一、源于骨髓间充质干细胞的神经元存活与c-myc（论文文献综述）
肖丽[1]（2021）在《瞬目反射评估2型糖尿病患者中枢神经系统损害的临床研究及黄芪多糖、人参皂苷Rg1优化人脐带间充质干细胞向神经干细胞转化的实验研究》文中研究说明瞬目反射评估2型糖尿病患者中枢神经系统损害的临床研究背景和目的:糖尿病的并发症可涉及多个器官和系统,包括神经系统。以往的电生理研究主要集中在周围神经系统方面,对颅神经和中枢神经系统的研究较少。因此,糖尿病患者早期中枢神经系统损害更容易被忽视和误诊。瞬目反射能为颅神经和中枢神经系统提供客观评估。然而,在2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）患者中,体重指数、头晕与瞬目反射之间的关系尚未被探讨。此外,作为瞬目反射参数之一的R2时限,至今尚未被研究。本研究旨在探讨T2DM患者瞬目反射的特点及影响因素,以期能为T2DM患者中枢神经系统损害的早诊断、早治疗提供电生理依据;为研究T2DM患者中枢神经系统损害建立预测模型。方法:设计一项横断面观察研究,纳入健康志愿者和T2DM住院患者。通过两个独立样本的t检验、单因素方差分析、logistic回归分析及ROC曲线分析瞬目反射参数（包括R1潜伏期、同侧R2潜伏期、对侧R2潜伏期、同侧R2时限和对侧R2时限）与2型糖尿病患者的性别、年龄、体重指数、病程、糖化血红蛋白、远端对称性多神经病变（distal symmetrical polyneuropathy,DSPN）、头晕症状的关系。结果:1.瞬目反射的各项参数与性别、年龄、糖化血红蛋白无相关性。2.瞬目反射潜伏期（包括R1、同侧R2和对侧R2潜伏期）与体重指数呈负相关,与T2DM病程呈正相关。3.与不伴DSPN的患者相比,伴DSPN的T2DM患者的瞬目反射潜伏期（包括R1、同侧R2和对侧R2潜伏期）更长,R2时限（包括同侧和对侧R2时限）更短。4.与无头晕的患者相比,头晕患者瞬目反射的潜伏期（包括R1、同侧R2、对侧R2潜伏期）较长,R2时限（包括同侧R2、对侧R2时限）较短。5.R2时限也是瞬目反射异常的预测因素。R2潜伏期是T2DM患者头晕的最敏感因子和最佳预测因子。结论:伴有低体重指数、长病程、DSPN及头晕症状的T2DM患者更容易出现瞬目反射异常,提示这些患者的颅神经或中枢神经系统损伤更严重。黄芪多糖、人参皂苷Rg1优化人脐带间充质干细胞向神经干细胞转化的实验研究背景和目的:多项研究表明,糖尿病会引起中枢神经系统的退行性改变,从而导致认知功能下降等症状出现。另外,随着社会的发展,脑卒中、神经系统退行性变及外伤所致的神经系统疾病的发病人数逐年增加,而目前这些疾病的临床治疗效果并不理想。神经干细胞（Neural stem cell,NSCs）移植为这些疾病的治疗带来了新的希望。来自胚胎组织和流产胎儿大脑的人类神经干细胞曾被认为是治疗神经退行性疾病和其他中枢神经系统疾病最有希望的候选细胞。然而,免疫排斥、伦理和成本问题限制了这些异体神经干细胞的使用。已有研究表明人脐带间充质干细胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）可转化为神经干细胞和神经样细胞且仍保持免疫调节和抗氧化活性。反式维甲酸、积雪草等诱导剂可促进hUCMSCs转化成神经干细胞或神经样细胞的比例。但这些药物在促进细胞转化的同时,会减少细胞增殖或促进细胞凋亡。本研究旨在探讨黄芪多糖（Astragalus polysaccharides,APS）、人参皂苷Rg1优化hUCMSCs向神经干细胞转化的实验研究。方法:1.hUCMSCs的分离、培养及鉴定:1)将沃顿氏胶从脐带分离,剪成1mm2左右的碎片,均匀地铺在175cm2无菌塑料培养瓶中培养;2)采用形态学观察、流式细胞术检测细胞相关分子标志物表达;3)体外诱导hUCMSCs成骨、成脂、成软骨分化检测其多向分化潜能。2.NSCs的产生、鉴定:1)将hUCMSCs加入到神经干细胞诱导培养基中常规培养;2)采用连续传代培养及次级成球实验检测诱导而来的神经球的自我更新能力;3)采用细胞免疫荧光染色检测这些神经球向神经元及神经胶质细胞的再分化能力;4)采用流式细胞术及细胞免疫荧光染色检测诱导后神经球的神经干细胞标志物Nestin及SOX2的表达;5)采用流式细胞术检测诱导后的NSCs间充质干细胞表面标志物CD90和人白细胞相关抗原D（HLA-DR）的表达情况。