导读:本文包含了耳蜗前体细胞论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:耳蜗前体细胞,细胞增殖,TERT,Rb
耳蜗前体细胞论文文献综述
宋勇莉[1]（2015）在《TERT促耳蜗前体细胞增殖及其机制研究》一文中研究指出哺乳动物耳蜗毛细胞为终末感觉细胞,一旦损伤便难以再生,利用潜在的内源性干细胞替代损伤毛细胞可能成为最有潜力的治疗策略。近年来,研究者们已经成功的从出生后早期的哺乳动物耳蜗中分离出具有干细胞功能的耳蜗前体细胞,并证实其在体外增殖,并可诱导分化成为毛细胞样细胞。然而耳蜗前体细胞并非真正意义上的干细胞,而是介于干细胞和终末细胞之间的一类细胞亚型,其增殖能力有限,随着细胞的有丝分裂而逐渐退出细胞周期。因此,如何维持耳蜗前体细胞的增殖能力成为研究的焦点。随着耳聋基础研究的深入,一些耳蜗发育相关的基因已被证实可以促进耳蜗前体细胞的增殖,在研究中我们检测了在SD大鼠耳蜗发育过程和体外培养的耳蜗前体细胞中TERT的表达变化,结果提示随着耳蜗的发育和耳蜗前体细胞增殖能力的降低TERT的表达逐渐降低。通过腺病毒转染技术将TERT转染进入体外培养的耳蜗前体细胞,证实过表达TERT可以促进耳蜗前体细胞的增殖,并初步证实Rb/E2F信号通路可能参与了TERT对耳蜗前体细胞增殖的调控。实验一新生SD大鼠耳蜗前体细胞的分离、培养目的:采用联合酶消化的方法建立新生大鼠耳蜗前体细胞的分离培养方法,以改善原有耳蜗前体细胞的分离、培养方法;方法:分离P1-P3 SD大鼠耳蜗基底膜,将基底膜分为四组,分别为:A组:嗜热菌蛋白酶消化组;B组:Ⅰ型胶原酶消化组;C组:嗜热菌蛋白酶和Ⅰ型胶原酶消化组;D组:嗜热菌蛋白酶消化+机械分离组。根据不同的分组进行酶消化和细胞分离,收集细胞进行悬浮培养和诱导分化,观察培养获得的细胞球数目,上皮细胞的纯度、细胞的增殖和定向分化能力。结果:从4种方法分离得到的细胞经培养后均可形成细胞球,表达干细胞标记物Nestin和细胞分裂标记物Brd U。经过诱导分化后基底膜上皮细胞可以分化成毛细胞样细胞和支持细胞,而间质细胞可以分化为神经元样细胞。采用嗜热菌蛋白酶和Ⅰ型胶原酶联合消化可以获得最多数量的细胞球,并证实这些细胞球为上皮来源,各组细胞的上皮细胞阳性率无显着差异。结论:采用嗜热菌蛋白酶和Ⅰ型胶原酶联合消化基底膜可以获得较高纯度的上皮细胞,显着提高耳蜗前体细胞的分离效率,该方法改善了原有耳蜗前体细胞的培养方法,为耳蜗前体细胞的研究提供了有力工具。实验二TERT在耳蜗发育过程中及耳蜗前体细胞增殖中的表达目的:TERT对于维持端粒酶活性具有关键作用,已被证实可以促进多种细胞的增殖,而其在内耳细胞中的作用并不清楚。该实验的目的是检测TERT在大鼠耳蜗发育过程中及耳蜗前体细胞培养过程中的表达变化。方法:我们采用分别RT-PCR和Western blot检测了TERT在P0,P3,P7,P14,P28SD大鼠耳蜗基底膜中的表达变化。同时分离培养大鼠耳蜗前体细胞,采用RT-PCR检测了在不同培养时间,不同细胞球类型及不同传代的前体细胞中nestin,PCNA结果:在出生后早期可以见到基底膜中有较低水平的TERT的表达,随着耳蜗发育其表达水平逐渐降低。体外培养的耳蜗前体细胞随着培养时间的延长,细胞传代,其nestin,PCNA及TERT的表达逐渐下降,镂空细胞球中TERT的表达水平显着低于混合性细胞球组及实性细胞球组。结论:TERT在出生后早期可有较低水平的表达,而随着耳蜗的发育其表达逐渐降低,提示TERT可能与耳蜗的发育有关。耳蜗前体细胞随着培养时间的延长及传代其增殖能力和干细胞特性降低,同时伴有TERT的表达下降,提示TERT可能与耳蜗前体细胞干细胞功能的维持有关。实验叁Ad-TERT-EGFP的构建和大鼠耳蜗前体细胞的转染目的:构建携带目的基因为TERT的腺病毒载体,体外转染培养的大鼠耳蜗前体细胞,观察转染效率及细胞状态,确定适当的转染滴度。方法:1、构建复制缺陷重组腺病毒:Ad-TERT-EGFP及Ad-EGFP;2、应用不同感染复数的Ad-EGFP(MOI=250、200、150、100、50、25)转染耳蜗前体细胞,观察不同滴度转染时前体细胞形态的变化,荧光显微镜观察EGFP表达情况,确定转染MOI值,计算阳性细胞的转染率;3、应用RT-PCR、Western blot检测Ad-TERT-EGFP转染后耳蜗前体细胞中TERT的表达情况,用TRAP-ELISA检测转染后耳蜗前体细胞中端粒酶活性的变化。结果:收集病毒上清液经过鉴定,证实该重组腺病毒携带目的基因片段,病毒滴度为1×1011pfu/ml。在不同的感染复数下,EGFP的阳性细胞的比例随着MOI值增加而不断升高,当MOI值等于或者低于200时,病毒转染组与对照组细胞形态无明显差异。而当MOI>250时,病毒转染组细胞出现贴壁,生长抑制,坏死。确定本实验MOI值为200,转染后3-4天转染效果达到最佳,转染效率为32.15±3.12%。以MOI=200将Ad-TERT-EGFP转染耳蜗前体细胞,RT-PCR和Western blot检测耳蜗前体细胞中TERT m RNA和蛋白的表达显着升高,而端粒酶活性却没有显着变化。结论:应用腺病毒转染技术可以成功转染耳蜗前体细胞,转染后前体细胞中TERT的表达显着升高,为进一步研究TERT对耳蜗前体细胞增殖能力的影响奠定了基础。