本文主要研究内容
作者潘爱红（2019）在《印尼大型海藻附着微生物产多功能淀粉酶Amy2587的性质研究》一文中研究指出：分布于印度尼西亚Halmahera岛的热泉主要受火山影响形成,热泉周边水域中生存着许多大型海藻,海藻表面附着着数量庞大的微生物,而这些微生物是发掘潜在的新型生物活性物质和酶类的重要源泉,已引起越来越多研究人员的关注。本研究主要以从印尼热泉采集的三种海藻样品附着微生物为研究对象,通过宏基因组分析手段来筛选活性高、稳定性好的淀粉酶序列进行表达及酶学性质研究,为工业应用寻找合适的淀粉酶产品。首先,本文提取了从印尼采集的三种大型海藻附着微生物的基因组DNA并对其进行了宏基因测序和分析,三个样品共获得了148464条基因序列。物种注释丰度信息结果显示,印尼大型海藻表面附着微生物优势菌群为弧菌属（Vibrio）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、发光杆菌属（Photobacterium）、不动杆菌属（Acinetobacter）;功能注释信息结果显示,海藻样品附着微生物碳水化合物活性酶（CAZymes）基因主要以GT（糖基转移酶）基因为主,其次为GH（糖苷水解酶）和CBM（碳水化合物结合模块）基因。通过进一步筛选分析,共获得了116条淀粉酶编码基因,分属于GH13、GH57、GH15、GH66、CBM20、CBM25、CBM26、CBM35、CBM48家族。其次,选取其中一条含GH66家族功能域的淀粉酶基因amy2587进行了基因表达。淀粉酶基因amy2587,核酸序列全长1785 bp,编码587个氨基酸,理论分子量为67.46 kDa。将淀粉酶基因amy2587与表达载体pET-30a进行连接,构建重组质粒pET-30a-amy2587,将pET-30a-amy2587转化到感受态细胞E.coli BL21（DE3）中。含有重组质粒的工程菌在IPTG浓度为0.5 mM条件下,16℃诱导培养16 h,菌体进行细胞破碎,破碎上清液经Ni-NTA层析柱纯化,SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白在咪唑洗脱液浓度为80 mM获得单一目的条带,分子量为70 kDa,与理论分子量一致,该结果证实了目的基因amy2587在大肠杆菌中实现了正确表达,并获得了纯化的重组蛋白Amy2587。然后,对重组淀粉酶Amy2587进行了酶学性质研究。试验结果表明:重组淀粉酶Amy2587不但具有降解淀粉的能力,还能够降解琼胶、卡拉胶、褐藻胶和羧甲基纤维素钠,其中以降解淀粉能力最强,其酶活力达到63.38 U/mL,表明Amy2587是一种多功能淀粉酶。多功能淀粉酶Amy2587与不同底物反应,最适作用温度为50℃,且具有良好的热稳定性,在50℃条件下保温1-4 h,酶活性可维持在85%以上,随着保温时间的增加,酶活性逐渐降低,保温24 h以后,残余酶活仍为60%以上;最适pH为10.0,其淀粉酶和琼胶酶活性在pH 6.0-10.0之间,残余酶活保持在77%,表明Amy2587具有较强的碱耐受性;Mn2+、Fe2+、K+、和Na+金属离子对Amy2587的多重底物活性具有不同程度的促进作用,但在Cu2+的作用下,所有酶活性几乎丧失。Amy2587对淀粉、琼胶、卡拉胶、褐藻胶和羧甲基纤维素钠底物的Km值分别为:4.06、10.10、12.25、11.54、14.91 mg/mL,表明Amy2587与淀粉底物的亲和力最好。最后,本文对Amy2587的多功能机制进行了初步研究。采用基因敲除手段将Amy2587序列中三个功能域进行了敲除,并将敲除基因后的序列进行表达和活性研究。结果表明,敲除相应功能域后,重组酶的活性有不同程度的减小,说明这些功能域对该酶的多重底物活性具有一定作用,但并不能改变其多重底物活性的特性。此外,还研究了脂肪酸和脂肪酸甲酯（亚油酸甲酯、油酸甲酯、硬脂酸、油酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻酸）对Amy2587多重底物活性的影响,结果表明亚油酸对Amy2587的多重底物活性有明显的抑制作用,油酸对Amy2587的淀粉酶、褐藻胶裂解酶和羧甲基纤维素钠酶活性有一定的抑制作用,而对琼胶酶和卡拉胶酶活性几乎没有影响。而有关Amy2587的多功能机制仍需要进一步深入研究。
Abstract
fen bu yu yin du ni xi ya Halmaheradao de re quan zhu yao shou huo shan ying xiang xing cheng ,re quan zhou bian shui yu zhong sheng cun zhao hu duo da xing hai zao ,hai zao biao mian fu zhao zhao shu liang pang da de wei sheng wu ,er zhe xie wei sheng wu shi fa jue qian zai de xin xing sheng wu huo xing wu zhi he mei lei de chong yao yuan quan ,yi yin qi yue lai yue duo yan jiu ren yuan de guan zhu 。