3.APS、人参皂苷Rg1的最佳剂量的确定:1)制备含有不同浓度APS及人参皂苷Rg1的间充质干细胞培养基。采用CCK-8法检测不同浓度APS及人参皂苷Rg1对hUCMSCs增殖的影响;2)制备含有不同浓度APS及人参皂苷Rg1的神经干细胞诱导培养基。采用CCK-8法检测不同浓度APS及人参皂苷Rg1对hUCMSCs向NSCs转化过程中细胞活力的影响。4.评估APS及人参皂苷Rg1对hUCMSCs向NSCs转化过程中细胞凋亡的影响。采用Annexin V-PI法分别检测阴性对照组、APS组及人参皂苷Rg1组的细胞凋亡情况。5.评估APS及人参皂苷Rg1对hUCMSCs向NSCs的转化效率的影响:采用流式细胞术及细胞免疫荧光染色分别对阴性对照组、APS组及人参皂苷Rg1组的CD90、HLA-DR、Nestin及SOX2蛋白进行定量。6.APS及人参皂苷Rg1提高hUCMSCs向NSCs的转化效率的相关机制初探:采用Q-PCR技术检测相关信号通路m RNA的表达水平变化。结果:1.采用组织块贴壁培养法可大量获得hUCMSCs。这些细胞呈均匀纺锤样漩涡状生长,并具有在塑料培养瓶内贴壁生长的能力。流式细胞术检测CD44、CD73、CD90、CD105的表达均大于95%,CD34、CD45、HLA-DR的表达均小于2%。体外诱导实验表明hUCMSCs可成功分化为骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞,具有多分化潜能。2.hUCMSCs来源的神经球具有自我更新能力及向神经元、神经胶质细胞再分化的潜能。这些神经球的神经干细胞标志物Nestin及SOX2表达呈阳性。3.APS及人参皂苷Rg1促进hUCMSCs增殖和向NSCs转化的最佳剂量分别为1.6mmol/L和10μmol/L。4.APS及人参皂苷Rg1能够有效抑制hUCMSCs向NSCs转化过程中细胞的凋亡。5.CD90蛋白的表达随诱导时间的延长而降低且APS组、Rg1组细胞CD90表达量的下降比阴性对照组更明显。6.经APS、人参皂苷Rg1诱导后的神经干细胞依然不表达HLA-DR。7.APS组及人参皂苷Rg1组的Nestin及SOX2蛋白的表达水平均高于阴性对照组。8.APS及人参皂苷Rg1可下调hUCMSCs向NSCs转化过程中Wnt/β-catenin和Notch信号通路相关基因GSK3β、β-catenin、Notch和Hes1的m RNA的表达。结论:1.APS、人参皂苷Rg1可以显着优化人脐带间充质干细胞向神经干细胞转化。2.APS及人参皂苷Rg1提高转化效率可能与其抑制Wnt/β-catenin和Notch信号通路有关。3.移植APS或人参皂苷Rg1参与诱导的NSCs有望为治疗糖尿病中枢神经系统损害、脑卒中、神经退行性变及创伤所致神经系统疾病带来更好的疗效。
杨玉花[2]（2020）在《人皮肤角质形成细胞来源的诱导性多能干细胞的研究》文中进行了进一步梳理背景:体细胞重编程可以产生诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）。产生的患者特异性干细胞不仅能模拟人类疾病过程,研究发病机制,还能用于药物开发和筛选,以及为个性化再生细胞疗法提供新的机会。目的:探索一种快速简便、不损伤细胞活性、能高效产生诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）的方法,并评价应用该法获得的iPSCs在体外诱导为皮肤黑素细胞的可能性,为临床治疗色素性疾病提供研究基础。方法:1.分离酶消化修剪后包皮,获得表皮片,一部分做组织培养,另一部分进一步消化成细胞悬液培养。健康个体包皮来源的表皮片平铺在基质胶包被的培养板上培养3周,获得KCs,并进行KSCs标志物K15免疫荧光染色,证实表皮中KSCs的存在。胰酶消化表皮获得表皮KCs悬液,接种在预先IV型胶原包被的六孔培养板,留取15min内贴壁的细胞继续培养。培养24 h后,采用K15抗体、SOX2和OCT4抗体以及干细胞活细胞染料CDy1,进行染色。未染色孔的细胞用胚胎干细胞培养基继续培养1周,观察细胞形态,70%融合后传代培养。