实验四过表达TERT对耳蜗前体细胞增殖能力的影响目的:通过携带TERT的腺病毒将TERT转染至体外培养的耳蜗前体细胞,观察过表达TERT后耳蜗前体细胞增殖能力的改变。方法:将耳蜗前体细胞分成叁组:Ad-TERT-EGFP转染组;Ad-EGFP转染组;对照组,对各组细胞分别进行病毒转染,MOI=200,然后分别计数耳蜗前体细胞各类细胞球所占比例,MTT绘制生长曲线,Ed U染色、RT-PCR及Western blot检测前体细胞中PCNA的表达。结果:结果表明进行Ad-TERT-EGFP转染后7天,耳蜗前体细胞中实性细胞球所占比例比Ad-EGFP转染组及对照组显着升高(P<0.05),MTT结果也提示过表达TERT后,耳蜗前体细胞的增殖能力显着增强。Ed U染色提示Ad-TERT-EGFP转染组耳蜗前体细胞中Ed U阳性的细胞百分率显着高于Ad-EGFP组及对照组,RT-PCR和Western blot检测发现在Ad-TERT-EGFP转染组中PCNA的表达显着高于Ad-EGFP组及对照组。结论:过表达TERT可以促进耳蜗前体细胞的增殖。实验五TERT促进耳蜗前体细胞增殖的机制目的:研究转染Ad-TERT-EGFP耳蜗前体细胞后促进前体细胞增殖的可能机制。方法:应用RT-PCR检测Ad-TERT-EGFP转染组,Ad-EGFP转染组及对照组中P27KIP1、P53、Rb、E2F、β-catenin、Cyclin D1、Cyclin E1、CDK2、CDK4、P16INK4a m RNA的表达水平变化,采用Western blot检测P27KIP1、P53、Rb、E2F、Cyclin D1、β-catenin蛋白的表达水平变化。结果:RT-PCR结果提示过表达TERT后,耳蜗前体细胞中P27KIP1、P53、P16INK4a表达水平较Ad-EGFP转染组及对照组显着降低(P<0.05),而CDK2、Cyclin D1的表达较Ad-EGFP转染组及对照组升高。Western blot结果提示:过表达TERT后耳蜗前体细胞中P27KIP1、P53、Rb蛋白的表达水平较Ad-EGFP转染组及对照组显着降低,而E2F及Cyclin D1表达升高。β-catenin蛋白在各组之间的表达无显着统计学差异。结论:过表达TERT可以促进耳蜗前体细胞增殖,其可能机制为通过调控Rb/E2F信号通路来促进耳蜗前体细胞的增殖。(本文来源于《第四军医大学》期刊2015-05-01）
姚俊,王帅,魏钦俊,鲁雅洁,邢光前[2]（2015）在《大鼠耳蜗前体细胞的体外培养与分化鉴定》一文中研究指出目的 :分离、培养大鼠的耳蜗前体细胞,鉴定其增殖和分化能力,分析内耳发育相关基因在其分化中的表达。方法 :从新生大鼠的耳蜗组织中分离获得前体细胞,进行体外培养,并加入血清诱导分化,通过免疫细胞化学的方法鉴定其增殖和分化为毛细胞的能力,利用荧光定量PCR的方法分析不同分化阶段的耳蜗前体细胞中内耳发育相关基因的表达。结果:原代培养的耳蜗前体细胞经免疫细胞化学鉴定呈nestin、Brd U阳性,经血清诱导分化后呈myosinⅦA阳性。荧光定量PCR的结果表明Sox2、Cyclin A2在耳蜗前体细胞分化的过程中表达逐渐下降,而Jagged1在分化过程中表达不断升高。结论 :分离的耳蜗前体细胞具有增殖能力和分化为毛细胞的潜能,在其分化过程中Sox2、Cyclin A2和Jagged1可能参与调控大鼠前体细胞的分化和耳蜗组织的发育。(本文来源于《南京医科大学学报(自然科学版)》期刊2015年04期）
邢蔚,闫辉,米文娟,陈俊,邱建华[3]（2014）在《miR-182可以促进耳蜗前体细胞分化为毛细胞》一文中研究指出目的探讨miR-182诱导耳蜗前体细胞向毛细胞分化的作用及机制。方法从新生大鼠耳蜗中分离培养耳蜗前体细胞并用血清诱导分化,BrdU、Nestin免疫荧光染色鉴定细胞自我增殖能力;myosinⅦa和phalloidin免疫荧光染色鉴定其是否具有分化为毛细胞的潜能。分别利用miR-182 mimics和siRNA在新生大鼠耳蜗前体细胞中过表达和低表达miR-182,然后在细胞诱导分化7天后,用流式细胞仪检测分化细胞中myosinⅦa阳性细胞比例,用Western-blot检测支持细胞标志分子中Sox2的变化。结果使用miR-182 mimics进行过表达后,耳蜗前体细胞分化为myosinⅦa阳性表达的细胞比例显着高于对照组,使用miR-182 siRNA进行低表达后此比例显着低于对照组。Western-blot检测显示,Sox2在miR-182 mimics组较对照组降低,miR-182 siRNA组较对照组增加。结论过表达miRN182可以促进耳蜗前体细胞向毛细胞方向分化,ox2可能是此过程中的靶基因。(本文来源于《中华耳科学杂志》期刊2014年02期）
