（重庆市肿瘤研究所/医院/癌症中心重庆400030）
【摘要】目的：观察不同氧浓度对人造血干细胞（Hematopoieticstemcells，HSCs）凋亡情况的影响，及HSCs诱导分化为人软骨细胞（Humanchondrocyte）的情况。方法：将HSCs分别在不同氧浓度下培养分为4个组：3％氧气浓度组、5％氧气浓度组、15％氧气浓度组、20％氧气浓度组(作为对照组)。分别培养6小时、12小时、24小时，观察HSCs细胞凋亡情况，并成功将HSCs体外诱导分化为软骨细胞。结果：HSCs培养6小时，5％氧气浓度组的HSCs凋亡率最低，3%和5％氧气浓度组较对照组比较差异有统计学意义（P﹤0.05）；HSCs培养12小时，5％氧气浓度组的HSCs凋亡率最低，5%和15％氧气浓度组较对照组比较差异均有统计学意义（P﹤0.05）；HSCs培养24小时，5％氧气浓度组的HSCs凋亡率最低，3%和5％氧气浓度组较对照组比较差异有统计学意义（P﹤0.05）。培养6小时、12小时、24小时，氧浓度变化与流式细胞仪检测HSCs凋亡率均具有相关性（P﹤0.01）。HSCs在体外成功诱导分化为软骨细胞。结论：不同氧浓度对HSCs的凋亡有影响。5%氧浓度能抑制HSCs的凋亡。在特定条件下，HSCs在体外可定向诱导分化为软骨细胞。
【关键词】人造血干细胞；氧浓度；凋亡；人软骨细胞
【中图分类号】R551【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2017）24-0115-03
ExperimentalstudiesinapoptosisofHematopoieticstemcellsindifferentoxygenconcentrationandthechondrogenicdifferentiationofitinvitroZhouXiaohong,YangXin.
ChongqingCancerInstitute&Hospital&Cancer,Chongqing400030,P.R.China
【Abstract】ObjectiveToobservetheapoptosisofHematopoieticstemcells(HSCs)indifferentoxygenconcentrationandtime,andthechondrogenicdifferentiationofHematopoieticstemcells.MethodsHSCswererandomlypidedintofourgroupsculturedinoxygenconcentrationof3%,5%,15%,20%,thegroupinoxygenconcentrationof20%isthecontrolgroup.ToobservethepercentofapoptoticaboutHSCsculturedindifferenttime(6h,12h,24h),andpidedHSCsintohumanchondrocyteinvitro.ResultsAfter6hours,thepercentofapoptoticaboutHSCsof5%groupwasthelowest,3%groupand5%groupshowedstatisticalsignificance,comparedwithcontrolgroup(P﹤0.05);after12hours,thepercentofapoptoticaboutHSCsof5%groupwasthe(P﹤0.05);after24hours,thepercentofapoptoticaboutHSCsof5%groupwasthelowest,3%lowest,5%groupand15%groupshowedstatisticalsignificance,comparedwithcontrolgroup(Pgroupand5%groupshowedstatisticalsignificance,comparedwithcontrolgroup(P﹤0.05).ItshowedcorrelationbetweenthedifferentionofoxygenconcentrationandtheapoptoticofHSCs(P﹤0.01)inthe6h,12h,24h.HSCswaspidedintohumanchondrocyteinvitro.ConclusionThedifferentionofoxygenconcentrationhavetheeffecttoHSCsintheapoptosis.CulturedintheoxygenconcentrationoffivepercentcanrestraintheapoptosisofHSCs.TheHSCshavechondrogenicpotentialityinspellculturalmethodinvitro.
【Keywords】Hematopoieticstemcells;Oxygenconcentration;Apoptosis;Humanchondrocyte
人造血干细胞（hematopoieticstemcells，HSCs）是一种能够自我更新并分化为各种血细胞前体细胞，它能最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板等，同时HSCs也可以分化成各种其他细胞。Till和McCulloch在1961年通过“脾集落形成试验”，首先描述了造血干细胞的特性。威斯康星大学的Thomson[1]等人在1988年成功的建立了胚胎干细胞系。此后HSCs被进一步的分化为神经细胞、造血细胞、肌肉细胞、胰岛细胞、骨细胞、软骨细胞等[2,3]。HSCs良好的分化增殖能力对病人损坏的骨组织、软骨组织的修复具有重要意义,使得干细胞能更加广泛的应用于临床。氧浓度在干细胞的培养条件中至关重要，Christine等的研究发现低氧环境对干细胞的生长有影响[4]。因此本研究以氧浓度做为干预条件，观察不同氧浓度下体外培养HSCs的细胞凋亡情况，同时成功的将HSCs诱导分化为软骨细胞。为进一步科研和临床应用提供理论依据。
1.材料与方法
1.1一般资料
HSCs细胞株由上海拜沃生物科技有限公司提供。
1.2仪器与试剂
