香菇多糖的提取及活性研究进展

香菇多糖的提取及活性研究进展

1.赛珂睿德生物医药科技(上海)有限公司上海201203;

2.中国科学院上海药物研究所糖化学与糖生物学实验室上海200031

摘要:香菇多糖是从香菇中分离纯化的一种主链以β-(1→3)-葡聚糖为主、侧链为β-(1→6)-连接的葡聚糖,是以增强T细胞和巨噬细胞功能为主的免疫增强剂,具有通过免疫激活功能发挥抗肿瘤活性等重要的生物活性,疗效好、毒副作用小,在保健食品和药品研发方面具有很好的应用前景。本文综述了香菇多糖的化学结构、分离纯化以及生理活性和作用机制等方面的研究概况。

关键词:香菇多糖;化学结构;提取;纯化;生物活性

多糖来源于高等植物、微生物(细菌和真菌)、地衣和海藻等,是自然界中含量最丰富的生物聚合物,具有能量储存、结构支持、防御功能和抗原决定性等多方面的生物功能[1]。真菌多糖作为药物研究始于20世纪50年代,在60年代以后成为免疫促进剂受到广泛关注,香菇多糖(1entinan,LNT)是研究得较透彻的多糖之一[2]。

香菇[Lentinusedodes(Berk.)Sing]为担子菌纲伞形科真菌,是世界名贵食用菌兼药用菌之一,素有“蘑菇皇后”之称。1968年日本千原吴郎首先利用热水从香菇子实体中浸提出6种胞外多糖;1970年Chihard和Sasaki等人证明从香菇中提取出的香菇多糖(一种β-(1→3)-D葡聚糖,LNT),并发现它具有明显的抗肿瘤活性[3,4]。自此,香菇葡聚糖广受关注,许多研究者[5-7]发现香菇葡聚糖通过刺激人体免疫细胞(如T细胞,巨噬细胞等),对多种肿瘤细胞具有自然杀伤能力。近十几年,香菇葡聚糖被用作治疗癌症的辅助药物以及提高免疫力的保养品,已受广泛重视。由于长期以来香菇多糖提取产量低、纯化难度大、结构构象及其与生物活性间的关系不明确等,极大地限制了其研究开发与应用。

本文就近年来国内外香菇多糖的研究进行了综述,包括香菇多糖的化学结构、分离纯化、生理活性及作用机制等方面的研究概况,旨在对我国香菇多糖的研究开发和应用有所裨益。

1.香菇多糖的化学结构

天然高分子的化学结构十分复杂,而且不同的化学结构会导致不同的生物活性。目前,已明确香菇多糖的免疫活性与其一级结构有关[8]。香菇多糖的一级结构具有β-(1→3)连接的吡喃葡聚糖主链,在主链中葡萄糖的C6位上含有支点(每5个葡萄糖有2个支点),其侧链是由β-(1→6)键和β-(1→3)键相连的葡萄糖聚合体组成,在侧链上也含有少数内部β-(1→6)键的葡聚糖[9](如图1)。Sasaki等[10]和张俐娜等[11]证明香菇葡聚糖是一种线型的β-(1→3)-D-葡聚糖(Lentinan),其分子结构为主链上每5个D-吡喃(gluopyranosyl)残基含两个通过(1→6)键接的D-吡喃残基支链,即每个重复单位含7个残基,侧基总含量为23%。

香菇多糖溶于热水和稀碱溶液,对光和热稳定,具吸湿性。香菇多糖在水溶液或0.9%NaCl水溶液中作为三重螺旋构象,而在二甲基亚砜(DMSO)中以单个柔性链存在[12]。张俐娜等[13-16]还指出香菇多糖在水/DMSO混合溶剂中、NaOH溶液中或者加热至140°C以上,会从三股螺旋链转变为无规线团链。香菇葡聚糖只有在三股螺旋链构象时具有明显的抗肿瘤活性,当转变为无规线团时,其抗肿瘤活性明显降低甚至消失[12]。

