导读:本文包含了微血管内皮细胞疫苗论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:微血管内皮细胞疫苗,肿瘤细胞疫苗,Lewis肺癌,小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3s)
微血管内皮细胞疫苗论文文献综述
李姗[1]（2009）在《微血管内皮细胞疫苗和肿瘤细胞疫苗诱导小鼠抗Lewis肺癌免疫效应对比研究》一文中研究指出研究背景:肺癌是近年来发病率和病死率增长最快,对人类健康和生命威胁最大的肿瘤之一。近年人们研究通过刺激机体的免疫系统来抵抗癌症取得了一定的进展,免疫疗法成为治疗肺癌的有效新方法。用肿瘤细胞疫苗去治疗肺癌属于免疫疗法的一种,肿瘤疫苗(tumor cells vaccine)是将具有抗原性的疫苗输入体内,刺激机体免疫系统产生抗肿瘤免疫效应,从而治疗肿瘤。肿瘤疫苗发挥抗肿瘤作用的机理主要是其表达的肿瘤抗原,尤其是特异性的肿瘤抗原,进入体内后能诱导机体产生对肿瘤特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTLs),进而杀伤肿瘤细胞。然而,肿瘤细胞能够逃避免疫监视,这不仅仅是因为遗传免疫耐受抑制肿瘤特异性抗原的表达,而且肿瘤细胞还可以通过后天获得的能力改变特异表型,减少人类白细胞抗原(human leucocyte antigen,HLA)分子的表达和激活肿瘤微环境中免疫抑制剂的分泌从而抑制抗肿瘤免疫应答;同时,不同组织中的肿瘤细胞不仅不同而且遗传学特性不稳定;另外,在肿瘤微环境中,免疫细胞很难完全发挥其细胞毒性作用。这些原因使得肿瘤疫苗的应用有一定的局限性。20世纪70年代初期Harvard大学Folkman教授提出实体肿瘤的生长和转移依赖于新生血管的生成。在正常人体组织内,血管生成很少发生是因为血管生成抑制因子和血管生成刺激因子处于相对平衡状态。当肿瘤直径小于2-3mm时,肿瘤组织主要靠周围组织的弥散作用来获得氧气和营养物质。但是当肿瘤直径超过2-3mm,“血管生成限制器”因为血供不足而无法工作,在缺氧的条件下,肿瘤细胞和间质细胞像巨噬细胞那样,在血管生成刺激因子分泌物的作用下打开血管生成开关,激活内皮细胞及其前体,生成新的血管。这时,肿瘤呈指数生长,显现出无限制扩张的趋势。血管内皮细胞疫苗以肿瘤血管为靶点,抑制肿瘤血管的形成或破坏已形成的肿瘤血管,从而阻断肿瘤细胞的营养来源和迁移通道,这已经成为抗肿瘤治疗的重要策略。目前,肿瘤细胞疫苗国内外研究的较多,但是血管内皮细胞疫苗(vascularendothelial cells vaccine)仅有少量报道,究竟两种疫苗哪种抗肿瘤效果更为理想还有待进一步研究。实验目的:本实验是通过将小鼠脑微血管内皮细胞(bEnd.3s)疫苗和小鼠Lewis肺癌细胞(LLCs)疫苗接种小鼠后,观察疫苗对小鼠Lewis肺癌的抑瘤效应,进一步探讨两种疫苗诱导小鼠抗Lewis肺癌免疫效应的机制。实验方法:1.体外实验:将bEnd.3s和LLCs制备成冻融抗原致敏树突状细胞(dendritic cells,DCs),CCK-8检测冻融抗原致敏的DCs刺激T淋巴细胞增殖能力;MTT法检测冻融抗原致敏的DCs诱导的CTLs对靶细胞特异性的杀伤率。2.体内实验:将bEnd.3s细胞和LLCs细胞制备成疫苗,免疫C57BL/6小鼠后小鼠皮下荷LLCs,接下来的90天观察小鼠皮下移植瘤生长情况、生存期及对免疫小鼠不良反应进行检测;流式细胞术检测免疫小鼠脾T淋巴细胞表面CD3ε、CD8α的表达,CCK-8检测免疫小鼠脾T淋巴细胞特异性的杀伤率;ELISA、Western blot检测免疫小鼠抗血清特异性抗体。3.用SPSS13.0统计软件,小鼠生存率采用Kaplan-Meier法;T淋巴细胞增殖实验、小鼠皮下移植瘤体积、ELISA结果用(?)±s表示;流式细胞术检测结果、CTLs杀伤率用[((?)±s)%]表示;均采用方差分析进行比较,进一步用LSD法做两两比较,检验水准均为α=0.05。实验结果:1.体外实验结果:bEnd.3抗原致敏的DCs组和LLC抗原致敏的DCs组刺激Ts淋巴细胞增殖能力明显高于DCs组和Ts组(P＜0.05);bEnd.3抗原致敏的DCs诱导的CTLs和LLC抗原致敏的DCs诱导的CTLs对各自靶细胞的杀伤率在效靶比30:1时均高于各自的对照组(P＜0.05)。2.