邢蔚[4]（2014）在《miR-182在耳蜗前体细胞增殖和分化中的作用及机制研究》一文中研究指出成年哺乳动物毛细胞缺乏自发再生的能力，所以随着时间推移，受年龄、疾病、外伤等因素的损伤，毛细胞数量会逐渐减少，当减少到一定程度后，就会出现听力下降，导致感音神经性耳聋。近年来，利用干细胞（stem cells）进行替代治疗成为毛细胞再生的研究热点。耳蜗前体细胞（Cochlear progenitor cells，CPCs）是指胚胎和新生哺乳动物耳蜗中存在的具有干细胞特点的细胞，在体外具有自我更新能力，可传代培养，诱导分化后可表达毛细胞或支持细胞特异性标志物，其中毛细胞样细胞具有毛细胞纤毛样结构。与神经干细胞（NSCs）相比较，耳蜗前体细胞在毛细胞再生研究方面具有很大的优势：首先，耳蜗前体细胞更容易分化成为毛细胞样细胞；其次，耳蜗前体细胞分化为毛细胞标志物阳性的细胞比例更高，达10%以上。因此，耳蜗前体细胞是目前替代损伤耳蜗毛细胞的最佳候选细胞。microRNA （miRNA）是一类非编码小分子RNA，具有高度的保守性，广泛存在于哺乳动物基因组中，调控着超过半数脊椎动物mRNA的表达。研究发现miRNA183家族（包括miR-182/96/183）在出生后小鼠的内耳毛细胞中特异性表达，并在毛细胞的分化过程中高表达。其中，miR-182在具有增殖能力的耳蜗前体细胞（CPCs）中水平较高，而在细胞分化的过程中miR-182表达逐渐下降，且miR-182的表达水平在未分化的NSCs中显着低于CPCs。我们认为miR-182可能同时参与耳蜗毛细胞的增殖及分化调控，具有促进耳蜗毛细胞再生的潜能。实验一大鼠耳蜗前体细胞的分离培养、鉴定及体外诱导分化模型的建立目的成年哺乳动物耳蜗毛细胞一旦损伤后不能自发再生，这是导致感应神经性耳聋的主要原因。通过对耳蜗毛细胞分化、调控机制的研究，也许可以帮我们找到毛细胞再生的新途径。目前还没有建立起能稳定传代的毛细胞细胞系及前体细胞细胞系。我们建立了耳蜗前体细胞体外分离、培养的体系，并在体外成功诱导分化产生毛细胞样细胞，为研究毛细胞再生提供了切实可行的细胞模型。方法从新生大鼠耳蜗中分离培养耳蜗前体细胞，进行原代培养，并用血清诱导分化。BrdU、Nestin免疫荧光染色鉴定细胞自我增殖能力；myosin Ⅶa和phalloidin免疫荧光染色鉴定其分化为毛细胞的潜能。结果耳蜗前体细胞体外培养，第二天即形成大量细胞球，悬浮生长。收集悬浮的细胞球行免疫荧光染色，细胞球内大量细胞BrdU、Nestin阳性。体外诱导耳蜗前体细胞分化，分化细胞表达myosin Ⅶa、phalloidin等毛细胞标志物，在电镜下可见细胞表面有纤毛样结构。结论本研究证实在新生大鼠耳蜗内存在具有增殖、分化能力的耳蜗前体细胞，这种前体细胞可以体外培养，并可诱导分化产生毛细胞样细胞。提示我们所建立的这个细胞培养体系可以用来研究毛细胞的功能，也可以用来研究毛细胞的再生。实验二miR-182在耳蜗前体细胞增殖中的作用及其可能机制目的黑任轶等[39]在实验中观察到miR-182在耳蜗前体细胞未分化阶段出现表达量的峰值，随后其表达量随着细胞的分化进行而逐渐下降。为进一步研究miR-182对前体细胞增殖期的作用及其机制，我们应用过表达及基因沉默技术，向前体细胞内转染miR-182的模拟物（mimics）及inhibitor，观察miR-182过表达及低表达后对耳蜗前体细胞增殖凋亡的影响，并检测细胞中部分相关基因蛋白表达量的变化。方法从新生大鼠耳蜗中分离培养耳蜗前体细胞，进行增殖培养。分别利用miR-182mimics和inhibitor在新生大鼠耳蜗前体细胞中过表达和低表达miR-182，然后继续增殖培养4天后，用流式细胞仪检测各组耳蜗前体细胞的细胞周期及凋亡，用RT-PCR、Western-blot检测部分基因及蛋白的变化。结果使用miR-182mimics进行过表达后，耳蜗前体细胞中P27kip1、FoxO1、FoxO3表达量增加，细胞增殖能力减弱。使用inhibitor进行低表达，结果相反。结论过表达miR-182可以抑制耳蜗前体细胞增殖，P27kip1、FoxO1、FoxO3等可能是其间接靶基因。外源性miR-182mimics可以抑制耳蜗前体细胞的增殖，在耳蜗前体细胞未分化阶段miR-182出现表达量的峰值，其作用可能是为了限制耳蜗前体细胞的增殖能力，防止细胞的过度增加。实验叁miR-182在耳蜗前体细胞分化中的作用及其可能机制目的探讨miR-182诱导耳蜗前体细胞向毛细胞分化的作用及机制。方法从新生大鼠耳蜗中分离培养耳蜗前体细胞并用分组血清诱导分化，分别利用miR-182mimics和inhibitor在新生大鼠耳蜗前体细胞中过表达和低表达miR-182，然后细胞诱导分化7天后，用流式细胞仪检测分化细胞中myosinⅦa阳性细胞比例，用Western-blot检测相关分子Sox2、Hes1、p27kip1、math1的变化。结果使用miR-182mimics进行过表达后，耳蜗前体细胞分化为myosinⅦa阳性表达的细胞比例高于对照组，使用miR-182inhibitor进行低表达后此比例低于对照组。Western-blot检测显示Sox2、Hes1、p27kip1在miR-182mimics组较对照组降低，miR-182inhibitor组较对照组增加。math1在miRNA182mimics组增高，在inhibitor组减少。结论过表达miRN182可以促进耳蜗前体细胞向毛细胞方向分化，Sox2、Hes1可能是此过程中的靶基因。外源性的miR-182可以促进耳蜗前体细胞向毛细胞样细胞分化，高表达或者沉默miR-182，可以使Sox2、Hes1、p27kip1、math1等发生变化，与我们的预测结果一致。但是，miR-182是否通过调控Sox2、Hes1、p27kip1、math1等来调控毛细胞的分化，其机制还有待进一步研究。(本文来源于《第四军医大学》期刊2014-05-01）
