本文主要研究内容
作者张冕（2019）在《苹果黑腐皮壳菌Valsa mali的两类效应蛋白VmHEPs及VmPODs的功能及机制研究》一文中研究指出：苹果黑腐皮壳菌Valsa mali是导致苹果树腐烂病的主要植物病原真菌,极大威胁我国的苹果产业。植物病原真菌在侵染寄主的过程中需要多种重要的致病因子参与,效应蛋白则是其中非常关键的一类。目前所发现的植物病原真菌的效应蛋白大多都不具有保守功能域,但这些具有保守功能域的效应蛋白已在植物病原卵菌和细菌中被证实具有极其重要的意义,因此对植物病原真菌中具有保守功能域的效应蛋白的研究有利于深入揭示植物病原真菌的致病机制。Hce2功能域是目前被发现的分布最为广泛的一类植物病原真菌效应蛋白保守功能域,但其致病的作用方式及机制尚不明确;Pod（Peroxidase）功能域在生物生理代谢方面的功能已经被深入研究,但研究多集中于一些含有该功能域的非分泌胞内酶上,该功能域是否能以效应蛋白的形式参与植物病原真菌致病的过程尚不清楚。目前,V.mali中尚未发现具有保守功能域的效应蛋白。本研究基于一系列生物信息学技术和分子生物学技术对V.mali中含有Hce2功能域的五个效应蛋白VmHEPs（VmHEP1、VmHEP2、VmHEP3、VmHEP4和VmHEP5）进行了挖掘和功能研究,并对其中具有激发植物细胞坏死功能的VmHEP1进行了上游调控及下游靶标的进一步筛选和研究;与此同时,本研究还发现了一类含有Pod（Peroxiadase）功能域的效应蛋白普遍存在于各种不同植物病原真菌中,并通过功能研究证明V.mali中的三个该类型效应蛋白VmPODs（VmPOD1、VmPOD2和VmPOD3）对V.mali的生存和致病有都重要贡献。主要研究结果如下:（1）含Hce2功能域的效应蛋白VmHEPs以串联基因冗余互补的方式参与V.mali致病过程本研究首先从88个候选效应蛋白中鉴定得到一个具有Hce2保守功能域且能引起植物细胞坏死的效应蛋白VmHEP1,进一步从分泌蛋白组中鉴定出四个与VmHEP1同源且具有分泌功能的同源蛋白（VmHEP2、VmHEP3、VmHEP4和VmHEP5）;经过基因瞬时表达确认,在VmHEPs中仅有VmHEP1能够引起细胞坏死;进化分析显示五个VmHEPs基因是旁系同源基因（paralogs）,其中的VmHEP1和VmHEP2属于symparalogs（in-paralogs）,而其他三个基因属于alloparalogs（out-paralogs）,此外,在进化过程中五个基因两两之间并未发生显著的非同义氨基酸替换,处于纯化选择状态。致病力检测发现,分别敲除VmHEPs单个基因后,V.mali的致病力并未发生改变,但VmHEPs中VmHEP1和VmHEP2基因在侵染早期均明显的上调,将VmHEP1和VmHEP2同时敲除后,V.mali致病力发生显著下降。后续分析发现,VmHEP1和VmHEP2均处于11号染色体且两者间物理位置仅仅相距604 bp,与此同时qRT-PCR显示在V.mali侵染苹果枝条时,VmHEP1的缺失会显著促进VmHEP2上调,反之VmHEP2的缺失也会促进VmHEP1的显著上调。本研究证明V.mali的五个VmHEPs基因是不同种类的旁系同源基因,处于纯化选择状态,其中的VmHEP1能够激发细胞坏死,同时VmHEP1与VmHEP2是V.mali的重要毒性因子,以基因冗余互补的方式参与致病,同时说明植物病原真菌的效应蛋白可以通过基因串联拷贝的冗余协作模式参与致病。（2）VmHEP1基因的上游非编码区具有受侵染事件诱导的基因启动功能并且效应蛋白VmHEP1能够与苹果蛋白MdLRRP1互作本研究进一步对VmHEPs中唯一可以引起细胞坏死的效应蛋白VmHEP1进行了上游启动区域功能和下游互作靶标的鉴定和研究。基因组信息分析发现VmHEP1基因的上游1500 bp为非编码区域;基于V.mali的遗传转化体系,本研究证实该1500 bp非编码区域内存在启动区域能够在V.mali中启动转入的外源GFP基因,并且通过qRT-PCR证实该启动区域的启动功能受到侵染事件的诱导。此外,通过酵母双杂筛选、免疫共沉淀技术和质谱技术验证,发现效应蛋白VmHEP1能够与一个来自苹果的具有富亮氨酸重复结构域（LRR）的蛋白激酶MdLRRP1结合;进一步利用VIGS技术将MdLRRP1基因在本氏烟中的同源基因NbSERK3进行基因沉默,并在基因沉默植株中进行VmHEP1的瞬时表达,最终通过电解质渗透率检测发现效应蛋白VmHEP1所引起的本氏烟叶片细胞坏死程度在NbSERK3基因被沉默的基因沉默植株中显著降低。本研究证实了VmHEP1基因上游存在一个受侵染事件诱导的启动区域,并且初步鉴定了效应蛋白VmHEP1能够与苹果中的靶标蛋白MdLRRP1结合和互作。（3）含Pod功能域的效应蛋白VmPODs对V.mali的产孢、H2O2耐受能力和致病力有显著影响且普遍存在于其它真菌中为了探究苹果黑腐皮壳菌中是否存在尚未被关注的具有保守功能域的效应蛋白,本研究根据效应蛋白特征对基因组和分泌蛋白组进行了进一步分析,分析发现了三个具有信号肽且拥有Pod（Peroxidase）保守功能域的候选效应蛋白VmPOD1、VmPOD2以及VmPOD3。序列分析显示,VmPOD1具有两个过氧化氢酶功能域;VmPOD2具有一个氯化物过氧化物酶功能域;VmPOD3具有一个植物类过氧化物酶功能域。酵母系统的分泌试验证明三个候选效应蛋白均具有分泌功能。