体内实验结果:(1)bEnd.3s组和LLCs组小鼠肿瘤体积明显小于PBS组小鼠肿瘤体积,其中bEnd.3s组小鼠肿瘤体积最小,且各组差异有统计学意义(P＜0.05);病理HE染色证实bEnd.3s组小鼠荷瘤部位未发现肿瘤组织,LLCs组和PBS组小鼠荷瘤部位为肿瘤组织;bEnd.3s组小鼠可长期无瘤生存,LLCs组小鼠中位生存期为81天,PBS组小鼠中位生存期为44天;bEnd.3s组小鼠与LLCs组和PBS组小鼠相比,伤口愈合缓慢。(2)流式细胞术检测结果:bEnd.3s组小鼠脾T淋巴细胞表面CD3ε、CD8α表达率为17.8%,LLCs组为14.7%,PBS组为10.7%,且各组差异有统计学意义(P＜0.05)。(3)CCK-8结果:bEnd.3疫苗和LLC疫苗免疫的小鼠均能产生特异性杀伤各自靶细胞的CTLs。bEnd.3s组小鼠产生靶向杀伤bEnd.3s的CTLs,而LLCs组小鼠产生靶向杀伤LLCs的CTLs,与各自对照组相比,差异有统计学意义(P＜0.05)。(4)ELISA检测结果:bEnd.3s组小鼠抗血清抗体滴度为1:1600,而LLCs组小鼠抗血清抗体滴度为1:800。bEnd.3s组小鼠血清与bEnd.3膜蛋白有抗原抗体反应,与LLC膜蛋白没有抗原抗体反应;LLCs组小鼠血清与LLC膜蛋白有抗原抗体反应,与bEnd.3膜蛋白没有抗原抗体反应。(5)Western blot结果:bEnd.3s组小鼠血清能与bEnd.3膜蛋白反应出现多个阳性带,其中220KD与血管内皮生长因子受体-2(VEGFR-2)分子量一致,180KD与Endoglin分子量一致,LLCs组小鼠血清能与LLC膜蛋白反应出现阳性带,200KD与癌胚抗原(CEA)分子量一致。实验结论:1.微血管内皮细胞疫苗和肿瘤细胞疫苗均能诱导小鼠抑制Lewis肺癌皮下移植瘤生长,延长生存期,其机制是两种疫苗均能诱导小鼠产生特异性的细胞免疫和体液免疫。2.微血管内皮细胞疫苗抑制小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤效果优于肿瘤细胞疫苗。(本文来源于《郑州大学》期刊2009-05-26）
赵军[2]（2009）在《同种脑微血管内皮细胞疫苗诱导小鼠抗肺癌血管内皮细胞免疫效应研究》一文中研究指出目前,肺癌的发病率和死亡率在世界范围内均居癌症之首。20世纪90年代与70年代相比,我国肺癌的死亡率上升了111.85%。肺癌的治疗仍以手术切除为主,辅以化疗和放疗,但转移和死亡率仍居高不下,这也是肺癌治疗失败的原因,因此,研究新的肺癌治疗方法显得非常必要。随着免疫学、分子生物学和基因工程技术的不断发展,以免疫治疗为代表的肿瘤生物治疗受到了人们的高度重视,已经成为继手术、化疗和放疗以后的第四种肿瘤治疗模式,它主要通过调动或增强机体内部固有的抗肿瘤能力来抑制肿瘤生长,可以避免当前肿瘤治疗模式的严重不足之处,展示了良好的临床应用前景。肺癌的靶向治疗是生物治疗的一种模式,目前已有研制成功和上市的肺癌的靶向治疗药物,大多是一些单克隆抗体制剂,包括Iressa、Tarceva、Veenat、Sutent和Sorafenib Nexavar等,基本上也都是靶向肿瘤血管上的特异性蛋白分子。虽然这些药物在一定程度上抑制了肺癌的生长,延长了患者的生存期。但是大量的循证医学研究证实,它们的疗效不尽人意。长期使用单克隆抗体还会出现严重的不良反应,并且价格昂贵,这些都限制了它们的临床使用。以肿瘤血管内皮细胞为靶点的主动免疫治疗维持的时间较长,无需频繁的反复给药;且特异性的体液免疫反应或细胞免疫反应副作用较小,所以诱导抗肿瘤血管的主动免疫效应是一种更有效的治疗方法。肿瘤血管内皮细胞处于活跃增殖状态,其细胞膜上表达多种与细胞增殖相关的特异性蛋白分子,是血管内皮细胞增殖相关抗原,如血管内皮细胞生长因子受体Ⅱ(Vascular Endothelial GrowthFactor Receptor,VEGFR-Ⅱ)、整合素av(CD51)、组织因子、Endoglin(CD105)等,这些蛋白分子在体内静止期的血管内皮细胞上却不表达。研究表明,利用体外培养的增殖活跃的异种血管内皮细胞制备疫苗,可以成功打破免疫耐受,诱导抗肿瘤血管生成。近来,用异种血管内皮细胞增殖相关蛋白和DNA分子疫苗相关研究较多,以同种蛋白和DNA分子疫苗也有报道,但由于引起的超敏反应、单一靶点的治疗效果的局限性,备受争议,寻找多靶点治疗且副作用少的主动免疫治疗方法势在必行。