王军利,许映龙,许珉[5]（2013）在《siRNA真核表达载体对大鼠耳蜗前体细胞Notch3基因表达的影响》一文中研究指出目的构建Notch3基因的siRNA真核表达载体,探讨其对大鼠耳蜗前体细胞中Notch3基因表达的影响。方法机械分离并胰酶消化新生大鼠耳蜗感觉上皮,悬浮培养基培养耳蜗前体细胞。根据Notch3基因序列设计并合成2对siRNA,插入pSilencer4.1-CMV neo载体,进行酶切及测序鉴定。采用脂质体法向大鼠耳蜗前体细胞转染重组质粒,采用Real time-PCR和Western blotting法检测重组质粒对Notch3基因的干扰效果。结果经前体细胞标记物Abcg2染色鉴定证实原代培养的细胞球为耳蜗前体细胞。酶切及测序鉴定证实成功构建了siRNA真核表达载体pSilencer-Notch3-S1和pSilencer-Notch3-S2。Real-time PCR和Western blotting检测结果显示所构建的Notch3基因真核表达载体成功地干扰了目的基因的表达。与空白对照组比较,转染pSilencer-Notch3-S1和pSilencer-Notch3-S2的细胞Notch 3 mRNA和蛋白表达量均有明显减少,而转染空质粒的细胞与空白对照组比较无显着差异。结论成功构建了大鼠Notch3基因的RNAi真核表达载体,该载体在大鼠耳蜗前体细胞中对Notch3基因的表达可发挥抑制作用。(本文来源于《解放军医学杂志》期刊2013年05期）
钟翠萍,马东洋,韩宇,徐学海,马敬[6]（2011）在《新生大鼠耳蜗前体细胞的培养及鉴定》一文中研究指出目的对新生大鼠耳蜗前体细胞进行分离、培养和鉴定。方法从出生7天的大鼠耳蜗中分离、培养前体细胞,用免疫细胞化学的方法对前体细胞进行鉴定;血清诱导分化后鉴定分化潜能,进一步了解其多向分化特性。结果原代培养的细胞,培养1d后即可见"细胞球"。细胞球内大部分细胞呈nestin、musashi1、pax2和BrdU阳性,表明其具有自我更新及有丝分裂的能力。细胞球经诱导分化14d后,对分化细胞行免疫细胞化学鉴定,发现分化细胞表达毛细胞标志物myosin VIIA和phalloidin,表达成熟神经元标志物NeuN,表达不成熟神经元标志物Tuj1,表达星形胶质细胞标志物GFAP,表达少突胶质细胞标志物galactocerebroside,以及谷氨酸能神经元标志物GluR-1,证明其具有多向分化潜能。结论本实验证明耳蜗前体细胞具有神经干细胞的多向分化潜能,为研究通过基因治疗的方法促进耳蜗神经细胞增殖提供了一种体外模型。(本文来源于《中华耳科学杂志》期刊2011年02期）
黑任轶[7]（2011）在《microRNA在耳蜗前体细胞增殖和分化中的作用探讨》一文中研究指出在耳科学领域,探索耳蜗的发育机制和毛细胞的再生机制是两个具有挑战性的难题。在新生的鼠类耳蜗内,仍然能够分离和培养出具有增殖能力的前体细胞,这些耳蜗前体细胞(CPCs)在体外能够分化出耳蜗毛细胞以及其他种类的耳蜗细胞。这些前体细胞被认为可能应用于毛细胞损伤缺失后的替代治疗,更重要的是,在体外诱导分化这些前体细胞可以为我们提供一个研究耳蜗发育和毛细胞再生的体外模型。microRNA(miRNA)是一类能够调节细胞增殖、分化以及干细胞命运的内源性非编码小RNA。目前尚无关于miRNA在耳蜗前体细胞增殖和分化中表达和功能的研究。在本研究中,我们首次利用微芯片及实时定量PCR等技术发现了在CPCs分化过程中表达的全部miRNA及其表达模式,与神经干细胞(NSCs)比较后,发现miR-183家族具有CPC细胞表达特异性。这些结果表明miRNA可能在CPC的增殖和分化中发挥了不同的作用,还可能决定了CPC向毛细胞的定向分化。使CPCs过表达目的miRNA或目的miRNA的互补反义链可以分别通过“gain-of-function”和“loss-of-function”实现对miRNA功能的验证。但目前尚无成功转染CPCs的相关报道。我们首次观察和比较了叁种不同的转染方法对CPCs的转染率和对细胞存活率的影响。初步证明了腺病毒介导的基因转导是使耳蜗前体细胞过表达目的基因的最佳途径与方法。实验一耳蜗前体细胞和神经干细胞的分离培养和分化目的分离、培养新生大鼠仔鼠耳蜗中的前体细胞(cochlear progenitor cells,CPCs)和胚胎鼠中来源于嗅球部位的神经干细胞(neural stem cells, NSCs),并对两种细胞进行体外诱导分化。方法从新生0至3天的大鼠耳蜗基底膜中分离出CPCs,进行原代培养,分别用免疫细胞荧光和免疫细胞化学方法检测BrdU和nestin在CPCs中的表达情况,鉴定前体细胞的增殖能力和细胞特性。用血清诱导前体细胞分化,用免疫细胞荧光的方法检测CPCs是否具有分化成毛细胞的能力。从发育15天的SD大鼠胚胎鼠的嗅球中分离出NSCs,并进行传代培养。用血清诱导传代第4代的NSCs进行分化。结果原代培养的CPCs第18小时后可见少量细胞球形成,随着培养时间的延长,可见细胞球数量逐渐增多,组成细胞球的细胞数目也增多。细胞球内绝大部分细胞BrdU和nestin阳性。随着培养时间的延长,细胞球的形态发生改变,增殖能力明显下降,而且部分细胞球自行贴壁,无法进行严格意义上的传代。经分化诱导后,细胞球贴壁生长,14天后,对分化细胞行免疫荧光化学染色,发现部分细胞表达毛细胞标志物myosin VIIA。NSCs增殖能力非常强,可传至少40代,持续6个月,分化后的细胞形态与CPCs来源的分化细胞显着不同。