分别对3个基因进行敲除后发现△VmPOD1、△VmPOD2以及△VmPOD3的营养生长未受影响,但其分生孢子的产生能力相比于野生型03-8显著下降;与此同时,△VmPOD1、△VmPOD2和△VmPOD3在添加有0.06 mol/L H2O2的PDA上受到比野生型03-8更为严重的抑制,说明三个候选效应蛋白参与应对外部环境中H2O2的胁迫压力;进一步qRT-PCR显示三个VmPODs基因均在V.mali侵染苹果的初期显著上调,可能参与了V.mali侵染早期与苹果的互作;并且VmPODs在本氏烟叶片中瞬时表达后能够显著抑制坏死激发子INF1引起的烟草叶片电解质渗漏,显示VmPODs一定程度上抑制了INF1激发的细胞坏死,干扰了INF1激发的植物抗病反应。除此之外,基因敲除突变体△VmPOD3的致病力显著下降,证实了VmPODs的确直接参与了V.mali的致病过程并对其致病力有显著贡献。进一步序列分析显示,VmPODs同源蛋白广泛存在于不同真菌中,其中VmPOD1存在于27个真菌属中,VmPOD2存在于30个真菌属种,VmPOD3存在于48个真菌属中,其中包括多种重要植物病原真菌。本研究证明VmPODs是一类对V.mali生存和侵染过程有显著贡献的效应蛋白,Pod功能域可以以效应蛋白的方式参与致病,含Pod功能域的候选效应蛋白普遍存在于真菌界中,是一类具有潜在的重要功能的效应蛋白。
Abstract
ping guo hei fu pi ke jun Valsa malishi dao zhi ping guo shu fu lan bing de zhu yao zhi wu bing yuan zhen jun ,ji da wei xie wo guo de ping guo chan ye 。zhi wu bing yuan zhen jun zai qin ran ji zhu de guo cheng zhong xu yao duo chong chong yao de zhi bing yin zi can yu ,xiao ying dan bai ze shi ji zhong fei chang guan jian de yi lei 。mu qian suo fa xian de zhi wu bing yuan zhen jun de xiao ying dan bai da duo dou bu ju you bao shou gong neng yu ,dan zhe xie ju you bao shou gong neng yu de xiao ying dan bai yi zai zhi wu bing yuan luan jun he xi jun zhong bei zheng shi ju you ji ji chong yao de yi yi ,yin ci dui zhi wu bing yuan zhen jun zhong ju you bao shou gong neng yu de xiao ying dan bai de yan jiu you li yu shen ru jie shi zhi wu bing yuan zhen jun de zhi bing ji zhi 。Hce2gong neng yu shi mu qian bei fa xian de fen bu zui wei an fan de yi lei zhi wu bing yuan zhen jun xiao ying dan bai bao shou gong neng yu ,dan ji zhi bing de zuo yong fang shi ji ji zhi shang bu ming que ;Pod（Peroxidase）gong neng yu zai sheng wu sheng li dai xie fang mian de gong neng yi jing bei shen ru yan jiu ,dan yan jiu duo ji zhong yu yi xie han you gai gong neng yu de fei fen bi bao nei mei shang ,gai gong neng yu shi fou neng yi xiao ying dan bai de xing shi can yu zhi wu bing yuan zhen jun zhi bing de guo cheng shang bu qing chu 。mu qian ,V.malizhong shang wei fa xian ju you bao shou gong neng yu de xiao ying dan bai 。ben yan jiu ji yu yi ji lie sheng wu xin xi xue ji shu he fen zi sheng wu xue ji shu dui V.malizhong han you Hce2gong neng yu de wu ge xiao ying dan bai VmHEPs（VmHEP1、VmHEP2、VmHEP3、VmHEP4he VmHEP5）jin hang le wa jue he gong neng yan jiu ,bing dui ji zhong ju you ji fa zhi wu xi bao huai si gong neng de VmHEP1jin hang le shang you diao kong ji xia you ba biao de jin yi bu shai shua he yan jiu ;yu ci tong shi ,ben yan jiu hai fa xian le yi lei han you Pod（Peroxiadase）gong neng yu de xiao ying dan bai pu bian cun zai yu ge chong bu tong zhi wu bing yuan zhen jun zhong ,bing tong guo gong neng yan jiu zheng ming V.malizhong de san ge gai lei xing xiao ying dan bai VmPODs（VmPOD1、VmPOD2he VmPOD3）dui V.malide sheng cun he zhi bing you dou chong yao gong suo 。zhu yao yan jiu jie guo ru xia :（1）han Hce2gong neng yu de xiao ying dan bai VmHEPsyi chuan lian ji yin rong yu hu bu de fang shi can yu V.malizhi bing guo cheng ben yan jiu shou xian cong 88ge hou shua xiao ying dan bai zhong jian ding de dao yi ge ju you Hce2bao shou gong neng yu ju neng yin qi zhi wu xi bao huai si de xiao ying dan bai VmHEP1,jin yi bu cong fen bi dan bai zu zhong jian ding chu si ge yu VmHEP1tong yuan ju ju you fen bi gong neng de tong yuan dan bai （VmHEP2、VmHEP3、VmHEP4he VmHEP5）;jing guo ji yin shun shi biao da que ren ,zai VmHEPszhong jin you VmHEP1neng gou yin qi xi bao huai si ;jin hua fen xi xian shi wu ge VmHEPsji yin shi pang ji tong yuan ji yin （paralogs）,ji zhong de VmHEP1he VmHEP2shu yu symparalogs（in-paralogs）,er ji ta san ge ji yin shu yu alloparalogs（out-paralogs）,ci wai ,zai jin hua guo cheng zhong wu ge ji yin liang liang zhi jian bing wei fa sheng xian zhe de fei tong yi an ji suan ti huan ,chu yu chun hua shua ze zhuang tai 。zhi bing li jian ce fa xian ,fen bie qiao chu VmHEPschan ge ji yin hou ,V.malide zhi bing li bing wei fa sheng gai bian ,dan VmHEPszhong VmHEP1he VmHEP2ji yin zai qin ran zao ji jun ming xian de shang diao ,jiang VmHEP1he VmHEP2tong shi qiao chu hou ,V.malizhi bing li fa sheng xian zhe xia jiang 。hou xu fen xi fa xian ,VmHEP1he VmHEP2jun chu yu 11hao ran se ti ju liang zhe jian wu li wei zhi jin jin xiang ju 604 bp,yu ci tong shi qRT-PCRxian shi zai V.maliqin ran ping guo zhi tiao shi ,VmHEP1de que shi hui xian zhe cu jin VmHEP2shang diao ,fan zhi VmHEP2de que shi ye hui cu jin VmHEP1de xian zhe shang diao 。ben yan jiu zheng ming V.malide wu ge VmHEPsji yin shi bu tong chong lei de pang ji tong yuan ji yin ,chu yu chun hua shua ze zhuang tai ,ji zhong de VmHEP1neng gou ji fa xi bao huai si ,tong shi VmHEP1yu VmHEP2shi V.malide chong yao du xing yin zi ,yi ji yin rong yu hu bu de fang shi can yu zhi bing ,tong shi shui ming zhi wu bing yuan zhen jun de xiao ying dan bai ke yi tong guo ji yin chuan lian kao bei de rong yu xie zuo mo shi can yu zhi bing 。