15 min未贴附的细胞也同步培养,作为对照研究。拔取的毛囊放入基质胶包被的培养板进行体外培养,分析毛囊KCs的OCT4和NANOG的DNA甲基化水平,与表皮中的KCs相比较。2.用携带OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四种转录因子混合的慢病毒转染富集的表皮KSCs获得iPSCs。观察和记录产生的克隆的形态和时间,采用干细胞标记物的相应抗体、碱性磷酸酶检测试剂盒、干细胞活细胞CDy1染料进行检测。分析OCT4和NANOG启动子区域的DNA甲基化水平,RT-PCR检测多潜能基因表达。采用含有不同因子的诱导培养基,诱导iPSCs分别分化成为肝细胞、脂肪细胞、神经细胞、MCs等。用携带4种转录因子的慢病毒转染毛囊KCs,观察iPSCs的形成。将iPSCs种植到SCID小鼠的后肢皮下,观察畸胎瘤的形成,获取畸胎瘤后,进行组织病理和免疫组化检测。从畸胎瘤中获取细胞,分别在KCs培养基、M254培养基和DMEM培养基中培养,观察细胞形态。3.分离酶消化修剪后包皮获得表皮片,通过不同培养方法分别获得KCs、MCs、成纤维细胞（fibroblasts,FBs）。用携带OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四种转录因子混合的慢病毒分别转染KCs、MCs并获得相应的iPSCs,FBs通过长时间胰酶消化获得Muse细胞。透射电镜观察人皮肤KCs、MCs及重编程产生的iPSCs和Muse细胞的超微结构。结果:1.表皮片贴附在基质胶包被的培养板底部,产生外向性生长的KCs,中心区域细胞体积小,表皮片外缘的细胞体积逐渐变大,细胞呈多边形。K15抗体染色显示,皮片中心区域阳性细胞密集,周边区阳性数目减少,证实KSCs的存在和大致分布。用胰酶消化未培养的表皮片,获得细胞悬液,这些细胞接种到IV型胶原包被的培养板后,15 min内大约有20～30%的细胞贴壁。快速贴壁的细胞体积较小。24 h后,细胞黏附牢固,部分开始增殖,K15染色和干细胞活细胞染料CDy1染色,明显阳性。而针对干性特异性标志物SOX2和OCT4的染色呈弱阳性。用胚胎干细胞培养基继续培养快速贴壁细胞1周,可见大小不等的克隆形成。相比之下,同步培养的慢贴壁细胞也有克隆形成,但比快速贴壁细胞的克隆小。拔取的毛囊很容易贴附到基质胶上,从毛外根鞘处爬出很多KCs,其中许多呈克隆样生长。传代培养的毛囊KCs和表皮KCs的SOX2和OCT4的甲基化水平相近。2.获得的表皮KSCs传代培养后,进行细胞转染。最早在第7天出现第一个克隆,在10天可见很多典型的iPSCs。干细胞特异性标记物SOX2、OCT4、NANOG和SSEA3染色阳性。干细胞活细胞CDy1染料呈阳性,碱性磷酸酶染色细胞呈紫红色。与亲本KCs相比,获得的iPSCs显示OCT4和NANOG启动子DNA去甲基化。RTPCR检测结果示:iPSCs中SOX2、OCT4、NANOG基因表达水平高于亲本的KCs,而亲本KCs的KLF4基因表达水平高于iPSCs。拟胚体在明胶包被的培养板生长良好,自分化培养可出现外胚层、中胚层和内胚层细胞。用不同分化培养基,诱导iPSCs逐渐分化成为肝细胞、脂肪细胞、神经细胞、MCs,特异性染色相应为AFP（+）、油红O染色（+）、βIII-微管蛋白（+）、神经丝（+）、HMB45（+）和TYR（+）。用四种因子转染毛囊KCs,同样可获得iPSCs。将产生的iPSCs注射到4周龄SCID小鼠后肢皮下,第8周肿瘤长到足够大小,切取畸胎瘤组织进行病理和免疫病理学检查。结果显示:Vimentin（+）、CK（pan）（+）和KI-67（+）阳性,GFAP和AFP染色为阴性。从畸胎瘤组织获得的单细胞,在KCs培养基中生长3周细胞小而圆体,核浆比大,细胞荧光仍然很强,培养6周后细胞排列紧密,细胞活力好,增殖快速。在DMEM培养基中生长3周时细胞主要是圆形,部分有突起,培养6周的细胞,细胞显出扁平形,类似纤维细胞的形态。在M254培养基中生长3周以细小圆形细胞为主,可见部分细胞有少量突触样结构,培养6周的细胞显示出细长的树突,类似MCs的形态。3.透射电镜显示KCs胞体大致呈方形,细胞核大,有一个核仁。MCs呈椭圆形,并且细胞核染色质聚集性差,胞质中可见膜包裹的黑素小体。