本研究对来源于微血管的小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3进行体外培养,制备疫苗,免疫小鼠并观察其对肺癌皮下移植瘤、肺转移癌的抗肿瘤效应。另一方面,本研究应用小鼠bEnd.3制备抗原,冲击树突状细胞(Dendritic Cells,DCs),观察其诱导的体内外特异性抗肿瘤血管生成的免疫反应,并初步探索其机制,试图寻找一种新的抗肿瘤血管治疗方法。人脐静脉血管内皮细胞(Human UmbilicalVein Endothelial Cells,HUVEC)来源于大的静脉血管,多项研究报道异种HUVEC有抗肿瘤血管生成的作用,因此,本研究用异种HUVEC和同种小鼠成纤维细胞(NIH3T3)作对照,来观察不同来源的两个血管内皮细胞的抗肿瘤血管生成作用。第一部分同种bEnd.3细胞疫苗诱导小鼠抗肺癌血管内皮细胞的免疫效应第一章同种bEnd.3细胞的培养及疫苗制备方法:1.体外常规培养小鼠bEnd.3细胞,从人脐带分离培养HUVEC,体外扩增,通过细胞表面标志vWF、CD31和CD144的细胞免疫组化和RT-PCR方法鉴定两种细胞。2.利用RT-PCR方法检测血管内皮细胞增殖相关抗原VEGFR-Ⅱ和整合素av基因在bEnd.3、HUVEC、NIH3T3、肿瘤细胞LLCs和U14的表达。3.bEnd.3、HUVEC、NIH3T3细胞在体外大量扩增后,用0.025%戊二醛固定制备疫苗,疫苗浓度2.5×10~7/ml。结果:1.成功培养和体外大量扩增了小鼠bEnd.3细胞和人HUVEC细胞,它们均分别高表达vWF、CD31和vWF、CD144等血管内皮细胞标志。2.在mRNA水平,bEnd.3细胞和HUVEC细胞同时表达VEGFR-Ⅱ和整合素av基因,NIH3T3细胞不表达VEGFR-Ⅱ和整合素av基因,肿瘤细胞LLCs和U14均只表达整合素av,不表达VEGFR-Ⅱ。3.用0.025%戊二醛成功制备疫苗。第二章同种bEnd.3疫苗诱导小鼠对Lewis肺癌皮下移植瘤免疫效应检测方法:1.小鼠分预防组和治疗组,治疗组又分为血清治疗组和T淋巴细胞治疗组,疫苗分bEnd.3组、HUVEC组、NIH3T3组和PBS组。预防组直接用疫苗免疫小鼠,一周一次,5×10~6个细胞/只,腋窝淋巴结周围皮下注射,共5次,最后一次免疫后一周,皮下注射小鼠Lewis肺癌细胞。治疗组用ELISA检测阳性的免疫小鼠的抗血清和脾T淋巴细胞进行治疗,血清治疗组,在荷瘤一周后,肌肉注射50μl/只,隔日注射一次,共6次。T淋巴细胞组,在荷瘤一周后,肿瘤周围注射1×10~7个脾T细胞,隔日注射一次,共6次。2.观察小鼠肿瘤体积,小鼠生存期;HE染色观察瘤体组织变化。CCK法和流式细胞术对免疫小鼠脾T淋巴细胞CTLs杀伤活性的检测。ELISA法、免疫细胞化学法和Western blot法对免疫小鼠抗血清的特异性反应检测。3.不良反应检测在免疫后2周的小鼠腹壁上划“十”字伤口,观察其伤口愈合情况。结果:1.抑制了小鼠肺癌皮下移植瘤的生长和延长了生存期在小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤预防组中,bEnd.3组小鼠肿瘤生长速度缓慢,而且在生长3周肿瘤体积明显减小约20mm~3,之后处于相对停滞状态,与对照组有统计学差异(P＜0.05)。中位生存时间bEnd.3组为90天(终止实验),较对照组明显延长(P＜0.01)。瘤体剥离后HE染色发现,bEnd.3组为脂肪和肌肉组织,无癌细胞,而NIH3T3和PBS组均是癌细胞。T细胞治疗组和血清治疗组中,bEnd.3组小鼠肿瘤生长速度减慢,生存时间较NIH3T3和PBS组长(P＜0.05)。但T细胞治疗组较血清治疗组更能延长小鼠生存时间(P＜0.05)。2.诱导了免疫小鼠脾T淋巴细胞靶向血管内皮细胞的特异性CTLs杀伤活性流式细胞术检测bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组CD3~+CD8~+的T细胞百分比高于对照组(P＜0.05),CCK法检测bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组在效:靶为25:1时脾T淋巴细胞具有较强的杀伤体外增殖的bEnd.3细胞和HUVEC细胞的CTLs杀伤活性(P＜0.05),而对LLCs肺癌细胞却没有杀伤活性。