（2）VmHEP1ji yin de shang you fei bian ma ou ju you shou qin ran shi jian you dao de ji yin qi dong gong neng bing ju xiao ying dan bai VmHEP1neng gou yu ping guo dan bai MdLRRP1hu zuo ben yan jiu jin yi bu dui VmHEPszhong wei yi ke yi yin qi xi bao huai si de xiao ying dan bai VmHEP1jin hang le shang you qi dong ou yu gong neng he xia you hu zuo ba biao de jian ding he yan jiu 。ji yin zu xin xi fen xi fa xian VmHEP1ji yin de shang you 1500 bpwei fei bian ma ou yu ;ji yu V.malide wei chuan zhuai hua ti ji ,ben yan jiu zheng shi gai 1500 bpfei bian ma ou yu nei cun zai qi dong ou yu neng gou zai V.malizhong qi dong zhuai ru de wai yuan GFPji yin ,bing ju tong guo qRT-PCRzheng shi gai qi dong ou yu de qi dong gong neng shou dao qin ran shi jian de you dao 。ci wai ,tong guo jiao mu shuang za shai shua 、mian yi gong chen dian ji shu he zhi pu ji shu yan zheng ,fa xian xiao ying dan bai VmHEP1neng gou yu yi ge lai zi ping guo de ju you fu liang an suan chong fu jie gou yu （LRR）de dan bai ji mei MdLRRP1jie ge ;jin yi bu li yong VIGSji shu jiang MdLRRP1ji yin zai ben shi yan zhong de tong yuan ji yin NbSERK3jin hang ji yin chen mo ,bing zai ji yin chen mo zhi zhu zhong jin hang VmHEP1de shun shi biao da ,zui zhong tong guo dian jie zhi shen tou lv jian ce fa xian xiao ying dan bai VmHEP1suo yin qi de ben shi yan xie pian xi bao huai si cheng du zai NbSERK3ji yin bei chen mo de ji yin chen mo zhi zhu zhong xian zhe jiang di 。ben yan jiu zheng shi le VmHEP1ji yin shang you cun zai yi ge shou qin ran shi jian you dao de qi dong ou yu ,bing ju chu bu jian ding le xiao ying dan bai VmHEP1neng gou yu ping guo zhong de ba biao dan bai MdLRRP1jie ge he hu zuo 。（3）han Podgong neng yu de xiao ying dan bai VmPODsdui V.malide chan bao 、H2O2nai shou neng li he zhi bing li you xian zhe ying xiang ju pu bian cun zai yu ji ta zhen jun zhong wei le tan jiu ping guo hei fu pi ke jun zhong shi fou cun zai shang wei bei guan zhu de ju you bao shou gong neng yu de xiao ying dan bai ,ben yan jiu gen ju xiao ying dan bai te zheng dui ji yin zu he fen bi dan bai zu jin hang le jin yi bu fen xi ,fen xi fa xian le san ge ju you xin hao tai ju yong you Pod（Peroxidase）bao shou gong neng yu de hou shua xiao ying dan bai VmPOD1、VmPOD2yi ji VmPOD3。