结论本部分实验表明CPCs具有一定的增殖能力,也可以分化出毛细胞样细胞,但并非严格意义上的干细胞,只能称其为耳蜗来源的前体细胞,它可作为耳蜗发育和毛细胞再生的体外研究模型。本部分实验为研究和比较miRNA在CPCs和NSCs分化过程中的表达变化奠定基础。实验二耳蜗前体细胞分化过程中miRNA的表达变化目的miRNA具有调节细胞增殖、分化、凋亡和影响细胞命运的重要作用。目前关于miRNA在CPCs中的表达和功能研究尚未见任何报道。我们拟用高通量的miRNA芯片检测目前已知所有的miRNA在CPCs增殖和分化过程中的表达模式。方法收集CPCs细胞球和CPCs来源的分化6天和14天的细胞,提取总RNA,通过质量检测后用Hy3标记探针,用LNA miRNA芯片进行杂交,然后扫描芯片并分析所有目前已知的miRNA的表达荧光信号强度,经过信号标准化和数据处理后绘制miRNA的表达模式图。分析并比较每个miRNA在叁个时间点的表达变化。结果近有100个miRNA在CPCs的分化过程中可以检测到。随着分化的进行,大部分的miRNA都出现明显的表达变化。这些miRNA之间的表达丰度跨度巨大,而且具有不同的表达模式,miR-125b-5p, miR-494和miR-22是表达量最高的叁个miRNA。在检测到的miRNA中,最为常见的叁种表达模式是:1.在未分化状态下表达水平达到峰值; 2.在分化第6天的时候表达水平达到峰值; 3.在分化第14天的时候表达水平达到峰值。结论本部分实验表明在CPCs不同分化阶段,具有不同的miRNA表达谱系。miRNA表达水平的时序性调节变化暗示着这些miRNA在不同的分化阶段发挥不同的作用。实验叁实时定量PCR技术比较miRNA在不同种类细胞中的表达模式目的用miRNA时实定量RT-PCR技术验证芯片结果,检测miR-21、miR-503、let-7a和let-7f及miR-183家族在CPCs分化过程中的表达变化,检测miR-183家族在NSCs分化过程中的表达变化。对比miR-183家族在两种细胞中的表达情况。方法收集CPCs细胞球和CPCs来源的分化6天和14天的细胞,提取总RNA,用miRNA qRT-PCR技术检测miR-21、miR-503、let-7a、let-7f、miR-96、miR-182和miR-183在叁个分化时间点的表达变化。收集NSCs细胞球和NSCs来源的分化6天和14天的细胞,提取总RNA,用miRNA qRT-PCR技术检测miR-183家庭在叁个分化时间点的表达变化。结果miR-21、miR-503、let-7a和let-7f的表达趋势与其在miRNA芯片中的结果基本一致。miR-21、let-7a和let-7f具有相似的表达模式,均在分化6天的时候达到峰值。而miR-503具有不同的表达模式,随着分化的进行,miR-503的表达水平逐渐升高,在分化第14天阶段表达水平达到高峰,此变化亦具有统计学意义。miR-183家族的叁个成员表达模式不同,miR-96和miR-182的表达量均随着分化的进行不断下降,而miR-183的表达与miR-21相似在分化6天时达到高峰。miR-96和miR-183均无法在NSCs分化过程中检测到,miR-182仅能在未分化的NSCs中检测到,但表达量极低。经统计学检测,以上变化均具有统计学意义。结论本部分实验结果表明了LNA芯片结果的可靠性。在CPCs分化中不同的miRNA可能有类似的功能。miR-183家族具有CPC的细胞表达特异性,这种特导性可能影响了干细胞向CPCs的分化,也可能决定了CPCs向多种耳蜗细胞的特异性分化。实验四耳蜗前体细胞过表达目的基因方法的建立目的能够使CPCs过表达或低表达miRNA是验证miRNA功能的首要条件。但目前尚无成功转染CPCs的相关报道。我们分别观察脂质体转染、电穿孔转染和腺病毒感染叁种方法对原代培养的CPCs的转染率。为日后研究miRNA在CPCs中发挥的作用奠定实验技术基础。方法用不同比例的EGFP质粒/脂质体复合物和不同的孵育时间转染CPCs;设置不同的电场强度用电穿孔转染法将EGFP质粒转染入CPCs;按照不同MOI值加入rAd-EGFP,用腺病毒介导的方法使CPCs表达EGFP。24小时后在荧光显微镜下计数阳性细胞,计算转染率。用台盼蓝拒染试验观察各种条件下的不同转染法的细胞存活率。结果改变不同的转染条件后脂质体转染的效率无明显改变,平均转染率低于2%,但对细胞的存活不产生明显的影响;增加电穿孔的电压后,转染率在一定的电压范围内明显上升,在电压强度为250V时达到最高,平均转染率为24.7%,但是细胞存活率相对较低;腺病毒感染法的平均转导率在MOI值为250时达到高峰为52%,细胞的存活率可达到85%。结论本部分实验结果表明脂质体转染法的转染率过低;电穿孔转染法的转染率有了大幅度的提高但细胞死亡过多;腺病毒介导的转导法兼顾了转染率和细胞存活率,是使CPCs过表达目的基因的最合适的方法。但是我们需要进一步的实验和更为详尽的实验数据来支持本结论。(本文来源于《第四军医大学》期刊2011-04-01）
陈俊,钟翠萍,邱建华[8]（2010）在《耳蜗前体细胞分化的微环境对神经干细胞分化的影响》一文中研究指出目的耳蜗前体细胞向毛细胞和听觉神经元定向分化的具体机制尚不清楚,前体细胞所处的微环境在分化过程中起重要作用。为探讨微环境在细胞分化中的作用,我们在体外将GFP标记的神经干细胞和耳蜗前体细胞按比例混合,并诱导其分化,观察耳蜗前体细胞分化的微环境对神经干细胞分化的影响。(本文来源于《2010全国耳鼻咽喉头颈外科中青年学术会议论文汇编》期刊2010-05-26）