RPMI1640培养液（上海元龙生物技术有限公司）；IMDM培养基(GIBCO公司)；AnnextinV(美国Becton,DickinsonandCompany)；二氧化碳培养箱(美国ThermoFisher公司)；微氧手套箱(COYLaboratoryProducts公司)；CKC-TR-2W型倒置显微镜（Olympus，Japan）；YJ-875型超净化工作台(苏州安泰净化设备厂)；6孔培养板(北中杉金桥生物技术有限公司)；AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒（南京碧波生物科技有限公司）；BD-CAN7型流式细胞仪（美国Becton,DickinsonandCompany）；高糖DMEM(GIBCO公司)；TGF-β（美国PeproTecH公司）；PBS（上海佳和生物科技有限公司）；甲苯胺蓝染色剂（北京索莱宝科技有限公司）。
1.3方法
1.3.1HSCs细胞培养HSCs用10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养，见图1。
1.3.2不同氧浓度的细胞培养处理将HSCs分成实验组和对照组。实验组细胞在微氧手套箱中培养的氧浓度分别设定为：3%、5%、15%；对照组细胞在微氧手套箱中培养的氧浓度设定为20%。
1.3.3流式细胞仪检测HSCs凋亡率采用10%胎牛血清的RPMI1640培养基，0.9ml培养基加入0.1ml的细胞悬液（细胞密度2×109个/L），用IMDM补充为1mL，将HSCs在不同氧浓度下分别培养6小时、12小时、24小时，使用AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒，通过流式细胞仪检测HSCs凋亡率，见表1。
1.3.4相关性分析氧气浓度3%、5%、15%、20%分别记为3、5、15、20。培养6小时、12小时、24小时，研究不同氧浓度和流式细胞仪检测HSCs凋亡率的相关性分析。相关分析采用Pearson分析，P＜0.01为具有相关性。
1.3.5HSCs诱导分化为软骨细胞用软骨诱导培养基(高糖DMEM，维生素C50ug/mL，地塞米松10～7mol/L，胰岛索6.25ug/mL，转铁蛋白6.2ug/mL，丙酮酸钠1nmoll/L，亚油酸5.35ug/mL，牛血清白蛋白1.25ug/mL)培养HSCs，再加入10ng/mLTGF-β。培养7d细胞形态变化明显，细胞聚集，有明显钙结节形成，见图2。
1.3.6人软骨细胞甲苯胺蓝染色鉴定由HSCs诱导分化成的人软骨细胞用PBS洗涤2次，用4%多聚甲醛固定于6孔板中1h后PBS冲洗，1%甲苯胺蓝染色2h，用90%酒精进行分色，晾干，中性树胶封片。见图3。
1.4统计学处理
数据以（x-±s）表示,不同时间、不同氧浓度组间的数据比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。相关分析采用Pearson分析。用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计学分析。
2.结果
2.1人造血干细胞（hematopoieticstemcells，HSCs）HE染色（图1）
人造血干细胞经HE染色，染色结果阳性，镜下观察可见细胞呈现出梭形、纺锤形，细胞成集落生长。
图1人造血干细胞（HE×400）
Fig.1Hematopoieticstemcells（HE×400）
2.2流式细胞仪检测HSCs凋亡率见（表1）。
培养6小时，5%组HSCs凋亡率最低，3%组、5%组较对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；培养12小时，5%组HSCs凋亡率最低，5%组、15%组较对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；培养24小时，5%组HSCs凋亡率最低，3%组、5%组较对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。
2.3分别培养6小时、12小时、24小时，不同氧浓度和流式细胞仪检测HSCs凋亡率的相关性分析
培养6小时后氧浓度变化与流式细胞仪检测HSCs凋亡率具有相关性（rs=0.743，P＜0.01）；培养12小时后氧浓度变化与流式细胞仪检测HSCs凋亡率具有相关性（rs=0.785，P＜0.01）；培养24小时后氧浓度变化与流式细胞仪检测HSCs凋亡率具有相关性（rs=0.773，P＜0.01）。
2.4人软骨细胞（图2）
由HSCs诱导分化出的人软骨细胞，镜下观察细胞呈多角形、类圆形、短梭形等形态，多角形细胞聚集成团，并可见较大的细胞结节。
图3人软骨细胞（甲苯胺蓝染色×400）
Fig.3Humanchondrocyte（Toluidinebluestaining×400）
3.讨论
HSCs维持生命和代谢的重要元素是氧气，HSCs生物学行为也会根据细胞周围环境中氧气浓度的差异而表现不同。在人体内HSCs生存适宜的环境为低氧环境[5，6]，人体内普遍存在低氧状态的生理现象，低氧环境也促成了胚胎发育和多种病变的发展[7]。但目前国内外对于HSCs的培养多采用常氧条件，这与其在体内存在环境有着较大不同，因此本研究采用不同氧浓度培养HSCs可更加真实的模拟其体内的生长环境。
HSCs作为前体细胞，其特点是具有高度自我更新、自我修复和多向分化的能力。周围各种环境因素影响着HSCs的复制、增殖、多向分化、归巢后重建造血、凋亡等生物功能。HSCs主要生存于骨髓的低氧区[8，9]，高氧环境不利于HSCs正常的增值分化[10]，低氧的环境相对适合于HSCs生物功能完整性及良好的长期保存[11-13]。骨髓、静脉血、动脉血中平均氧气浓度分别为5%、12%～15%、20%。HSCs的体外培养中，氧浓度发挥的重要作用[14]。本实验研究将体外培养HSC是的氧气浓度条件设定为3%、5%、15%、20%，正是为了模拟HSCs在体内不同条件下的生长、凋亡情况，这方面的研究国内外报道较少。软骨组织是组织工程修复的重要材料[15，16]，本研究成功的将HSCs诱导分化为软骨，为手术后组织缺损重建提供了重要的临床实验基础。
本实验研究发现HSCs培养6小时、12小时、24小时，5%氧气浓度组HSCs凋亡率最低。由此我们推论，不同氧浓度对HSCs的凋亡有影响，5%氧浓度能抑制HSCs的凋亡。在特定条件下，HSCs在体外可定向诱导分化为软骨细胞。为今后的临床实验研究提供了依据。
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