本文主要研究内容
作者魏家强（2019）在《Alteromonas sp. Y-389普鲁兰酶的分子改造及其热稳定性研究》一文中研究指出：普鲁兰酶是一种淀粉脱支酶,它能够专一的水解支链淀粉的α-1,6-糖苷键形成直链淀粉。它可以与α-淀粉酶共同作用,完全地水解淀粉,因而在淀粉加工、啤酒酿造以及功能性药物多糖的工业生产中具有重要的作用。菌株的胞外分泌能力是衡量工程菌株性能的重要指标,高效的分泌能力可以有效的降低生产成本;淀粉的糖化一般都是在60℃、pH 4.5-pH 6.0之间的条件下进行,而且一般糖化时间为48-60小时。因此,提高重组菌株的酸碱适应性、胞外分泌能力与热稳定性对于淀粉加工过程中降低生产成本和改进生产工艺具有重要意义。本论文以Alteromonas sp.Y-389普鲁兰酶（PulA）为研究对象,基于多序列比对与结构域分析,构建了5个结构域截断突变体与4个定点突变体。研究了切除普鲁兰酶的不同结构域、构建不同点突变对其催化活性与酶学性质的影响,最终得到了酶学性质比较好的叠加突变体。主要的研究结果如下:（1）在Alteromonas sp.Y-389普鲁兰酶序列比对分析与结构域分析的基础上,以重组天然酶质粒为模板（PulA+pET-28a）,成功构建了1个N端、4个C端突变体菌株。除Puld4不具有普鲁兰酶的活性之外,其它4个截断突变体均表现出普鲁兰酶活性,而且4个截断突变体的胞外酶分泌效率随着蛋白质分子量的减小而逐渐增强,胞外酶活性占总酶活性的比例分别为13.5%、18.2%、20.1%和30.8%,与PulA重组菌株没有分泌能力相比有了很大的提高。酶学性质的分析表明,截断突变体与PulA的最适pH都为pH 6.0左右,但是截断突变体的作用pH范围变得更窄。Puld1、Puld2和Puld3与天然普鲁兰酶的最适作用温度为35℃,Puld5的最适作用温度为45℃,比天然普鲁兰酶的提高了10℃,半衰期达到了25 h,为天然酶的2.5倍,但是结构域的切除造成的空间结构的变化导致截断突变体与底物结合的能力降低了,随之催化效率也降低了。（2）基于多序列比对以及氨基酸性质分析,选择了保守区域及保守区域周围几个氨基酸作为突变位点,构建了4个定点突变体以及一个叠加突变体。突变体的酶学性质分析结果显示,突变体G603D和F654Y的比活力比重组天然酶的降低了43.7%和8.9%,突变体H611Q和F751L的比活力比重组天然酶的分别升高了64%和30.2%,叠加突变体与截断突变体Puld5相比,其胞外分泌能力提高了4%。除G603D突变体与PulA的最适作用温度都为35℃之外,其它突变体的最适温度都有所提高。除突变体G603D之外,其它普鲁兰酶突变体的热稳定性都有不同程度的提高,PulA的半衰期仅仅只有10 h左右,普鲁兰酶突变体F654Y、H611Q、F751L和Puld5/H611Q的半衰期分别为20 h、20 h、15 h和50 h,分别是天然普鲁兰酶的2倍、2倍、1.5倍和5倍,截断突变体与点突变体的相互叠加使得热稳定性得到了很大的提高。动力学参数分析结果显示,截断突变体的Kcat/Km为天然酶的1.17倍,弥补了只切除结构域造成的催化效率降低的缺点。本研究通过一系列的分子改造,探究了结构域切除以及定点突变对天然普鲁兰酶酶学性质的影响,得到了催化活性与酶学性质较为优良的叠加突变体Puld5/H611Q,为普鲁兰酶的工业化生产奠定了良好的实验基础。
Abstract
pu lu lan mei shi yi chong dian fen tuo zhi mei ,ta neng gou zhuan yi de shui jie zhi lian dian fen de α-1,6-tang gan jian xing cheng zhi lian dian fen 。ta ke yi yu α-dian fen mei gong tong zuo yong ,wan quan de shui jie dian fen ,yin er zai dian fen jia gong 、pi jiu niang zao yi ji gong neng xing yao wu duo tang de gong ye sheng chan zhong ju you chong yao de zuo yong 。jun zhu de bao wai fen bi neng li shi heng liang gong cheng jun zhu xing neng de chong yao zhi biao ,gao xiao de fen bi neng li ke yi you xiao de jiang di sheng chan cheng ben ;dian fen de tang hua yi ban dou shi zai 60℃、pH 4.5-pH 6.0zhi jian de tiao jian xia jin hang ,er ju yi ban tang hua shi jian wei 48-60xiao shi 。yin ci ,di gao chong zu jun zhu de suan jian kuo ying xing 、bao wai fen bi neng li yu re wen ding xing dui yu dian fen jia gong guo cheng zhong jiang di sheng chan cheng ben he gai jin sheng chan gong yi ju you chong yao yi yi 。ben lun wen yi Alteromonas sp.Y-389pu lu lan mei （PulA）wei yan jiu dui xiang ,ji yu duo xu lie bi dui yu jie gou yu fen xi ,gou jian le 5ge jie gou yu jie duan tu bian ti yu 4ge ding dian tu bian ti 。yan jiu le qie chu pu lu lan mei de bu tong jie gou yu 、gou jian bu tong dian tu bian dui ji cui hua huo xing yu mei xue xing zhi de ying xiang ,zui zhong de dao le mei xue xing zhi bi jiao hao de die jia tu bian ti 。zhu yao de yan jiu jie guo ru xia :（1）zai Alteromonas sp.Y-389pu lu lan mei xu lie bi dui fen xi yu jie gou yu fen xi de ji chu shang ,yi chong zu tian ran mei zhi li wei mo ban （PulA+pET-28a）,cheng gong gou jian le 1ge Nduan 、4ge Cduan tu bian ti jun zhu 。