2.香菇多糖的分离纯化

2.1香菇多糖的提取

香菇葡聚糖的提取方法主要有:溶剂法、酶法、超声法、高压法、超滤法等。目前,使用最广泛的是溶剂提取法;另一种是利用超声或者高压破坏细胞壁来提取。最常用的是“水溶醇沉法”,即将香菇子实体或菌丝体破碎,于热水中煮沸4h进行过滤,滤渣再反复提取2~3次。取滤液加入95%乙醇进行沉淀,离心后取沉淀干燥,即为香菇粗多糖。这种方法由Chihara等人[4]在1969年首次使用,并被沿用至今。2001年,Yap和Ng[17]将从香菇中用热水提取出的粗多糖通过浓缩和乙醇沉淀的方法进行初步的纯化,得到的沉淀再次溶解在碱溶液里,过滤,用酸中和滤液,得到的提取物用氯仿/正丁醇的混合液脱去残留的蛋白质(Sevag法[18])。热水提取法是目前工业生产香菇葡聚糖使用最为广泛的方法。但使用热水和有机溶剂提取香菇葡聚糖的产率很低,在0.12%左右[19]。最近,张俐娜课题组建立了一种用1.25MNaOH/0.05%NaBH4溶液从香菇子实体中提取香菇葡聚糖的方法[11,12,16],产率高达5%,具有工艺简单、成本低、高效高产等显著优点。

微波法和超声法也用于辅助提取香菇多糖,该方法提取时间短、操作简单、产率相对较高,越来越引起人们重视[20]。刘一等[20]利用超声波辅助热水浸提法提取香菇多糖,采用正交试验优化工艺条件,其最佳工艺参数为:浸提温度70°C、浸提时间120min、料液比1:60(g:mL)、多糖得率可达3.37%。

近几年,超滤技术也被用于香菇葡聚糖的提取工作[21]。超滤法主要是通过在超高压下用液体从香菇干粉中提取香菇粗多糖。高压环境下细胞壁内外渗透压会增大,提高多糖产率,同时可以杀死一些微生物;此外,超滤法不仅具有提取周期短、成本低等特点,还可以避免高温提取或碱提对香菇葡聚糖生物活性的影响。范云鹏等[22]采用超滤-渗滤法改进香菇多糖的提取纯化工艺,改善了产品纯度,提高了产品收率,其最佳超滤操作条件为30°C、0.3Mpa,经超滤的透过液,根据超滤膜的截留分子量不必增加除蛋白与醇析这两道工序,使工艺流程变短。

近年,国内已开始将生物酶应用于多糖的提取,酶法处理可以提高多糖的提取率,减少能耗,缩短提取时间。香菇多糖通常被包裹在植物细胞壁中,并常与蛋白质结合,以蛋白多糖的形式存在,中性蛋白酶能有效酶解与多糖结合在一起的蛋白质,将多糖释放出来,从而提高多糖得率和纯度[23,24]。

2.2香菇多糖的分离纯化

多糖常用的纯化方法有:分级沉淀法、柱层析法、制备性区域电泳法、超滤法等。目前采用最多的方法还是利用各种不同的凝胶层析柱色谱和离子交换柱色谱来纯化香菇多糖。分级沉淀法是根据不同相对分子质量的香菇多糖在不同浓度的低级醇中能够分布沉淀出来,从而达到分离纯化的目的[25,26]。醇浓度越大,沉淀出来的相对分子质量越小。

柱层析方法操作简单,分离效果好,目前应用最多。离子交换柱层析是以离子交换树脂作固定相,在流动相带着试样通过离子交换树脂时,由于不同离子强度的分子与固定相具有不同的亲合力而获得分离的色谱法,能通过载体表面带电基团与样品离子和洗脱液离子进行可逆交换、离子偶极作用和离子吸附,来实现色谱分离。常用的交换剂有DEAE-纤维素、DEAE-交联葡聚糖等。滕利荣等[27]将香菇多糖经乙醇沉淀、Sevag法除杂蛋白,用SephadexG-75柱层析分离,得到两种组分的香菇多糖。

凝胶柱层析是根据多糖分子的大小和形状不同即按分子筛的原理进行分离。常用的凝胶有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶以及性能更佳的Sephacryl、Sephadex等,以不同浓度梯度的盐溶液作为洗脱剂,使不同大小的多糖分子得到分离和纯化。林志超等[28]建立了一套从香菇子实体浓缩液中快速高效分离纯化香菇多糖的工艺,即:采取超滤、乙醇沉淀、DEAE-纤维素柱层析、SephadexG-200凝胶柱层析、聚丙烯酰胺凝胶连续电泳等一系列分离纯化检测方法。

超滤法是根据溶液中多糖分子的大小和形状不同,在一定压力下使其通过超滤膜,该超滤膜只允许一定分子量范围的多糖通过,其实也是根据分子筛原理。超滤分离技术的工艺流程简单、工序少;但是在实际操作中,大多数超滤膜会吸附多糖,使其收率大大降低。此外,多糖溶液粘度一般来说都比较大,用超滤法速度慢、时间长,在室温下容易变质;而且如果多糖分子的形状为线性,其相对分子质量大的多糖也会透过超滤膜,所以效果不是很好。麻兵继等[29]提取了香菇子实体多糖,并用浓硫酸法进行结构修饰,经不同分子量超滤膜超滤进行分级得到6个香菇硫酸化分级多糖。