xu lie fen xi xian shi ,VmPOD1ju you liang ge guo yang hua qing mei gong neng yu ;VmPOD2ju you yi ge lv hua wu guo yang hua wu mei gong neng yu ;VmPOD3ju you yi ge zhi wu lei guo yang hua wu mei gong neng yu 。jiao mu ji tong de fen bi shi yan zheng ming san ge hou shua xiao ying dan bai jun ju you fen bi gong neng 。fen bie dui 3ge ji yin jin hang qiao chu hou fa xian △VmPOD1、△VmPOD2yi ji △VmPOD3de ying yang sheng chang wei shou ying xiang ,dan ji fen sheng bao zi de chan sheng neng li xiang bi yu ye sheng xing 03-8xian zhe xia jiang ;yu ci tong shi ,△VmPOD1、△VmPOD2he △VmPOD3zai tian jia you 0.06 mol/L H2O2de PDAshang shou dao bi ye sheng xing 03-8geng wei yan chong de yi zhi ,shui ming san ge hou shua xiao ying dan bai can yu ying dui wai bu huan jing zhong H2O2de xie pai ya li ;jin yi bu qRT-PCRxian shi san ge VmPODsji yin jun zai V.maliqin ran ping guo de chu ji xian zhe shang diao ,ke neng can yu le V.maliqin ran zao ji yu ping guo de hu zuo ;bing ju VmPODszai ben shi yan xie pian zhong shun shi biao da hou neng gou xian zhe yi zhi huai si ji fa zi INF1yin qi de yan cao xie pian dian jie zhi shen lou ,xian shi VmPODsyi ding cheng du shang yi zhi le INF1ji fa de xi bao huai si ,gan rao le INF1ji fa de zhi wu kang bing fan ying 。chu ci zhi wai ,ji yin qiao chu tu bian ti △VmPOD3de zhi bing li xian zhe xia jiang ,zheng shi le VmPODsde que zhi jie can yu le V.malide zhi bing guo cheng bing dui ji zhi bing li you xian zhe gong suo 。jin yi bu xu lie fen xi xian shi ,VmPODstong yuan dan bai an fan cun zai yu bu tong zhen jun zhong ,ji zhong VmPOD1cun zai yu 27ge zhen jun shu zhong ,VmPOD2cun zai yu 30ge zhen jun shu chong ,VmPOD3cun zai yu 48ge zhen jun shu zhong ,ji zhong bao gua duo chong chong yao zhi wu bing yuan zhen jun 。ben yan jiu zheng ming VmPODsshi yi lei dui V.malisheng cun he qin ran guo cheng you xian zhe gong suo de xiao ying dan bai ,Podgong neng yu ke yi yi xiao ying dan bai de fang shi can yu zhi bing ,han Podgong neng yu de hou shua xiao ying dan bai pu bian cun zai yu zhen jun jie zhong ,shi yi lei ju you qian zai de chong yao gong neng de xiao ying dan bai 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自西北农林科技大学的张冕，发表于刊物西北农林科技大学2019-07-11论文，是一篇关于苹果树腐烂病论文,致病因子论文,功能域论文,功能域论文,互作靶标论文,西北农林科技大学2019-07-11论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自西北农林科技大学2019-07-11论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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