chu Puld4bu ju you pu lu lan mei de huo xing zhi wai ,ji ta 4ge jie duan tu bian ti jun biao xian chu pu lu lan mei huo xing ,er ju 4ge jie duan tu bian ti de bao wai mei fen bi xiao lv sui zhao dan bai zhi fen zi liang de jian xiao er zhu jian zeng jiang ,bao wai mei huo xing zhan zong mei huo xing de bi li fen bie wei 13.5%、18.2%、20.1%he 30.8%,yu PulAchong zu jun zhu mei you fen bi neng li xiang bi you le hen da de di gao 。mei xue xing zhi de fen xi biao ming ,jie duan tu bian ti yu PulAde zui kuo pHdou wei pH 6.0zuo you ,dan shi jie duan tu bian ti de zuo yong pHfan wei bian de geng zhai 。Puld1、Puld2he Puld3yu tian ran pu lu lan mei de zui kuo zuo yong wen du wei 35℃,Puld5de zui kuo zuo yong wen du wei 45℃,bi tian ran pu lu lan mei de di gao le 10℃,ban cui ji da dao le 25 h,wei tian ran mei de 2.5bei ,dan shi jie gou yu de qie chu zao cheng de kong jian jie gou de bian hua dao zhi jie duan tu bian ti yu de wu jie ge de neng li jiang di le ,sui zhi cui hua xiao lv ye jiang di le 。（2）ji yu duo xu lie bi dui yi ji an ji suan xing zhi fen xi ,shua ze le bao shou ou yu ji bao shou ou yu zhou wei ji ge an ji suan zuo wei tu bian wei dian ,gou jian le 4ge ding dian tu bian ti yi ji yi ge die jia tu bian ti 。tu bian ti de mei xue xing zhi fen xi jie guo xian shi ,tu bian ti G603Dhe F654Yde bi huo li bi chong zu tian ran mei de jiang di le 43.7%he 8.9%,tu bian ti H611Qhe F751Lde bi huo li bi chong zu tian ran mei de fen bie sheng gao le 64%he 30.2%,die jia tu bian ti yu jie duan tu bian ti Puld5xiang bi ,ji bao wai fen bi neng li di gao le 4%。chu G603Dtu bian ti yu PulAde zui kuo zuo yong wen du dou wei 35℃zhi wai ,ji ta tu bian ti de zui kuo wen du dou you suo di gao 。chu tu bian ti G603Dzhi wai ,ji ta pu lu lan mei tu bian ti de re wen ding xing dou you bu tong cheng du de di gao ,PulAde ban cui ji jin jin zhi you 10 hzuo you ,pu lu lan mei tu bian ti F654Y、H611Q、F751Lhe Puld5/H611Qde ban cui ji fen bie wei 20 h、20 h、15 hhe 50 h,fen bie shi tian ran pu lu lan mei de 2bei 、2bei 、1.5bei he 5bei ,jie duan tu bian ti yu dian tu bian ti de xiang hu die jia shi de re wen ding xing de dao le hen da de di gao 。dong li xue can shu fen xi jie guo xian shi ,jie duan tu bian ti de Kcat/Kmwei tian ran mei de 1.17bei ,mi bu le zhi qie chu jie gou yu zao cheng de cui hua xiao lv jiang di de que dian 。ben yan jiu tong guo yi ji lie de fen zi gai zao ,tan jiu le jie gou yu qie chu yi ji ding dian tu bian dui tian ran pu lu lan mei mei xue xing zhi de ying xiang ,de dao le cui hua huo xing yu mei xue xing zhi jiao wei you liang de die jia tu bian ti Puld5/H611Q,wei pu lu lan mei de gong ye hua sheng chan dian ding le liang hao de shi yan ji chu 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自自然资源部第一海洋研究所的魏家强，发表于刊物自然资源部第一海洋研究所2019-10-08论文，是一篇关于普鲁兰酶论文,分子改造论文,热稳定性论文,胞外分泌论文,酶学性质论文,自然资源部第一海洋研究所2019-10-08论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自自然资源部第一海洋研究所2019-10-08论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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