MCs和KCs重编程产生的iPSCs的超微结构大致相同,细胞呈圆形,具有多个核仁,细胞质稀少,核浆比高,可见发育不良的内质网和高尔基复合体。FBs胞体呈梭型或不规则形,细胞核呈椭圆形或圆形,染色质丰富,细胞器较多。Muse细胞核质比高,细胞核有较多突起,核仁体积较大,细胞质内细胞器较少,相对幼稚。结论:1.KCs混悬液接种在IV型胶原包被的培养板中,15 min内贴壁的细胞富含KSCs。拔取毛发可获得大量的KCs,与表皮来源的KCs类似,包含大量的KSCs。2.用携带四种转录因子的慢病毒转染表皮KSCs,可高效率和较短时间出现iPSCs。这些细胞具有多能性,并可被诱导分化成为不同类型细胞。拔取毛发获的KCs可被重编产生iPSCs。iPSCs接种到SCID小鼠皮下,可产生肿瘤。畸胎瘤细胞在不同培养基中生长呈现不同形态。3.透射电镜显示KCs重编程产生得iPSCs的超微结构与MCs来源的iPSCs超微结构以及Muse细胞的超微结构近似,核浆比高,多个核仁,细胞浆中细胞器较少,且发育不成熟。
杨桂然[3]（2020）在《成纤维细胞联合血管内皮细胞促进脂肪干细胞增殖及成骨分化研究》文中指出目的:为进一步优化组织工程骨仿生性能,本研究拟通过将具有优良增殖分化性能、分泌合成胶原能力、含多种调控因子的成纤维细胞（FB）与血管内皮细胞（VECs）联合共培养脂肪间充质干细胞（ADSCs）,探讨FB对ADSCs的作用,明确FB是否能加强VECs的直接诱导作用,为解决组织工程骨形成缓慢、血管化缓慢等问题以及临床骨缺损治疗方案提供捷径和新思路。方法:①将血管内皮细胞、成纤维细胞、脂肪干细胞三种细胞株分别体外培养,并通过细胞形态学及表面标记进行检测和鉴定,确定其各自细胞生物学特性;②将细胞分为四组:ADSCs组、ADSCs+VECs共培养组、ADSCs+FB共培养组、ADSCs+VECs+FB共培养组,分别倒置显微镜下观察细胞的形态变化;③CCK-8法绘制出各组细胞的生长曲线,比较各组细胞增殖情况;④共培养第7、14、21、28天各组进行茜素红染色、ALP染色,分别进行定性及定量检测;⑤共培养第3周行Western blot检测各组BMP-2蛋白水平表达;⑥共培养第3周行RT-PCR检测成骨标志基因（ALP、OCN）mRNA的表达,以评估共培养体系的成骨分化能力。结果:①三种细胞的形态及增殖情况良好,ADSCs的CD90、CD105（+）,成骨诱导（+）;VECs的CD133、vWF（+）;FB的Vinmintin（+）;②ADSCs+VECs+FB共培养组培养至14天时,细胞之间出现许多突触相互连接,部分细胞融合成团块状,呈巢状分布,而ADSCs单独组细胞形态单一,未见细胞团出现;③生长曲线可见各组细胞吸光度逐渐升高,各组生长曲线形态基本相同,ADSCs+VECs+FB共培养组OD值最高;④茜素红染色定量分析第14天时,ADSCs组与ADSCs+VECs组比较、ADSCs+FB组与ADSCs+VECs+FB组比较无明显差异（P>0.05）,第21天时,除ADSCs组与ADSCs+VECs组比较无明显差异外（P>0.05）,其余各时间、各组组间两两比较均有统计学差异（P<0.05）;ALP染色定量分析各时间段组间均有统计学差异（P<0.05）;除第21天时,B组与C组比较无明显差异外（P>0.05）,其余各个时间点、各组组间两两比较均有统计学差异（P<0.05）;⑤Western Blot结果显示四组细胞均有表达,ADSCs+FB组和ADSCs+VECs+FB组的表达较明显,且ADSCs组与ADSCs+VECs组相比无明显差异（P>0.05）,其余各组组间两两比较均有统计学差异（P<0.05）;⑥RT-PCR结果显示对于ALP mRNA的表达,ADSCs组与ADSCs+FB组相比无明显统计学差异外（P>0.05）,其余各组相比均有统计学差异（P<0.05）,对于OCN mRNA的表达,除ADSCs组与ADSCs+VECs组相比无明显统计学差异外（P>0.05）,其余各组相比均有差异（P<0.05）。结论:①在共培养条件下VECs能在体外无其他条件诱导情况下直接促进ADSCs增殖并向成骨细胞分化;②FB和ADSCs体外共培养条件下促进ADSCs成骨分化的能力比VECs强,但促其增殖效果不如VECs;③FB联合VECs与ADSCs共培养既能使ADSCs大量增殖,又能促进其快速而高效向成骨细胞分化。