3.诱导了免疫小鼠血清的特异性抗体产生ELISA结果提示细胞免疫组化结果提示bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组抗血清与体外bEnd.3和HUVEC膜蛋白和细胞有特异性免疫反应,并能对体外增殖的bEnd.3细胞和HUVEC细胞起到抑制作用;Western blot检测bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组抗血清在220 KD和180 KD处均出现了特异性条带,而HUVEC组在130 KD处有特异性条带,bEnd.3组在130 KD处无特异性条带,两组抗血清与LLCs膜蛋白无特异性反应及条带。4.延迟了伤口愈合bEnd.3组和HUVEC组免疫小鼠的伤口愈合时间较NIH3T3组和PBS组长(P＜0.05),但均能完全愈合。第叁章同种bEnd.3疫苗诱导小鼠对宫颈癌U14肺转移癌的免疫效应检测方法:1.小鼠分预防组和治疗组,疫苗分bEnd.3组、HUVEC组、NIH3T3组和PBS组。预防组直接用疫苗免疫小鼠,一周一次,5×10~6个细胞/只,腋窝淋巴结周围皮下注射,共5次,最后一次免疫后一周,尾静脉注射小鼠U14细胞5×10~6个细胞/只。治疗组先尾静脉注射小鼠U14细胞5×10~6个细胞/只,然后用疫苗治疗小鼠,于第1,3,5,7,9和11天在小鼠腋窝淋巴结周围皮下注射,共6次。2.观察计算小鼠肺表面转移癌结节数;小鼠生存期;HE染色观察转移癌组织变化;CFSE和PI法检测免疫小鼠脾T淋巴细胞CTLs杀伤活性;流式细胞术检测CD3~+CD8~+细胞百分比;ELISA法、免疫细胞化学法和Western blot检测抗血清的特异性反应。结果:1.抑制了小鼠宫颈癌U14肺转移癌的转移和延长了生存期bEnd.3组和HUVEC组左肺癌结节数明显少于NIH3T3组和PBS组(P＜0.05),以预防组更明显;bEnd.3组中位生存时间,预防组可达34天,治疗组26天,而对照组只有19天,预防组生存时间明显延长(P＜0.05)。2.诱导了免疫小鼠脾T淋巴细胞靶向血管内皮细胞的特异性CTLs杀伤活性流式细胞术检测bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组CD3~+CD8~+的T细胞百分比高于对照组(P＜0.05),CFSE和PI法检测bEnd.3组免疫小鼠脾T淋巴细胞具有杀伤体外增殖的bEnd.3细胞CTLs杀伤活性,HUVEC组也有一致的结果;对U14细胞却没有杀伤活性。3.诱导了免疫小鼠血清的特异性抗体产生ELISA和细胞免疫组化结果提示bEnd.3组和HUVEC组抗血清与体外bEnd.3和HUVEC膜蛋白和细胞有特异性免疫反应,并能对其体外增殖起到抑制作用;U14小鼠抗血清与bEnd.3膜蛋白有特异性反应发生,Western blot检测bEnd.3抗血清在220 KD和180 KD处出现了特异性条带,在130 KD处无特异性条带,在HUVEC组在220 KD和130 KD处均有特异性条带,在180KD处却无特异性条带;二者与U14膜蛋白无特异性条带产生。第二部分同种bEnd.3细胞抗原致敏DCs诱导小鼠对肺癌血管内皮细胞的免疫效应第一章小鼠bEnd.3抗原制备和小鼠骨髓源DCs培养及鉴定方法:1.收集bEnd.3细胞,反复冻融4次制备抗原。2.体外培养小鼠骨髓来源的DCs,并进行形态学和细胞表面CD11a和CD86表达鉴定。3.抗原以100μg/ml浓度负载DCs。结果:1.根据台盼蓝染色检测细胞冻融效果好,抗原定量检测结果显示1×10~7个细胞能够收获398.98±96.36μg抗原。2.成功培养小鼠骨髓来源的DCs,经鉴定培养至第8天成为成熟DCs。第二章负载bEnd.3抗原的DCs对体外增殖的血管内皮细胞的影响方法:1.分别负载bEnd.3、HUVEC和NIH3T3抗原的DCs培养8天成熟后,与小鼠脾T淋巴细胞混合培养3天,诱导CTLs,CCK法观察T淋巴细胞体外增殖情况。2.将CTLs与靶细胞bEnd.3、HUVEC和LLCs混合培养3天,MTT法观察其体外杀伤作用。结果:1.体外促进了小鼠脾T淋巴细胞的增殖CCK法检测负载bEnd.3抗原和HUVEC抗原的DCs在体外能够促进小鼠脾T淋巴细胞的增殖,负载NIH3T3抗原的DCs也可促进小鼠脾T淋巴细胞的增殖(P＜0.05)。2.