钟翠萍[9]（2010）在《c-Myc及CyclinA2基因诱导大鼠耳蜗前体细胞增殖的体外研究》一文中研究指出在成年哺乳动物耳蜗中,听觉毛细胞和神经元损伤后不能再生,这成为感音神经性聋难以治愈的主要原因。近年来,自新生鼠耳蜗分离出前体细胞,在体外可定向分化为表达毛细胞和螺旋神经元表型的细胞。我们在体外比较了P1、P7和P14的大鼠耳蜗前体细胞的数量、增殖能力及超微结构,结果表明出生后耳蜗前体细胞大部分处于细胞周期的静止期,并逐步通过分化和凋亡彻底地退出了细胞周期,耳蜗前体细胞也并非真正意义上的干细胞,而是处于干细胞与成熟子代细胞之间的中间细胞或是处于干细胞未端的细胞。通过实验发现c-Myc可能参与调控耳蜗的发育以及前体细胞的增殖、分化。结合之前的工作基础,我们利用腺病毒技术将c-Myc和cyclin A2共转染至新生鼠耳蜗前体细胞,可使其增殖,并促进前体细胞重新进入细胞周期。初步研究其调控机制,表明为经典的CKI-cyclin-CDK途径。实验一大鼠耳蜗前体细胞的分离、培养目的对新生大鼠耳蜗前体细胞进行分离、培养。方法从P7大鼠耳蜗中分离、培养前体细胞,用免疫细胞化学的方法对前体细胞进行鉴定;血清诱导分化后鉴定分化潜能,进一步了解其多向分化特性。结果原代培养的细胞,培养1天后即可见“细胞球”,随着培养天数的增加,可见细胞球体积增大,所含细胞增多;培养5天后,少部分细胞球内的细胞出现分化及贴壁现象。细胞球内大部分细胞呈nestin、musashi1和BrdU阳性,表明其具有自我更新及有丝分裂的能力。细胞球经诱导分化14 d后,对分化细胞行免疫细胞化学鉴定,发现分化细胞表达毛细胞标志物myosin VIIA和phalloidin,表达成熟神经元标志物NeuN,表达不成熟神经元标志物Tuj1,表达星形胶质细胞标志物GFAP,表达少突胶质细胞标志物galactocerebroside,以及谷氨酸能神经元标志物GluR-1,证明其具有多向分化潜能。结论本部分实验为研究耳蜗前体细胞成年后“沉默”的机制奠定基础,为研究通过基因治疗的方法促进前体细胞增殖提供了一种体外模型。实验二不同日龄大鼠耳蜗前体细胞增殖能力及超微结构的比较目的耳蜗前体细胞在成年后沉默或消失的具体机制尚不清楚,为探讨其原因,我们在体外比较了P1、P7和P14的大鼠耳蜗前体细胞的数量、增殖能力及超微结构,观察耳蜗前体细胞的转归。方法对P1、P7和P14分离出的耳蜗前体细胞,经体外培养7天后进行计数,检测其数量变化,并每隔5天传代观察传代数;采用流式细胞技术检测细胞周期,来评估不同日龄新生大鼠耳蜗前体细胞增殖能力的变化;应用透射电镜观察不同日龄新生大鼠耳蜗前体细胞的超微结构。结果出生1周后耳蜗前体细胞的数量急剧下降,出生2周后的耳蜗内未能分离出前体细胞;P7前体细胞的传代数较P1减少;P7较P1更多的前体细胞处于有丝分裂的静止期,增殖指数下降;P7的前体细胞超微结构中有更多分化细胞的特点。结论耳蜗前体细胞出生后大部分处于细胞周期的静止期,并逐步通过分化和凋亡彻底地退出了细胞周期,他们并非真正意义上的干细胞,而是处于干细胞与成熟子代细胞之间的中间细胞或是处于干细胞未端的细胞。实验叁c-Myc在大鼠耳蜗组织发育和耳蜗前体细胞分化过程中的表达变化目的原癌基因c-Myc具有调控G0/G1转换和去分化的双重作用。目前对于c-Myc在内耳中的功能尚未见报道。我们拟通过检测c-Myc在大鼠耳蜗组织发育及前体细胞分化过程中的表达情况,探讨其在哺乳动物耳蜗发育中的作用。方法1、取E10、E15、P1、P7和P14的SD大鼠耳蜗组织,应用RT-PCR、Western blot的方法检测c-Myc在大鼠耳蜗组织发育过程中的表达情况。2、取耳蜗前体细胞和分化7天后的分化细胞,用RT-PCR、免疫细胞化学染色和Western blot的方法检测c-Myc在耳蜗前体细胞分化过程中的表达情况。结果从胚胎至出生后的耳蜗发育过程中,c-Myc表达量呈现逐渐下降趋势;在前体细胞的分化过程中c-Myc的表达量也呈现下降。结论c-Myc的表达量在大鼠耳蜗组织发育及耳蜗前体细胞分化的过程中逐渐下降,这表明c-Myc可能参与调控大鼠耳蜗组织的发育及前体细胞的分化。实验四Ad-c-Myc-EGFP和Ad-CyclinA2-EGFP的构建和转染耳蜗前体细胞的浓度确定目的构建目的基因分别为c-Myc和CyclinA2的腺病毒载体,体外转染大鼠耳蜗前体细胞,观察转染效率及细胞活性,确定适当的转染浓度。方法1、构建复制缺陷重组腺病毒: Ad-CyclinA2-EGFP、Ad-c-Myc-EGFP及Ad-EGFP;2、在不同效靶比浓度下(MOI=50、100、150、200、250),Ad-EGFP转染耳蜗前体细胞,观察不同浓度转染时细胞形态变化,荧光显微镜观察EGFP表达情况,计算阳性细胞百分率;3、应用MTT观察细胞活性确定增殖点;4、确定MOI值,应用流式细胞仪检测转染效率。结果毒种上清液经PCR鉴定,能够特异地扩增出预期大小的条带,证明该重组腺病毒携带目的片段。在不同效靶比浓度下,EGFP阳性细胞百分率随MOI值的升高而增大;当MOI=50,100,150时重组腺病毒对细胞的毒性作用与对照组相比无显着差异;当MOI值=200时,细胞状态不佳,出现生长抑制。根据光镜下细胞形态学证据,确定本实验采用MOI值为150。