伟人悦[4]（2020）在《猪诱导多能性干细胞定向分化为血管内皮细胞的研究》文中指出心血管疾病（cardiovascular disease,CVD）是目前全球范围内导致患者死亡的最主要因素之一。冠状动脉类疾病（coronary artery disease,CAD）是心血管疾病中的一种,其致病机理为:由于血管内皮功能障碍引发血管损伤或血管功能丧失,造成心脏的血液灌注减少,最终引发心肌缺血甚至心肌梗塞。但是传统的药物针对该类疾病的治疗具有很大局限性,因此细胞移植治疗成为相关医疗及科研人员的关注点。胚胎干细胞（embryo stem cell,ESCs）和诱导多能性干细胞（induced pluripotent stem cell,i PSCs）是细胞移植治疗的种子细胞来源。但是ESCs的临床应用涉及到医学伦理问题和异体移植后的免疫排斥风险,i PSCs的应用将为心血管疾病的治疗提供便利。目前,很多研究人员对i PSCs向血管内皮细胞的定向分化进行了探索,相关研究主要集中在小鼠和人上。猪作为一种重要的农用家畜,其器官大小及生理学特征与人体具有很大的相似性,猪的寿命又相对较长,因而被认为是研究人类心血管及代谢性疾病的良好动物模型。对于猪诱导多能性干细胞的建系、培养及定向分化为血管内皮细胞体系的研究将为创建猪心血管疾病模型提供保障。目前,很多研究组通过不同的方法建立了猪i PS细胞系,但是关于其向血管内皮细胞定向分化的研究少之又少。2013年,Gu等首次报道了将猪脂肪间充质来源的i PSCs诱导分化为内皮细胞的方法,但其采用了周期较长且效率较低的拟胚体诱导分化途径,培养液成分也相对复杂。针对上述问题,我们进行了以下四部分研究:（1）使用无血清单层细胞诱导的方式对四种猪多能性干细胞系（猪胚胎来源的干细胞系Penk6和Pe WCHX,猪诱导多能性干细胞系Pilw4和M10）进行诱导分化,并检测细胞分化前期谱系特异性基因的表达趋势,从而筛选出中胚层分化潜能最高的猪多能性干细胞系;（2）使用不同的细胞因子或化学小分子组合对上述细胞进行诱导,筛选出促进细胞向中胚层分化的最优组合;（3）优化上述培养体系,建立一种无血清无饲养层的猪i PSCs向血管内皮细胞定向分化的诱导方法;（4）使用上述方法分别诱导人和猪的多能性干细胞向内皮细胞分化,并比较二者分化进程中的差异。研究结果表明,猪胚胎来源的Penk6和Pe WCHX细胞系在诱导分化过程中细胞形态无明显变化,猪诱导多能性干细胞M10和Pilw4在诱导分化过程中失去克隆形态并有部分细胞死亡。谱系特异性基因的表达检测结果显示,Penk6、Pe WCHX和M10细胞没有启动向原条期的分化且中胚层标记基因的表达变化无规律,Pilw4细胞的原条期、内胚层以及中胚层标记基因的表达水平均是先提高后下降,说明该细胞启动了分化进程。据此,我们选择猪诱导多能性干细胞系Pilw4进行后续实验。首先,我们使用四种前人报道的诱导人ESCs向血管内皮细胞分化的单层培养方法对pi PSCs进行定向诱导,在其中选择能够有效促进pi PSCs向中胚层分化的方法用于后续实验。接下来,我们对上述方法进行优化并研究了CHIR99201和BMP4在诱导分化前期的作用。实验根据第0至4天的不同处理方案分为6组进行:F,在第0至2天不添加CHIR99021、第3至4天添加FGF2;FB,第0至2天不添加CHIR99021、第3至4天添加FGF2和BMP4;BFB,第0至2天添加BMP4、第3至4天FGF2和BMP4;CF,在0至2天添加CHIR99201、3至4天添加FGF2;CFB,在0至2天添加CHIR99201,第3至4天添加FGF2和BMP4;CBFB,在第0至4天添加CHIR99021和BMP4,第3至4天添加FGF2和BMP4。上述6组从第5天开始处理一致:第5至7天培养液中添加VEGF和BMP4,8至10天换用商品化的内皮细胞培养液进行培养,第11天对细胞进行流式分选以及血管内皮细胞鉴定。实验结果显示,F、FB、BFB三组在诱导分化前期原条期标记基因的表达水平很低,完成诱导周期后CD31阳性细胞百分比仅为3.12%-5.16%;CF、CFB、CBFB三组在诱导分化前期原条期和内胚层标记基因的表达水平先上升后下降,中胚层标记基因表达水平持续上升,完成诱导周期后CD31阳性细胞百分比均高于12%,其中实验组CFB,CBFB的CD31阳性细胞率分别为21.3%和17.1%。