰心叶甲具有高毒力的绿僵菌菌株MA4,对其做了ITS鉴定,并对其表皮降解蛋白酶基因Pr1A进行了克隆表达和抗血清研究,同时就筛选到的高毒力和低毒力菌株研究了在不同培养基上它们的蛋白酶产量与毒力间的关系。主要结果如下:(1)采用土壤分离法和僵虫分离法,获得21株不同来源的绿僵菌。通过对这21株绿僵菌采用2级筛选法进行室内毒力测定,最终确定MA4菌株对椰心叶甲的毒力相对是最高的,为防治椰心叶甲的优势种。(2)对MA4菌株的ITS进行了克隆和测序,并将之与GenBank已登录的ITS序列进行比较,发现与金龟子绿僵菌小孢变种(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)有很高的同源性,达到94.2%,且测出全长为524bp,说明MA4菌株很有可能为金龟子绿僵菌小孢变种。(3)用明胶和椰心叶甲虫尸粉两种液体培养基对高毒力菌株MA4和弱毒力菌株MA12的蛋白酶产酶水平进行分析。两菌株在虫尸粉液体培养基中蛋白酶的产量明显高于明胶液体培养基,且MA4菌株的产酶量高于MA12菌株。此外,用明胶-琼脂平板法对MA4和MA12两株菌株的蛋白酶产量进行了测定,两菌株的最适产蛋白酶的温度都在28℃。不管用明胶-琼脂平板法还是虫尸粉液体培养基,所测得的蛋白酶的产量水平均与其对椰心叶甲的毒力之间存在相对应的关系。(4)Pr1A基因的基因产物Pr1A蛋白具有很强的分解昆虫体壁的功能,在对昆虫的致病力中起着重要的作用。采用RT-PCR的方法,从MA4扩增得到Pr1A基因全长,此基因全长为1242bp,经Blastn分析此基因序列与M. anisopliae的Pr1A基因(M73795)同源率为98%。以pET-22b(+)为基础载体,构建pET-Pr1A重组表达载体,在大肠杆菌(Escherichia. coli )BL 21(DE3)中进行表达。经SDS-PAGE分析,获得了约42kDa大小的重组目的蛋白,表达的目的蛋白最高可占表达总蛋白含量的63.2%。(5)将表达的Pr1A重组蛋白切胶回收,研磨成粉后加入等体积的福氏不完全佐剂,乳化制备成抗原,免疫家兔四次后,采血收集抗血清。该抗血清的ELISA效价为1/1000,并且Western-blotting分析表明Pr1A重组蛋白能与抗血清发生良好的免疫反应,说明获得了Pr1A重组蛋白的抗体。(6)用所获得的Pr1A重组蛋白的抗体进行了免疫斑点杂交实验,检测了上述实验的MA4菌株培养了2d的明胶和虫尸粉液体培养基的蛋白酶液中Pr1A蛋白的表达情况,两者均呈阳性反应,但显色深浅程度有所不同。(本文来源于《华南热带农业大学》期刊2007-05-01）
表皮降解蛋白酶基因论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
外来入侵生物椰心叶甲(Brontispa longissima (Gestro))是亚太地区棕榈科植物的毁灭性害虫,近年传入我国海南省等地后对当地的椰子、槟榔等棕榈科植物的生长造成严重危害,并导致重大经济和生态损失。本文通过室内毒力测定的方法,筛选出一株对椰心叶甲具有高毒力的绿僵菌菌株MA4,对其做了ITS鉴定,并对其表皮降解蛋白酶基因Pr1A进行了克隆表达和抗血清研究,同时就筛选到的高毒力和低毒力菌株研究了在不同培养基上它们的蛋白酶产量与毒力间的关系。主要结果如下:(1)采用土壤分离法和僵虫分离法,获得21株不同来源的绿僵菌。通过对这21株绿僵菌采用2级筛选法进行室内毒力测定,最终确定MA4菌株对椰心叶甲的毒力相对是最高的,为防治椰心叶甲的优势种。(2)对MA4菌株的ITS进行了克隆和测序,并将之与GenBank已登录的ITS序列进行比较,发现与金龟子绿僵菌小孢变种(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)有很高的同源性,达到94.2%,且测出全长为524bp,说明MA4菌株很有可能为金龟子绿僵菌小孢变种。(3)用明胶和椰心叶甲虫尸粉两种液体培养基对高毒力菌株MA4和弱毒力菌株MA12的蛋白酶产酶水平进行分析。两菌株在虫尸粉液体培养基中蛋白酶的产量明显高于明胶液体培养基,且MA4菌株的产酶量高于MA12菌株。此外,用明胶-琼脂平板法对MA4和MA12两株菌株的蛋白酶产量进行了测定,两菌株的最适产蛋白酶的温度都在28℃。不管用明胶-琼脂平板法还是虫尸粉液体培养基,所测得的蛋白酶的产量水平均与其对椰心叶甲的毒力之间存在相对应的关系。(4)Pr1A基因的基因产物Pr1A蛋白具有很强的分解昆虫体壁的功能,在对昆虫的致病力中起着重要的作用。采用RT-PCR的方法,从MA4扩增得到Pr1A基因全长,此基因全长为1242bp,经Blastn分析此基因序列与M. anisopliae的Pr1A基因(M73795)同源率为98%。以pET-22b(+)为基础载体,构建pET-Pr1A重组表达载体,在大肠杆菌(Escherichia. coli )BL 21(DE3)中进行表达。经SDS-PAGE分析,获得了约42kDa大小的重组目的蛋白,表达的目的蛋白最高可占表达总蛋白含量的63.2%。(5)将表达的Pr1A重组蛋白切胶回收,研磨成粉后加入等体积的福氏不完全佐剂,乳化制备成抗原,免疫家兔四次后,采血收集抗血清。该抗血清的ELISA效价为1/1000,并且Western-blotting分析表明Pr1A重组蛋白能与抗血清发生良好的免疫反应,说明获得了Pr1A重组蛋白的抗体。(6)用所获得的Pr1A重组蛋白的抗体进行了免疫斑点杂交实验,检测了上述实验的MA4菌株培养了2d的明胶和虫尸粉液体培养基的蛋白酶液中Pr1A蛋白的表达情况,两者均呈阳性反应,但显色深浅程度有所不同。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
表皮降解蛋白酶基因论文参考文献
[1].张晓林.外源表皮降解蛋白酶基因（Cdep1）转化蜡蚧菌及其酶活性增强效果评价[D].中国农业科学院.2016
[2].宋妍.绿僵菌MA4菌株对椰心叶甲的防效及其表皮降解蛋白酶基因Pr1A的克隆表达和抗血清研究[D].华南热带农业大学.2007