体外诱导了内皮细胞特异的CTLs杀伤活性MTT法负载bEnd.3抗原和HUVEC抗原的DCs有明显杀伤bEnd.3细胞和HUVEC细胞的作用(P＜0.05),负载NIH3T3抗原的DCs体外诱导的CTLs对bEnd.3细胞和HUVEC细胞无明显杀伤作用。第叁章bEnd.3抗原负载的DCs疫苗诱导小鼠对Lewis肺癌皮下移植瘤免疫效应检测方法:1.负载bEnd.3抗原的DCs培养第8天成熟后,收集制备疫苗。疫苗分为bEnd.3DCs组、HUVECDCs组、NIH3T3DCs组、DCs组和PBS组。直接用疫苗免疫小鼠,一周一次,1×10~6个细胞/只,腋窝淋巴结周围皮下注射,共5次,最后一次免疫后一周,皮下注射小鼠Lewis肺癌细胞。2.观察小鼠瘤体增长速度和生存期;检测免疫小鼠脾T淋巴细胞CTLs杀伤活性和免疫小鼠抗血清的特异性反应。结果:1.抑制了小鼠肺癌皮下移植瘤的生长和延长了生存期负载bEnd.3抗原的DCs培养8天成熟后,制备疫苗,免疫小鼠后,bEnd.3DCs组小鼠肿瘤生长速度缓慢,与NIH3T3DCs组和DCs组比较有统计学差异(P＜0.05)。而NIH3T3DCs组和DCs组肿瘤生长速度又比PBS组慢(P＜0.05)。中位生存时间bEnd.3DCs组为65天,NIH3T3DCs组和DCs组分别为55和57天,较对照组明显延长(P＜0.05)。2.诱导了免疫小鼠脾T淋巴细胞靶向血管内皮细胞的特异性CTLs杀伤CCK法检测bEnd.3DCs组免疫小鼠脾T淋巴细胞具有杀伤体外增殖的bEnd.3细胞CTLs杀伤活性,流式细胞检测结果提示bEnd.3DCs组CD3~+CD8~+的T细胞百分比高于对照组(P＜0.05)。3.诱导了免疫小鼠血清的特异性抗体产生ELISA检测荷瘤前后免疫抗血清特异性结果示,荷瘤前后bEnd.3DCs抗血清与bEnd.3的免疫效应无明显差异(P＞0.05),而荷瘤后的小鼠抗血清中,除PBS组,均能与bEnd.3和LLCs膜蛋白发生反应。Western blot检测bEnd.3DCs组抗血清在220 KD和180 KD处也出现了特异性条带,在130 KD处无特异性条带,HUVECDCs组在220 KD、180 KD和130 KD处均有特异性条带,与LLCs膜蛋白无特异性反应及条带。结论1.同种小鼠bEnd.3细胞疫苗和负载小鼠bEnd.3抗原的DCs疫苗可抑制小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤和小鼠宫颈癌U14肺转移癌的生长和转移,延长了小鼠生存期,预防组抑瘤效果优于治疗组。2.抑瘤效应机制是在体内诱导形成靶向增殖血管内皮细胞的CTLs,诱导产生了抗VEGFR-Ⅱ抗体、抗Endoglin抗体和抗整合素av抗体等血管内皮细胞增殖相关抗体,诱导了抗肿瘤血管的细胞和体液免疫反应,抑制肿瘤的生长。3.内皮细胞疫苗能延长伤口愈合时间,但不影响其最终愈合。4.同种bEnd.3疫苗和异种HUVEC疫苗均能诱导抗肿瘤血管的主动免疫反应,二者抑瘤作用无明显差异。5.bEnd.3的两种疫苗形式之间的抑瘤作用有差异,整个血管内皮细胞疫苗较负载血管内皮细胞抗原的DCs疫苗似乎更有优势。(本文来源于《郑州大学》期刊2009-05-01）
微血管内皮细胞疫苗论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目前,肺癌的发病率和死亡率在世界范围内均居癌症之首。20世纪90年代与70年代相比,我国肺癌的死亡率上升了111.85%。肺癌的治疗仍以手术切除为主,辅以化疗和放疗,但转移和死亡率仍居高不下,这也是肺癌治疗失败的原因,因此,研究新的肺癌治疗方法显得非常必要。随着免疫学、分子生物学和基因工程技术的不断发展,以免疫治疗为代表的肿瘤生物治疗受到了人们的高度重视,已经成为继手术、化疗和放疗以后的第四种肿瘤治疗模式,它主要通过调动或增强机体内部固有的抗肿瘤能力来抑制肿瘤生长,可以避免当前肿瘤治疗模式的严重不足之处,展示了良好的临床应用前景。肺癌的靶向治疗是生物治疗的一种模式,目前已有研制成功和上市的肺癌的靶向治疗药物,大多是一些单克隆抗体制剂,包括Iressa、Tarceva、Veenat、Sutent和Sorafenib Nexavar等,基本上也都是靶向肿瘤血管上的特异性蛋白分子。虽然这些药物在一定程度上抑制了肺癌的生长,延长了患者的生存期。但是大量的循证医学研究证实,它们的疗效不尽人意。