陈巧君黄燕(通讯作者)
（浙江大学医学院附属第二医院浙江杭州310009）
【摘要】目的：优化冰冻切片技术，提高术中病理诊断的准确率。方法：收集2014～2015年期间本院病理科冰冻切片2000余例，重新阅片，分析讨论发现的问题及原因。结果：不规范的冰冻切片操作严重影响冰冻切片。结论：规范化操作可以提高病理诊断的科学性、可靠性。
【关键词】冰冻切片；规范化操作；病理诊断
【中图分类号】R636【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）06-0205-02
术中冷冻切片是目前病理科最为常用的快速制片方法之一，它是借助低温冷冻将手术切除标本的组织块快速冷冻达到一定硬度进行切片的一种方法[1]。高质量的冷冻切片对于确保术中病理诊断的科学性、可靠性具有极其重要的作用，从而有效降低术中病理诊断的风险。
1.材料与方法
1.1取材
送检标本要及时、新鲜，不能沾水和放入固定液，特别是脑组织避免用生理盐水纱布包裹。取材时尽量避开组织坏死出血区，剔除不必要的脂肪组织、毛发及钙化物等。细小组织全取材，大组织的取材大小在1.5cm×1.5cm×0.2cm，以厚度不超过0.3cm为宜。
1.2包埋
包埋冻头使用后应用纸巾擦干净后放在冷冻切片机的冷冻台上预冷。根据组织的特性及医生要求来确定包埋方向，囊壁组织可卷曲成团，皮肤和管腔样组织应立埋。包埋剂应适量，大块组织可直接放置于滴加包埋剂的组织托上，再用冷冻锤压在组织块上，使其上下一起迅速制冷，既缩短冷冻的时间，又使组织块十分平整，利于切片。小组织（如穿刺、切缘等组织）包埋时应先滴加少许包埋剂在组织托上，等包埋剂渐渐发白，再将小组织放在组织托上，再用冷冻锤压，避免应切片不完整而导致病理漏诊。
1.3切片
包埋后组织的冷冻是整个冷冻切片十分关键的步骤之一，冷冻的好坏直接影响到切片的质量。在实践中，我们总结了不同组织的最佳冷冻温度（表1）。冻好的组织块应先进行粗修，暴露组织的最大面后再进行切片，切片时用力均匀。冷冻切片厚度一般在5μm，淋巴结在3～4μm，对于脂肪瘤标本厚度可增加至30μm。贴片时手要有一个向下伸展的动作，防止切片产生皱褶，动作要温柔，避免气泡产生。
1.4固定
固定是冷冻切片的关键。固定的作用在于使蛋白变性、凝固、沉淀，终止或抑制酶活性，保存组织、细胞原有的形态结构和抗原性[2]。冷冻切片的固定液有10%福尔马林、纯丙酮、95%乙醇、甲醇等[3]，笔者经过多年实践，认为甲醇固定1min效果较好，与文献报道基本一致[4-5]。切片后组织应立即固定，避免在空气中停留太久。
1.5染色
组织细胞内的不同物质经固定后产生不同的折光率，对染料产生不同的亲和力，经染色后容易区别[6]。新鲜组织固定时间可适当缩短，一般冷冻切片苏木素染色时间在1分钟左右，冬天室温较低时可给苏木素适当加温以缩短染色时间。水洗后可直接温水蓝化，蓝化应充分，入伊红液10sec后进行梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片处理。
2.结果
如图所示，乳腺组织与肺组织切片质量都比较好，切片结构清晰，完整无褶皱，颜色鲜艳，对比度好，极少出现影响诊断的因素，准确率达99%以上。
3.讨论
3.1冰晶的形成
组织中的水分经冷冻后形成冰晶。切片中冰晶形成的区域无细胞组织结构，呈结晶样或不规则空泡，影响病理诊断。冰晶出现以中枢神经系统送检的组织最为常见，主要因送检的组织小，组织含水量多，对制片质量要求较高，切片太厚或染色不好，刀痕、挤压、烧灼都会影响诊断。对于胶质细胞增生或胶质瘤Ⅰ级的鉴别极为困难，也可能将髓鞘病变诊断为胶质细胞肿瘤。冰晶的形成机制主要有二[7]：一是蛋白质和水所形成的胶体状态受到破坏，水分从胶体状态的蛋白质中分离出来形成冰晶；二是人体细胞大约含有30%～40%水分，水在4℃时体积最小，冷却至零度以下时，水结成冰，体积增大。
冰晶形成的原因：①组织含水量太多，未吸干水分就直接包埋冷冻；②取材太大太厚，导致冷冻时间过长；③取材时水洗后的刀具未擦干水分；④操作不熟练，长时间的冷冻还未切好。
3.2组织结构不清
细胞形态模糊，边界不清晰，镜下观察发白。此类现象多为固定不佳引起，各种组织都可以出现。
主要原因：①贴片后被晾干或吹干后固定；②固定时间太短或固定液浓度降低，固定不充分；③切片脱水不充分。
3.3切片皱缩或圈曲
切片组织出现重叠现象。常出现在乳腺，淋巴结等含脂肪较多的组织。
主要原因：①组织含脂肪较多，切片时较难切出，脂肪旁的组织出现皱缩或圈曲；②切片时冷冻还未到位，组织发软时切片易产生皱缩；③刀片不够锋利。
3.4切片不完整
部分组织缺失，切片不完整。
主要原因：①粗修未到位，未修到组织的最大面就开始切片；②组织富含脂肪或骨质，钙化等；③组织块过大导致无法修整。
3.5组织细胞核浆对比度差
伊红或苏木素着色不佳，红蓝对比不明显，导致核浆对比度较差。
主要原因：①苏木素染色时间不够，着色较浅；②苏木素使用过久，细胞核染色过黑；③苏木素染色后蓝化不充分，细胞核发紫；④蓝化后水洗不充分，伊红着色困难；⑤脱水透明不充分，颜色不鲜艳。
分析讨论冷冻切片的规范操作和常见问题至关重要，直接影响到临床病理诊断。做到以上几点，基本上能制作出一张高质量的冷冻切片。平时加强病理实验室的质量控制，在病理工作的全过程是易出现各种各样的问题，任何一个环节的疏忽，都可能影响最后的病理结果[8]。在日常工作中，可能还会碰到各种问题，只要我们有高度的责任心，对不同情况采取不同的处理方法，弥补不足。对病理技术不断摸索，总结才能制作出质量的切片，为病理诊断提供有力保障。
【参考文献】
[1]叶敏，刘尽国，赵兰香等.冷冻切片常见问题与解决方法[J].临床与实验病理学杂志,2013,29(9)：1030-1031.
[2]袁永辉，张韵风.制作临床快速冰冻切片的质量控制[J].实用医技杂志,2004,11(6):846-847.
[3]王灿铭，郭振英，胡锦林.不同固定液对脑组织冷冻切片质量影响的研究[J].医药前沿,2014(22):15-16.
[4]王灿铭，胡锦林.制作脑组织冷冻切片方法的改良[J].诊断病理学杂志,2015,4(22):253.
[5]豆文宪，朱小兰，骆新兰等.甲醇在冷冻切片快速染色中的应用[J].诊断病理学杂志,2013,20(22):792-793.
[6]王伯沄，李玉松，黄高昇等.病理学技术[M].北京:人民卫生出版社,2000:65.
[7]胥维勇，杨群.影响冷冻切片质量因素的分析[J].中国组织化学与细胞化学杂志,2003,12(2)：228-229.
[8]谢寿城.病理技术质量控制的探讨[J].中国现代药物应用,2010,4(7):55-56.