ben yan jiu zhu yao yi cong yin ni re quan cai ji de san chong hai zao yang pin fu zhao wei sheng wu wei yan jiu dui xiang ,tong guo hong ji yin zu fen xi shou duan lai shai shua huo xing gao 、wen ding xing hao de dian fen mei xu lie jin hang biao da ji mei xue xing zhi yan jiu ,wei gong ye ying yong xun zhao ge kuo de dian fen mei chan pin 。shou xian ,ben wen di qu le cong yin ni cai ji de san chong da xing hai zao fu zhao wei sheng wu de ji yin zu DNAbing dui ji jin hang le hong ji yin ce xu he fen xi ,san ge yang pin gong huo de le 148464tiao ji yin xu lie 。wu chong zhu shi feng du xin xi jie guo xian shi ,yin ni da xing hai zao biao mian fu zhao wei sheng wu you shi jun qun wei hu jun shu （Vibrio）、ke lei bai shi jun shu （Klebsiella）、fa guang gan jun shu （Photobacterium）、bu dong gan jun shu （Acinetobacter）;gong neng zhu shi xin xi jie guo xian shi ,hai zao yang pin fu zhao wei sheng wu tan shui hua ge wu huo xing mei （CAZymes）ji yin zhu yao yi GT（tang ji zhuai yi mei ）ji yin wei zhu ,ji ci wei GH（tang gan shui jie mei ）he CBM（tan shui hua ge wu jie ge mo kuai ）ji yin 。tong guo jin yi bu shai shua fen xi ,gong huo de le 116tiao dian fen mei bian ma ji yin ,fen shu yu GH13、GH57、GH15、GH66、CBM20、CBM25、CBM26、CBM35、CBM48jia zu 。ji ci ,shua qu ji zhong yi tiao han GH66jia zu gong neng yu de dian fen mei ji yin amy2587jin hang le ji yin biao da 。dian fen mei ji yin amy2587,he suan xu lie quan chang 1785 bp,bian ma 587ge an ji suan ,li lun fen zi liang wei 67.46 kDa。jiang dian fen mei ji yin amy2587yu biao da zai ti pET-30ajin hang lian jie ,gou jian chong zu zhi li pET-30a-amy2587,jiang pET-30a-amy2587zhuai hua dao gan shou tai xi bao E.coli BL21（DE3）zhong 。han you chong zu zhi li de gong cheng jun zai IPTGnong du wei 0.5 mMtiao jian xia ,16℃you dao pei yang 16 h,jun ti jin hang xi bao po sui ,po sui shang qing ye jing Ni-NTAceng xi zhu chun hua ,SDS-PAGEdian yong jie guo xian shi mu de dan bai zai mi zuo xi tuo ye nong du wei 80 mMhuo de chan yi mu de tiao dai ,fen zi liang wei 70 kDa,yu li lun fen zi liang yi zhi ,gai jie guo zheng shi le mu de ji yin amy2587zai da chang gan jun zhong shi xian le zheng que biao da ,bing huo de le chun hua de chong zu dan bai Amy2587。ran hou ,dui chong zu dian fen mei Amy2587jin hang le mei xue xing zhi yan jiu 。shi yan jie guo biao ming :chong zu dian fen mei Amy2587bu dan ju you jiang jie dian fen de neng li ,hai neng gou jiang jie qiong jiao 、ka la jiao 、he zao jiao he suo jia ji qian wei su na ,ji zhong yi jiang jie dian fen neng li zui jiang ,ji mei huo li da dao 63.38 U/mL,biao ming Amy2587shi yi chong duo gong neng dian fen mei 。