经MTT法测定,细胞生长曲线呈S形,转染后36小时做为增殖点,应用流式细胞技术检测转染效率为25.2%。结论复制缺陷型腺病毒可有效转染原代培养的耳蜗前体细胞,为进一步研究c-Myc和CyclinA2基因对耳蜗前体细胞增殖能力的影响奠定了基础。实验五c-Myc、CyclinA2基因对耳蜗前体细胞增殖能力的影响目的耳蜗前体细胞在体外具有一定的增殖能力,可定向分化为表达毛细胞和神经元表型的细胞,但耳蜗前体细胞增殖能力差,并处于细胞周期的“静止”状态。我们用编码目的基因为c-Myc和CyclinA2的腺病毒表达载体转染耳蜗前体细胞,促进其增殖并重返细胞周期,从而为诱导耳蜗受损细胞再生提供新的思路和依据。方法分别设立Ad-CyclinA2-EGFP转染组、Ad-c-Myc-EGFP转染组、Ad-EGFP转染组及Ad-CyclinA2-EGFP、Ad-c-Myc-EGFP共转染组;用复制缺陷腺病毒转染大鼠耳蜗前体细胞,MOI值为150,用流式细胞技术检测c-Myc和CyclinA2基因对耳蜗前体细胞周期的影响;BrdU孵育观察转染后有丝分裂能力的变化;观察各组传代能力变化,采用方差分析对数据进行统计学处理。结果流式结果表明Ad-CyclinA2-EGFP转染组、Ad-c-Myc-EGFP转染组、Ad-EGFP转染组对耳蜗前体细胞周期无明显影响;而Ad-CyclinA2-EGFP、Ad-c-Myc-EGFP共转染组可使部分耳蜗前体细胞进入G1/S期和G2/M期,共转染组与对照组G0/G1期细胞比例分别为62.03±2.02%、78.27±6.09%(P﹤0.05);增殖指数分别为37.97±2.015、20.41±7.16(P﹤0.05)。共转染组中共表达绿色荧光(EGFP)、红色荧光(BrdU阳性)及蓝色荧光(Hoechst)的细胞球数量增多,表明共转染c-Myc、CyclinA2使更多的耳蜗前体细胞具有有丝分裂的能力;各组间传代能力无明显变化。结论c-Myc基因和CyclinA2基因单独作用于耳蜗前体细胞,在体外对细胞增殖与细胞周期无明显影响。而c-Myc和CyclinA2基因共同作用于耳蜗前体细胞,可促进细胞增殖,使部分前体细胞重返细胞周期。实验六c-Myc与CyclinA2基因促进耳蜗前体细胞增殖的作用机制目的研究c-Myc和CyclinA2基因共同转染耳蜗前体细胞后,检测目的基因表达情况以及促进细胞增殖的机制。方法应用real-time PCR和Western blot的方法观察转染Ad-EGFP与共转染Ad-CyclinA2-EGFP、Ad-c-Myc-EGFP时目的基因、PCNA、CDK2以及P27KIP1在细胞中的表达水平变化。结果real-time PCR和Western blot结果证实携带目的基因的腺病毒转染耳蜗前体细胞后能有效表达出相应的mRNA和蛋白;并可升高PCNA与CDK2的表达水平,降低P27KIP1的表达水平。结论复制缺陷型腺病毒可有效介导c-Myc和CyclinA2基因转染原代培养的耳蜗前体细胞,并通过上调细胞周期蛋白依赖激酶CDK2,下调CDK抑制蛋白P27KIP1,进而上调细胞DNA合成期标志蛋白PCNA来实现耳蜗前体细胞增殖的作用,其作用机制为经典的CKI-cyclin-CDK途径。(本文来源于《第四军医大学》期刊2010-04-01）
陈俊[10]（2009）在《新生大鼠耳蜗前体细胞分化的分子机制及微环境的初步研究》一文中研究指出在成年哺乳动物耳蜗中,听觉毛细胞和神经元在损伤后不能自然再生,这是感音神经性聋的主要原因。近年来,成功从新生鼠耳蜗分离出耳蜗前体细胞,也有人称之为耳蜗干细胞,在体外培养的耳蜗前体细胞能分化为毛细胞和螺旋神经元样细胞。研究耳蜗前体细胞的分化机制及微环境将为诱导损伤后毛细胞和螺旋神经元再生提供依据。我们通过实验发现细胞周期调节分子cyclin A2和CRP2可能参与了耳蜗的发育以及前体细胞的增殖、分化。实验一新生大鼠耳蜗前体细胞的分离、培养目的对新生大鼠耳蜗前体细胞进行分离、培养。方法从P2大鼠耳蜗分离培养前体细胞,血清诱导分化后用免疫细胞化学染色鉴定多向分化潜能,通过扫描电镜观察分化细胞表面的超微结构,进一步了解分化细胞的特性。结果原代培养的细胞第3天即可见“细胞球”,随着培养天数的增加,可见细胞球体积增大。细胞球内绝大部分细胞呈nestin和BrdU阳性,表明其具有自我更新的能力。细胞球经诱导分化14 d后,对分化细胞行免疫荧光化学染色,发现部分细胞表达毛细胞标志物myosin VIIA,部分细胞表达星形胶质细胞标志物GFAP或者成熟神经元标志物NeuN,证明其具有多向分化潜能。扫描电镜下可见扁平的叁角形或不规则形细胞,表面具有纤毛样结构,其纤毛顶端的结构与正常耳蜗毛细胞纤毛顶端相似,此外还可见双极神经元形态的细胞。结论本部分实验为研究耳蜗前体细胞的分化机制奠定基础。实验二cyclin A2在大鼠耳蜗组织发育和耳蜗前体细胞分化过程中的表达变化目的细胞周期分子cyclin A2具有调控G1/S转换和G2/M转换的双重作用。目前对于cyclin A2在内耳中的功能尚未见任何报道。我们拟通过检测cyclin A2在大鼠耳蜗组织发育及耳蜗前体细胞分化过程中的表达情况,探讨其是否参与了哺乳动物耳蜗的发育。方法一、cyclin A2在大鼠耳蜗组织发育过程中的表达情况:P2、P10和P42的SD大鼠取耳蜗组织,RT-PCR、Western blot和免疫组织化学染色的方法检测cyclin A2的表达。