以上结果表明,CHIR99201在pi PSCs向血管内皮细胞分化的前期具有促进作用,在诱导分化中期添加BMP4能够显着提高血管内皮细胞的诱导效率。此后,我们利用优化后的诱导步骤,从pi PSCs中获得了血管内皮细胞,该细胞具有与猪主动脉血管内皮细胞（AOCs）相似的形态、基因表达模式和功能特征。此外,我们使用相同的诱导步骤对人胚胎来源的干细胞进行诱导分化,结果表明人胚胎干细胞的分化效率远低于pi PSCs的分化效率,这可能与诱导过程中二者谱系基因表达模式上的差异相关。综上所述,我们建立了一种无血清的不依赖于饲养层的单层细胞诱导分化方法,可以将猪诱导多能性干细胞定向分化为具有功能的血管内皮细胞。该研究为评价大动物体内血管内皮细胞自体移植效果以及创建猪心血管疾病模型提供了可能。
文冰[5]（2020）在《miR-221在人乳牙牙髓干细胞神经分化过程中的作用及机制研究》文中研究说明背景和目的:人乳牙牙髓干细胞（stem cells fromhuman exfoliated deciduous teeth,SHED）是人类脱落的乳牙牙髓中分离得到的一种属于外胚间充质干细胞的牙源性干细胞,具较强的增殖能力及分化成身体各种类型细胞的潜能,组织来源方便,是细胞治疗和再生医学所需干细胞的理想来源。基于人乳牙牙髓干细胞在特定的培养环境中向神经元分化的特性,人乳牙牙髓干细胞在神经退行性疾病的治疗中发挥着重要作用。最新研究发现mi RNA（micro-RNA,小RNA）在人乳牙牙髓干细胞向神经元样细胞分化过程中差异表达,在神经元分化中发挥重要作用,但其在人乳牙牙髓干细胞神经分化中的作用机制尚不清楚我们前期的工作发现mi RNA-221（micro-RNA 21,小RNA221）在人乳牙牙髓干细胞神经分化过程表达上调,并调控人乳牙牙髓干细胞神经分化效率,我们推测mi R-221调控人乳牙牙髓干细胞神经分化。本论文将研究mi R-221在人乳牙牙髓干细胞神经分化过程中的作用及其调控机制,确定mi R-221的靶基因,明确mi R-221调控人乳牙牙髓干细胞神经分化的信号通路,并确定mi R-221通过靶基因调控人乳牙牙髓干细胞神经分化特异信号通路的分子机制。本论文将为人乳牙牙髓干细胞神经分化调控机制的研究提供新的理论基础和新的方向。材料和方法:1.mi RNA-221在人乳牙牙髓干细胞神经分化过程中的表达模式及作用（1）通过流式细胞仪检测人乳牙牙髓干细胞的间充质干细胞特异表面抗原标志物CD29（integrin subunit beta 1,β1整合素）、CD90（Thy-1 cell surface antigen,Thy-1细胞表面抗原）、CD146（melanoma cell adhesion molecule,黑色素瘤细胞粘附分子）和STRO-1（Stromal cell antigen,基质细胞抗原）,细胞粘附分子CD13（membrane alanyl aminopeptidase,膜丙氨酸氨基肽酶）和CD44（CD44 molecule,CD44分子）,造血干细胞阳性标志物CD34（CD34molecule,CD34分子）和CD45（protein tyrosine phosphatase receptor type C,蛋白酪氨酸磷酸酶受体C型）和内皮细胞特异性抗原标记物CD31（platelet and endothelial cell adhesion molecule 1,血小板和内皮细胞粘附分子1）的阳性率;通过免疫荧光实验检测人乳牙牙髓干细胞STRO-1的表达。（2）通过流式细胞仪检测人乳牙牙髓干细胞分化的神经元细胞的成熟神经元特异性抗原标志物NSE（enolase 2,烯醇化酶2）、MAP-2（microtubule associated protein 2,微管联合蛋白-2）、NF-M（neurofilament medium,神经丝蛋白）和TH（tyrosine hydroxylase,酸羟化酶）和神经干细胞特异性抗原Nestin（巢蛋白）的阳性率;通过免疫荧光实验检测人乳牙牙髓干细胞分化的神经元细胞NSE和MAP-2的表达。