长期使用单克隆抗体还会出现严重的不良反应,并且价格昂贵,这些都限制了它们的临床使用。以肿瘤血管内皮细胞为靶点的主动免疫治疗维持的时间较长,无需频繁的反复给药;且特异性的体液免疫反应或细胞免疫反应副作用较小,所以诱导抗肿瘤血管的主动免疫效应是一种更有效的治疗方法。肿瘤血管内皮细胞处于活跃增殖状态,其细胞膜上表达多种与细胞增殖相关的特异性蛋白分子,是血管内皮细胞增殖相关抗原,如血管内皮细胞生长因子受体Ⅱ(Vascular Endothelial GrowthFactor Receptor,VEGFR-Ⅱ)、整合素av(CD51)、组织因子、Endoglin(CD105)等,这些蛋白分子在体内静止期的血管内皮细胞上却不表达。研究表明,利用体外培养的增殖活跃的异种血管内皮细胞制备疫苗,可以成功打破免疫耐受,诱导抗肿瘤血管生成。近来,用异种血管内皮细胞增殖相关蛋白和DNA分子疫苗相关研究较多,以同种蛋白和DNA分子疫苗也有报道,但由于引起的超敏反应、单一靶点的治疗效果的局限性,备受争议,寻找多靶点治疗且副作用少的主动免疫治疗方法势在必行。本研究对来源于微血管的小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3进行体外培养,制备疫苗,免疫小鼠并观察其对肺癌皮下移植瘤、肺转移癌的抗肿瘤效应。另一方面,本研究应用小鼠bEnd.3制备抗原,冲击树突状细胞(Dendritic Cells,DCs),观察其诱导的体内外特异性抗肿瘤血管生成的免疫反应,并初步探索其机制,试图寻找一种新的抗肿瘤血管治疗方法。人脐静脉血管内皮细胞(Human UmbilicalVein Endothelial Cells,HUVEC)来源于大的静脉血管,多项研究报道异种HUVEC有抗肿瘤血管生成的作用,因此,本研究用异种HUVEC和同种小鼠成纤维细胞(NIH3T3)作对照,来观察不同来源的两个血管内皮细胞的抗肿瘤血管生成作用。第一部分同种bEnd.3细胞疫苗诱导小鼠抗肺癌血管内皮细胞的免疫效应第一章同种bEnd.3细胞的培养及疫苗制备方法:1.体外常规培养小鼠bEnd.3细胞,从人脐带分离培养HUVEC,体外扩增,通过细胞表面标志vWF、CD31和CD144的细胞免疫组化和RT-PCR方法鉴定两种细胞。2.利用RT-PCR方法检测血管内皮细胞增殖相关抗原VEGFR-Ⅱ和整合素av基因在bEnd.3、HUVEC、NIH3T3、肿瘤细胞LLCs和U14的表达。3.bEnd.3、HUVEC、NIH3T3细胞在体外大量扩增后,用0.025%戊二醛固定制备疫苗,疫苗浓度2.5×10~7/ml。结果:1.成功培养和体外大量扩增了小鼠bEnd.3细胞和人HUVEC细胞,它们均分别高表达vWF、CD31和vWF、CD144等血管内皮细胞标志。2.在mRNA水平,bEnd.3细胞和HUVEC细胞同时表达VEGFR-Ⅱ和整合素av基因,NIH3T3细胞不表达VEGFR-Ⅱ和整合素av基因,肿瘤细胞LLCs和U14均只表达整合素av,不表达VEGFR-Ⅱ。3.用0.025%戊二醛成功制备疫苗。第二章同种bEnd.3疫苗诱导小鼠对Lewis肺癌皮下移植瘤免疫效应检测方法:1.小鼠分预防组和治疗组,治疗组又分为血清治疗组和T淋巴细胞治疗组,疫苗分bEnd.3组、HUVEC组、NIH3T3组和PBS组。预防组直接用疫苗免疫小鼠,一周一次,5×10~6个细胞/只,腋窝淋巴结周围皮下注射,共5次,最后一次免疫后一周,皮下注射小鼠Lewis肺癌细胞。治疗组用ELISA检测阳性的免疫小鼠的抗血清和脾T淋巴细胞进行治疗,血清治疗组,在荷瘤一周后,肌肉注射50μl/只,隔日注射一次,共6次。T淋巴细胞组,在荷瘤一周后,肿瘤周围注射1×10~7个脾T细胞,隔日注射一次,共6次。2.观察小鼠肿瘤体积,小鼠生存期;HE染色观察瘤体组织变化。CCK法和流式细胞术对免疫小鼠脾T淋巴细胞CTLs杀伤活性的检测。ELISA法、免疫细胞化学法和Western blot法对免疫小鼠抗血清的特异性反应检测。3.不良反应检测在免疫后2周的小鼠腹壁上划“十”字伤口,观察其伤口愈合情况。结果:1.抑制了小鼠肺癌皮下移植瘤的生长和延长了生存期在小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤预防组中,bEnd.3组小鼠肿瘤生长速度缓慢,而且在生长3周肿瘤体积明显减小约20mm~3,之后处于相对停滞状态,与对照组有统计学差异(P＜0.05)。