duo gong neng dian fen mei Amy2587yu bu tong de wu fan ying ,zui kuo zuo yong wen du wei 50℃,ju ju you liang hao de re wen ding xing ,zai 50℃tiao jian xia bao wen 1-4 h,mei huo xing ke wei chi zai 85%yi shang ,sui zhao bao wen shi jian de zeng jia ,mei huo xing zhu jian jiang di ,bao wen 24 hyi hou ,can yu mei huo reng wei 60%yi shang ;zui kuo pHwei 10.0,ji dian fen mei he qiong jiao mei huo xing zai pH 6.0-10.0zhi jian ,can yu mei huo bao chi zai 77%,biao ming Amy2587ju you jiao jiang de jian nai shou xing ;Mn2+、Fe2+、K+、he Na+jin shu li zi dui Amy2587de duo chong de wu huo xing ju you bu tong cheng du de cu jin zuo yong ,dan zai Cu2+de zuo yong xia ,suo you mei huo xing ji hu sang shi 。Amy2587dui dian fen 、qiong jiao 、ka la jiao 、he zao jiao he suo jia ji qian wei su na de wu de Kmzhi fen bie wei :4.06、10.10、12.25、11.54、14.91 mg/mL,biao ming Amy2587yu dian fen de wu de qin he li zui hao 。zui hou ,ben wen dui Amy2587de duo gong neng ji zhi jin hang le chu bu yan jiu 。cai yong ji yin qiao chu shou duan jiang Amy2587xu lie zhong san ge gong neng yu jin hang le qiao chu ,bing jiang qiao chu ji yin hou de xu lie jin hang biao da he huo xing yan jiu 。jie guo biao ming ,qiao chu xiang ying gong neng yu hou ,chong zu mei de huo xing you bu tong cheng du de jian xiao ,shui ming zhe xie gong neng yu dui gai mei de duo chong de wu huo xing ju you yi ding zuo yong ,dan bing bu neng gai bian ji duo chong de wu huo xing de te xing 。ci wai ,hai yan jiu le zhi fang suan he zhi fang suan jia zhi （ya you suan jia zhi 、you suan jia zhi 、ying zhi suan 、you suan 、zong lv suan 、ya you suan 、ya ma suan ）dui Amy2587duo chong de wu huo xing de ying xiang ,jie guo biao ming ya you suan dui Amy2587de duo chong de wu huo xing you ming xian de yi zhi zuo yong ,you suan dui Amy2587de dian fen mei 、he zao jiao lie jie mei he suo jia ji qian wei su na mei huo xing you yi ding de yi zhi zuo yong ,er dui qiong jiao mei he ka la jiao mei huo xing ji hu mei you ying xiang 。er you guan Amy2587de duo gong neng ji zhi reng xu yao jin yi bu shen ru yan jiu 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自青岛科技大学的潘爱红，发表于刊物青岛科技大学2019-07-19论文，是一篇关于海藻附着微生物论文,异源表达论文,酶学性质论文,多功能淀粉酶论文,青岛科技大学2019-07-19论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自青岛科技大学2019-07-19论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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