（3）通过q-PCR检测在人乳牙牙髓干细胞向神经元细胞分化过程中第0、2、4、6、8、10和12天mi RNA-221的表达水平。（4）通过流式细胞仪检测mi R-221 inhibitor（mi R-221抑制剂）、mi R-221mimic（mi R-221模拟物）、Blank（空白对照）和NC（Negative control RNA,阴性对照RNA）转染人乳牙牙髓干细胞后分化成神经元细胞特异标志物NSE和MAP-2的阳性率。2.mi RNA-221的靶基因确定（1）通过生物信息学分析预测mi R-221的靶基因。（2）通过双荧光素酶报告基因分析实验验证mi R-221与靶基因的相互作用。（3）通过q-PCR和western blotting检测在人乳牙牙髓干细胞神经分化过程mi R-221的靶基因CHD8（chromodomain helicase DNA binding protein 8,染色质螺旋酶DNA结合蛋白8）的m RNA和蛋白表达水平。（4）通过q-PCR和western blotting检测mi R-221 inhibitor、mi R-221mimic、Blank和NC转染人乳牙牙髓干细胞后CHD8的m RNA和蛋白表达水平。3.mi RNA-221调控人乳牙牙髓干细胞Wnt（wingless,无翼的）/β-catenin（β连环蛋白）通路的分子机制（1）通过q-PCR和western blotting检测人乳牙牙髓干细胞神经分化过程中Wnt/β-catenin通路特异标志物β-catenin、Wnt3A（Wnt family member3A,Wnt家族蛋白3A）、cyclin D1（细胞周期蛋白D1）、cMyc（transcriptional regulator Myc-like,Myc样转录调节因子）、c-Jun（Jun proto-oncogene AP-1 transcription factor subunit,Jun原癌基因AP-1转录因子亚基）和MMP7（matrix metallopeptidase 7,基质金属肽酶7）的m RNA和蛋白表达水平。（2）通过q-PCR和western blotting检测mi R-221 inhibitor、mi R-221
李远志[6]（2020）在《沉默SNHG12后BMSCs对脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究》文中提出背景:缺血性脑卒中是由血液供应中断引起的,是世界范围内致死、致残的主要原因。尽管随着新的治疗药物和血管内技术的发展,但全世界每年的缺血性脑卒中发病率和患病率仍在持续上升,缺血性脑卒中后发生的脑组织损伤仍然严重威胁着患者的生存和生活质量。对于缺血性脑卒中后缺血再灌注损伤,目前尚无特效治疗药物,而干细胞移植可能成为最有潜力的治疗方式。既往有研究报道,长链非编码RNA（LncRNA）在调节骨髓间充质干细胞（BMSCs）的功能中起着关键作用,并有研究报道长链非编码RNA小核仁RNA宿主基因12（LncRNA SNHG12）在大鼠脑缺血模型脑组织中表达明显异常。但鲜有报道SNHG12修饰的BMSCs在治疗脑缺血后受损伤的脑组织中所发挥的作用。本研究主要探索沉默SNHG12后BMSCs是否通过激活PI3K/AKT-mTOR信号通路对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用及其相应机制。方法:本研究利用氧葡萄糖剥夺/再灌注（OGD/R）处理大鼠脑微血管内皮细胞（BMECs）,再用qPCR检测BMECs中不同时间点的SNHG12的表达水平。并利用OGD/R处理的大鼠BMECs与BMSCs或OGD/R预处理的BMSCs或shSNHG12-BMSCs共培养。接下来,通过使用qPCR检测共培养后SNHG12的表达水平,使用CCK-8和EdU法检测BMECs的增殖情况,使用流式细胞术和Hoechst染色法检测细胞凋亡程度,使用免疫荧光检测自噬相关蛋白的表达,并使用Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白以及PI3K/AKT-mTOR通路蛋白的表达。最后,将BMSCs或shSNHG12-BMSCs移植到大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型中进一步证实细胞实验所获得的发现。