二、cyclin A2在大鼠耳蜗前体细胞分化过程中的表达情况:用RT-PCR、免疫细胞化学染色和Western blot的方法检测cyclin A2在未分化、分化6天及分化14天耳蜗前体细胞的表达情况。结果cyclin A2表达于P2大鼠耳蜗的螺旋缘,在P10后的耳蜗未见表达。在前体细胞的分化过程中cyclin A2的表达量逐渐下降。结论在大鼠耳蜗组织发育及耳蜗前体细胞分化的过程中cyclin A2表达量逐渐下降,这表明cyclin A2可能参与了大鼠出生后耳蜗的发育。实验叁CRP2及CRIP2在大鼠耳蜗组织发育和耳蜗前体细胞分化过程中的表达变化目的我们实验室在以往研究中通过RT-PCR及Western blot首次证实LIM分子CRP2及CRIP2表达于大鼠的内耳。其中CRP2表达于胚胎期耳蜗,在成年耳蜗中无表达;而CRIP2在不同年龄耳蜗中(包括胚胎期)表达量无明显差异。为进一步探讨CRP2及CRIP2是否参与了哺乳动物耳蜗的发育,我们拟通过免疫组织化学和免疫细胞化学的方法检测CRP2及CRIP2在不同年龄大鼠耳蜗组织中的分布及耳蜗前体细胞分化前后的表达变化。方法一、CRP2及CRIP2在大鼠耳蜗组织发育过程中的表达情况:免疫组织化学染色的方法检测其在P2、P6和P10大鼠耳蜗中的表达。二、CRP2及CRIP2在大鼠耳蜗前体细胞分化过程中的表达情况:用免疫细胞化学染色的方法检测其在未分化和分化7天耳蜗前体细胞中的表达情况。结果免疫组化结果显示,CRP2主要表达于螺旋神经节,并且在耳蜗发育过程中,其阳性细胞数逐渐减少。CRIP2主要表达于耳蜗组织中的螺旋神经节、螺旋缘和Corti器,而且在P2、P6和P10各组中阳性细胞数量无明显差异。另外,在P2组前庭的感觉上皮部位也可见CRIP2和CRP2的表达。免疫细胞化学染色显示,CRIP2和CRP2均可表达于未分化的前体细胞,在胞核和胞质中均呈阳性表达,CRIP2可表达于分化7天细胞的胞质。分化细胞未见CRP2的表达。结论CRP2可能参与了耳蜗的发育以及毛细胞和螺旋神经元的增殖;CRIP2在耳蜗不同发育时期以及前体细胞分化前后均稳定表达,表明其可能在维持耳蜗细胞基本功能中发挥一定作用。实验四耳蜗前体细胞分化的微环境对神经干细胞分化影响的初步研究目的耳蜗前体细胞向毛细胞和螺旋神经元定向分化的具体机制尚不清楚,前体细胞所处的微环境在分化过程中起重要作用。为探讨微环境在细胞分化中的作用,我们在体外将GFP标记的神经干细胞和耳蜗前体细胞按比例混合,并诱导其分化,观察耳蜗前体细胞分化的微环境对神经干细胞分化的影响。方法将耳蜗前体细胞和GFP标记的神经干细胞按10:1的比例混合后接种于同一培养皿中,诱导分化后进行贴壁培养。21天后采用免疫荧光的方法对分化细胞进行鉴定。一抗采用抗myosin VIIA(毛细胞标志物)和抗peripherin(神经元标志物)。结果耳蜗前体细胞分化的微环境促进神经干细胞的存活,并诱导其向myosin VIIA阳性细胞及双极神经元形态细胞分化。结论耳蜗前体细胞的成功分离、培养为研究其分化的机制提供了一个极佳的体外模型,对于耳蜗前体细胞分化的微环境需要更加深入的研究。实验五干细胞向雏鸡和成年豚鼠耳蜗移植方法的建立目的研究耳蜗前体细胞分化的机制,目的是诱导外源性干细胞定向分化为听觉毛细胞及神经元,或刺激体内内源性耳蜗前体细胞再生,从而修复受损的听觉细胞。将外源性干细胞或治疗基因表达载体(如腺病毒等)植入耳蜗是治疗的前提,为此我们建立了干细胞向动物耳蜗移植的方法。方法雏鸡耳蜗的干细胞移植是经外耳道剥离鼓膜,暴露中耳腔的蜗窗,再经蜗窗膜造孔注入干细胞。成年豚鼠耳蜗鼓阶的干细胞移植是行耳后切口暴露听泡,在耳蜗底转近镫骨动脉处钻孔,并注入GFP标记的干细胞。中阶的移植是经耳蜗第叁转的血管纹外侧壁注入干细胞。细胞移植1天后,分离雏鸡和豚鼠的耳蜗作冰冻切片,在荧光显微镜下观察移植细胞的分布。结果移植后的干细胞可分布于雏鸡耳蜗及豚鼠耳蜗的鼓阶、中阶。结论成功建立了干细胞向雏鸡和成年豚鼠耳蜗移植的方法,为进一步将干细胞应用于耳聋的治疗及机制研究奠定基础。(本文来源于《第四军医大学》期刊2009-04-01）
耳蜗前体细胞论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的 :分离、培养大鼠的耳蜗前体细胞,鉴定其增殖和分化能力,分析内耳发育相关基因在其分化中的表达。方法 :从新生大鼠的耳蜗组织中分离获得前体细胞,进行体外培养,并加入血清诱导分化,通过免疫细胞化学的方法鉴定其增殖和分化为毛细胞的能力,利用荧光定量PCR的方法分析不同分化阶段的耳蜗前体细胞中内耳发育相关基因的表达。结果:原代培养的耳蜗前体细胞经免疫细胞化学鉴定呈nestin、Brd U阳性,经血清诱导分化后呈myosinⅦA阳性。荧光定量PCR的结果表明Sox2、Cyclin A2在耳蜗前体细胞分化的过程中表达逐渐下降,而Jagged1在分化过程中表达不断升高。结论 :分离的耳蜗前体细胞具有增殖能力和分化为毛细胞的潜能,在其分化过程中Sox2、Cyclin A2和Jagged1可能参与调控大鼠前体细胞的分化和耳蜗组织的发育。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
耳蜗前体细胞论文参考文献
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