中位生存时间bEnd.3组为90天(终止实验),较对照组明显延长(P＜0.01)。瘤体剥离后HE染色发现,bEnd.3组为脂肪和肌肉组织,无癌细胞,而NIH3T3和PBS组均是癌细胞。T细胞治疗组和血清治疗组中,bEnd.3组小鼠肿瘤生长速度减慢,生存时间较NIH3T3和PBS组长(P＜0.05)。但T细胞治疗组较血清治疗组更能延长小鼠生存时间(P＜0.05)。2.诱导了免疫小鼠脾T淋巴细胞靶向血管内皮细胞的特异性CTLs杀伤活性流式细胞术检测bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组CD3~+CD8~+的T细胞百分比高于对照组(P＜0.05),CCK法检测bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组在效:靶为25:1时脾T淋巴细胞具有较强的杀伤体外增殖的bEnd.3细胞和HUVEC细胞的CTLs杀伤活性(P＜0.05),而对LLCs肺癌细胞却没有杀伤活性。3.诱导了免疫小鼠血清的特异性抗体产生ELISA结果提示细胞免疫组化结果提示bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组抗血清与体外bEnd.3和HUVEC膜蛋白和细胞有特异性免疫反应,并能对体外增殖的bEnd.3细胞和HUVEC细胞起到抑制作用;Western blot检测bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组抗血清在220 KD和180 KD处均出现了特异性条带,而HUVEC组在130 KD处有特异性条带,bEnd.3组在130 KD处无特异性条带,两组抗血清与LLCs膜蛋白无特异性反应及条带。4.延迟了伤口愈合bEnd.3组和HUVEC组免疫小鼠的伤口愈合时间较NIH3T3组和PBS组长(P＜0.05),但均能完全愈合。第叁章同种bEnd.3疫苗诱导小鼠对宫颈癌U14肺转移癌的免疫效应检测方法:1.小鼠分预防组和治疗组,疫苗分bEnd.3组、HUVEC组、NIH3T3组和PBS组。预防组直接用疫苗免疫小鼠,一周一次,5×10~6个细胞/只,腋窝淋巴结周围皮下注射,共5次,最后一次免疫后一周,尾静脉注射小鼠U14细胞5×10~6个细胞/只。治疗组先尾静脉注射小鼠U14细胞5×10~6个细胞/只,然后用疫苗治疗小鼠,于第1,3,5,7,9和11天在小鼠腋窝淋巴结周围皮下注射,共6次。2.观察计算小鼠肺表面转移癌结节数;小鼠生存期;HE染色观察转移癌组织变化;CFSE和PI法检测免疫小鼠脾T淋巴细胞CTLs杀伤活性;流式细胞术检测CD3~+CD8~+细胞百分比;ELISA法、免疫细胞化学法和Western blot检测抗血清的特异性反应。结果:1.抑制了小鼠宫颈癌U14肺转移癌的转移和延长了生存期bEnd.3组和HUVEC组左肺癌结节数明显少于NIH3T3组和PBS组(P＜0.05),以预防组更明显;bEnd.3组中位生存时间,预防组可达34天,治疗组26天,而对照组只有19天,预防组生存时间明显延长(P＜0.05)。2.诱导了免疫小鼠脾T淋巴细胞靶向血管内皮细胞的特异性CTLs杀伤活性流式细胞术检测bEnd.3免疫组和HUVEC免疫组CD3~+CD8~+的T细胞百分比高于对照组(P＜0.05),CFSE和PI法检测bEnd.3组免疫小鼠脾T淋巴细胞具有杀伤体外增殖的bEnd.3细胞CTLs杀伤活性,HUVEC组也有一致的结果;对U14细胞却没有杀伤活性。3.诱导了免疫小鼠血清的特异性抗体产生ELISA和细胞免疫组化结果提示bEnd.3组和HUVEC组抗血清与体外bEnd.3和HUVEC膜蛋白和细胞有特异性免疫反应,并能对其体外增殖起到抑制作用;U14小鼠抗血清与bEnd.3膜蛋白有特异性反应发生,Western blot检测bEnd.3抗血清在220 KD和180 KD处出现了特异性条带,在130 KD处无特异性条带,在HUVEC组在220 KD和130 KD处均有特异性条带,在180KD处却无特异性条带;二者与U14膜蛋白无特异性条带产生。第二部分同种bEnd.3细胞抗原致敏DCs诱导小鼠对肺癌血管内皮细胞的免疫效应第一章小鼠bEnd.3抗原制备和小鼠骨髓源DCs培养及鉴定方法:1.收集bEnd.3细胞,反复冻融4次制备抗原。2.体外培养小鼠骨髓来源的DCs,并进行形态学和细胞表面CD11a和CD86表达鉴定。