制备型区域电泳是根据不同多糖在电场的作用下按分子量、形状及其所带电荷的不同而达到分离的效果。但该方法分离时间较长,分离的量也很少,只适用于实验室半微量制备。

3.香菇多糖的生物活性及其作用机制

近年来,国内外学者发现只有具有三重螺旋高级结构的香菇多糖才有生物活性[41]。香菇多糖具有抗肿瘤、免疫调节、降血脂、降血糖、抗疲劳、抗感染、抗病毒等生物活性。

3.1抗肿瘤作用

香菇多糖具有抗肿瘤作用,它安全有效、没有化疗药物的毒副作用。研究发现,香菇多糖的抗肿瘤作用并不是通过直接杀伤肿瘤细胞实现的,而是通过非特异性地激活免疫系统、激活宿主产生抗肿瘤免疫应答、增强免疫反应来间接的抑制和杀伤肿瘤细胞(免疫疗法)[30]。包括增强T、B淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)细胞、淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)等多种免疫相关细胞的作用[31]。在这些细胞因子的综合作用下,机体免疫系统增强,对肿瘤细胞起防御与杀伤作用。

目前,香菇多糖作为一种增强免疫制剂广泛应用于临床,主要是在肿瘤术前注射或是联合化疗药物共同作用[32-33]。由中国科学院上海药物研究所方积年教授等研发的香菇多糖粉针剂和静脉注射剂于2003年上市,用于胃癌病人,特别是手术后晚期胃癌病人及不能手术的胃癌病人。井欢[32]等在香菇多糖联合顺铂诱导Lewis荷瘤小鼠肿瘤细胞调亡的研究中发现香菇多糖具有协同抗肺癌作用。吴东红等[33]做了关于香菇多糖协同阿糖胞苷(Ara-c)对HL-60白血病细胞增殖力影响的研究,结果表明香菇多糖对白血病的直接作用较少,而与Ara-c联用时可以增强Ara-c对白血病细胞增殖的抑制、减弱其集落形成能力,提示LNT对Ara-c杀伤白血病细胞效应有协同作用。

此外,香菇多糖还可调节免疫细胞释放细胞信使,如细胞因子类[34]。Okamoto等[35]研究了香菇多糖对细胞色素P4501A亚科(CYP1A)表达的抑制作用。细胞色素P450s(CYPs)含有CYP1A,其代谢可以形成前致癌物,香菇多糖可使CYP1A下降调,通过诱导细胞因子产生抗癌和免疫调节活性。

3.2免疫调节作用

香菇多糖的免疫调节活性是其生物活性的重要基础。其免疫作用特点在于它能识别脾及肝脏中抗原的巨噬细胞,促进淋巴细胞活化因子(LAE)的产生,释放各种辅助性T细胞因子,增强宿主腹腔巨噬细胞吞噬率,恢复或刺激辅助性T细胞的功能[36]。香菇多糖在体内能激活NK细胞,促进干扰素(IFN)的分泌。此外,香菇多糖还能激活补体系统,促进抗体生成,使巨噬细胞溶酶体酶和白细胞介素1分泌量增加。林卡莉等[37]探讨香菇多糖对肿瘤的作用效果及其对荷瘤S180鼠免疫功能的影响,发现香菇多糖能改善骨髓造血机能,使外周血淋巴细胞数量显著增加,增强机体免疫功能;能影响荷瘤机体T细胞亚群的比例,具有明显的免疫调节作用。罗若荣等[38]通过建立免疫缺陷模型,经复方活性多糖干预,采用流式细胞术观察T细胞亚群等变化,发现常量组对淋巴细胞、CD3+、CD4+的增殖有明显的促进作用,脾指数、胸腺指数明显增加。说明香菇多糖等具有增强细胞免疫调节功能。香菇多糖作为免疫增强剂,在临床上多与抗肿瘤药物联合应用。武汉大安制药有限公司研制的注射用香菇多糖脂质体,与注射剂相比,其免疫功能有所提高[39]。

3.3抗病毒作用

有研究显示,香菇多糖对Abelson病毒、A2(H2N2)病毒、12型腺病毒及流感病毒感染均有抑制作用,是治疗各种肝炎特别是慢性迁移型肝炎的良好药物[2,40]。香菇多糖可以激活人体免疫系统,使其更有效的对抗病毒增殖。体液中游离的糖分子可以与病毒结合起到屏蔽作用。多糖类还有抗逆转录病毒活性[41]。张福平等[42]应用不同浓度及不同的给药方式探讨香菇多糖对流感病毒抑制作用的机理,用MTT法检测香菇多糖对病毒感染细胞的保护率,表明香菇多糖对流感病毒有一定的抑制作用,对病毒感染细胞的保护率可达95.6%。