3.抗原以100μg/ml浓度负载DCs。结果:1.根据台盼蓝染色检测细胞冻融效果好,抗原定量检测结果显示1×10~7个细胞能够收获398.98±96.36μg抗原。2.成功培养小鼠骨髓来源的DCs,经鉴定培养至第8天成为成熟DCs。第二章负载bEnd.3抗原的DCs对体外增殖的血管内皮细胞的影响方法:1.分别负载bEnd.3、HUVEC和NIH3T3抗原的DCs培养8天成熟后,与小鼠脾T淋巴细胞混合培养3天,诱导CTLs,CCK法观察T淋巴细胞体外增殖情况。2.将CTLs与靶细胞bEnd.3、HUVEC和LLCs混合培养3天,MTT法观察其体外杀伤作用。结果:1.体外促进了小鼠脾T淋巴细胞的增殖CCK法检测负载bEnd.3抗原和HUVEC抗原的DCs在体外能够促进小鼠脾T淋巴细胞的增殖,负载NIH3T3抗原的DCs也可促进小鼠脾T淋巴细胞的增殖(P＜0.05)。2.体外诱导了内皮细胞特异的CTLs杀伤活性MTT法负载bEnd.3抗原和HUVEC抗原的DCs有明显杀伤bEnd.3细胞和HUVEC细胞的作用(P＜0.05),负载NIH3T3抗原的DCs体外诱导的CTLs对bEnd.3细胞和HUVEC细胞无明显杀伤作用。第叁章bEnd.3抗原负载的DCs疫苗诱导小鼠对Lewis肺癌皮下移植瘤免疫效应检测方法:1.负载bEnd.3抗原的DCs培养第8天成熟后,收集制备疫苗。疫苗分为bEnd.3DCs组、HUVECDCs组、NIH3T3DCs组、DCs组和PBS组。直接用疫苗免疫小鼠,一周一次,1×10~6个细胞/只,腋窝淋巴结周围皮下注射,共5次,最后一次免疫后一周,皮下注射小鼠Lewis肺癌细胞。2.观察小鼠瘤体增长速度和生存期;检测免疫小鼠脾T淋巴细胞CTLs杀伤活性和免疫小鼠抗血清的特异性反应。结果:1.抑制了小鼠肺癌皮下移植瘤的生长和延长了生存期负载bEnd.3抗原的DCs培养8天成熟后,制备疫苗,免疫小鼠后,bEnd.3DCs组小鼠肿瘤生长速度缓慢,与NIH3T3DCs组和DCs组比较有统计学差异(P＜0.05)。而NIH3T3DCs组和DCs组肿瘤生长速度又比PBS组慢(P＜0.05)。中位生存时间bEnd.3DCs组为65天,NIH3T3DCs组和DCs组分别为55和57天,较对照组明显延长(P＜0.05)。2.诱导了免疫小鼠脾T淋巴细胞靶向血管内皮细胞的特异性CTLs杀伤CCK法检测bEnd.3DCs组免疫小鼠脾T淋巴细胞具有杀伤体外增殖的bEnd.3细胞CTLs杀伤活性,流式细胞检测结果提示bEnd.3DCs组CD3~+CD8~+的T细胞百分比高于对照组(P＜0.05)。3.诱导了免疫小鼠血清的特异性抗体产生ELISA检测荷瘤前后免疫抗血清特异性结果示,荷瘤前后bEnd.3DCs抗血清与bEnd.3的免疫效应无明显差异(P＞0.05),而荷瘤后的小鼠抗血清中,除PBS组,均能与bEnd.3和LLCs膜蛋白发生反应。Western blot检测bEnd.3DCs组抗血清在220 KD和180 KD处也出现了特异性条带,在130 KD处无特异性条带,HUVECDCs组在220 KD、180 KD和130 KD处均有特异性条带,与LLCs膜蛋白无特异性反应及条带。结论1.同种小鼠bEnd.3细胞疫苗和负载小鼠bEnd.3抗原的DCs疫苗可抑制小鼠Lewis肺癌皮下移植瘤和小鼠宫颈癌U14肺转移癌的生长和转移,延长了小鼠生存期,预防组抑瘤效果优于治疗组。2.抑瘤效应机制是在体内诱导形成靶向增殖血管内皮细胞的CTLs,诱导产生了抗VEGFR-Ⅱ抗体、抗Endoglin抗体和抗整合素av抗体等血管内皮细胞增殖相关抗体,诱导了抗肿瘤血管的细胞和体液免疫反应,抑制肿瘤的生长。3.内皮细胞疫苗能延长伤口愈合时间,但不影响其最终愈合。4.同种bEnd.3疫苗和异种HUVEC疫苗均能诱导抗肿瘤血管的主动免疫反应,二者抑瘤作用无明显差异。5.bEnd.3的两种疫苗形式之间的抑瘤作用有差异,整个血管内皮细胞疫苗较负载血管内皮细胞抗原的DCs疫苗似乎更有优势。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
微血管内皮细胞疫苗论文参考文献
[1].李姗.微血管内皮细胞疫苗和肿瘤细胞疫苗诱导小鼠抗Lewis肺癌免疫效应对比研究[D].郑州大学.2009
[2].赵军.同种脑微血管内皮细胞疫苗诱导小鼠抗肺癌血管内皮细胞免疫效应研究[D].郑州大学.2009