HIV是最难对付的病毒之一。硫酸化香菇多糖具有显著抗HIV作用,体外10mg/L就完全抑制HIV抗原的表达;临床使用能协同叠氮胸苷(AZT)更好地抑制HIV抗原的表达[43,44]。硫酸根对其抗病毒活性强度有一定影响,发现硫酸化香菇多糖在每葡萄糖单位1.7个硫酸根时,抗HIV-1活性最强[45]。

3.4抗感染作用

香菇多糖抗感染的机制与多糖本身的特性有关。病原体表面的糖蛋白识别正常细胞表面的糖分子并发生黏附作用,引起感染的必要前提。香菇多糖能增强宿主的抵抗力,也可抑制抗菌药的耐药性[47];同时可用于治疗结核杆菌感染,产生耐药性的肺结核病人,用香菇多糖治疗一段时间后,病人痰菌转阴性,中性粒细胞吞噬性增加。香菇多糖的作用机理可能是多糖分子表面与病原体表面发生粘附作用,阻截了病原体与正常细胞表面糖分子的结合,进而阻断其感染途径。

3.5降血糖作用

有研究显示,香菇多糖有显著的降血糖、改善糖耐量、增加体内肝糖原的作用,其作用是通过调节糖代谢、促进肝糖原合成、减少肝糖原分解引起的[48]。与化学合成药相比,具有降糖作用的香菇多糖毒副作用小,适合于对糖尿病的长期控制。

王慧铭等[49]研究香菇多糖对实验性高血糖大鼠血糖、糖耐量和血清胰岛素水平的影响,结果显示:香菇多糖有明显降血糖作用(P<0.05),其作用具有时效性、剂量性,且高剂量组的降血糖效果与药物对照组在统计学上无明显差异。在试验期内香菇多糖能明显改善高血糖大鼠的糖耐量(P<0.05),而对血清胰岛素水平的影响不明显。说明香菇多糖的降血糖的作用不是通过胰岛素,可能是通过调节糖代谢、促进肝糖原合成、减少肝糖原分解引起[50]。陈三妹等[51,52]通过光镜和透射电镜观察香菇多糖对大鼠心肌的形态学改变来研究其对糖尿病大鼠心肌的保护作用,发现LNT治疗组心肌纤维损伤及间质纤维增生明显减轻,心肌组织内超氧化物歧化酶(SOD)活性LNT治疗组明显高于糖尿病组,一氧化氮合成酶(NOS)活性及丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量LNT治疗组低于糖尿病组;由此说明LNT可能通过抗脂质过氧化作用和降低NO水平对糖尿病心肌产生保护作用。

3.6其它作用

香菇多糖还具有其它生物活性,如降血脂、抗炎、抗疲劳、抗辐射、抑制血小板凝结等作用[53-56]。王慧铭等[53]研究了香菇多糖对高脂血症大鼠的降血脂作用:分别测定总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及其亚类HDL3-C、HDL2-C和卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(LCAT)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、肝脂酶(HL酶)活性。结果显示香菇多糖可明显降低高脂血症大鼠的血清总胆固醇,这可能与香菇多糖能明显增强LCAT、LPL酶活性,并提高HDL-C的水平(尤其是HDL2-C水平)有关。周立国等[56]观察香菇菌多糖对大鼠血小板聚集功能的影响。结果表明,香菇菌多糖的剂量在2.63mg/(kg·d)时,对大鼠的血小板聚集功能无抑制作用;而剂量在26.25mg/(kg·d)时,对大鼠的血小板聚集功能有抑制作用。

4.总结

随着现代科技的发展及人类生活水平的提高,人们对食品结构的观念从温饱问题到营养和保健发生了巨大转变。香菇,作为人类的重要食品资源,在高附加值的保健产品和药品方面已被广大消费者所接受。尤其是香菇多糖,在亚健康和肿瘤的预防及康复上有其独特的价值,为其产品的开发提供了广阔的市场空间。目前,市面上已有香菇多糖保健品和药品的相关产品,如香菇提取物口服液、香菇多糖注射液、香菇菌多糖片、香菇多糖口腔膜剂、香菇多糖冻干粉针剂、香菇多糖胶囊、香菇多糖脂质体等。香菇多糖也将在加强其构效与剂型的研究过程中,进一步提高其在食品工业、发酵工业、医疗保健等领域的广泛应用。

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