同时,对大鼠MCAO模型进行神经行为学评估,TTC染色及HE染色了解脑梗塞体积的变化,Tunel染色检测脑组织凋亡情况。结果:在体外实验中,BMECs经OGD/R处理后显着上调了 BMECs中SNHG12的表达,抑制了BMECs的增殖,促进了凋亡蛋白Caspase-3的表达,促进了自噬蛋白LC3B的表达,并抑制了自噬蛋白P62的表达,同时还抑制了BMECs中PI3K、AKT和mTOR蛋白的磷酸化。但是,经OGD/R处理的BMECs与BMSCs共培养后显着抑制了BMECs中SNHG12表达的上调,显着改善了BMECs增殖的抑制,并显着抑制了BMECs凋亡和自噬的增加,同时还逆转了BMECs中PI3K、AKT和mTOR蛋白磷酸化的抑制作用。并证实了沉默SNHG12显着增强BMSCs的作用。在体内实验进一步证实,移植BMSCs显着减小了MCAO大鼠的脑梗死面积,降低了神经功能缺损评分,抑制了细胞凋亡及自噬的增加,并逆转了PI3K、AKT和mTOR蛋白磷酸化的抑制作用。并证实了沉默SNHG12显着增强BMSCs在MCAO大鼠中的治疗作用。结论:沉默BMSCs中SNHG12可通过激活PI3K/AKT-mTOR信号通路,显着增强了 BMSCs促进细胞增殖、抑制细胞凋亡和自噬的作用,从而对脑缺血再灌注损伤发挥保护作用。
牛晓洁[7]（2020）在《运动通过IGF-1/Nrf2通路激活糜蛋白酶样活性促进成年小鼠海马神经发生》文中指出目的:神经祖细胞（Neural progenitor cells,NPCs）增殖、分化、产生新生神经元,参与神经功能活动的过程称为神经发生。成年神经发生主要存在于海马齿状回（Dentate gyrus,DG）和室管膜下区。成年海马神经发生涉及学习,记忆和情绪调节。然而,随着年龄的增加NPCs增殖和分化能力降低,出现神经发生障碍,是神经退行性疾病发生的关键事件。运动可促进海马神经发生,提高小鼠的认知功能,但其具体机制尚不清楚。我们的前期结果表明NPCs的年龄相关的功能障碍可能与蛋白酶体失活相关,因此推测运动促进海马神经发生可能通过蛋白酶体活性的激活。本课题围绕这一假设进行推理,运用在体和离体实验,深入解析运动诱导成年海马神经发生的分子机制,为临床上预防和治疗年龄相关性疾病提供新的策略。第一部分自主跑轮运动对海马蛋白酶体活性的影响方法:1.不同年龄的BALB/c小鼠P0（<24 h）、P90（3 months）和P300（10 months）新鲜分离海马组织,分别检测半胱氨酸酶样活性（Caspase-like activity,C-L）,胰蛋白酶样活性（Trypsin-like activity,T-L）,糜蛋白酶样活性（Chymotrypsin-like activity,CT-L）;q PCR检测与C-L,T-L和CT-L蛋白酶体活性相关的蛋白酶体亚单位β1（Proteasome subunit beta type 1,PSMB1）、β2（Proteasome subunit beta type 2,PSMB2）、β5（Proteasome subunit beta type 5,PSMB5）的表达。2.成年小鼠（P90）随机分为自主跑轮运动组（Runner）和静坐对照组（Sedentary）,分别跑轮运动2 weeks、4 weeks、8 weeks,记录每天运动量,新鲜分离海马组织检测三种蛋白酶体活性;q PCR检测海马与C-L,T-L和CT-L蛋白酶体活性相关的蛋白酶体亚单位PSMB1、PSMB2、PSMB5的表达。结果:1.随着年龄的增加海马C-L蛋白酶体活性,T-L蛋白酶体活性,CT-L蛋白酶体活性均下降;而且q PCR检测与C-L,T-L和CT-L蛋白酶体活性相关的蛋白酶体亚单位PSMB1、PSMB2、PSMB5的表达也随着年龄的增加而降低。2.成年小鼠（P90）自主跑轮运动2 weeks后,运动组和静坐组相比,CT-L蛋白酶体活性升高约1.4倍（P<0.01）,C-L蛋白酶体活性上调约1.3倍（P<0.05）,CT-L蛋白酶体活性升高最显着,q PCR检测海马蛋白酶体亚单位PSMB1、PSMB2、PSMB5的表达,PSMB5升高约1.3倍,PSMB2上调约1.2倍,PSMB1的表达无明显变化,其中PSMB5升高最明显。成年小鼠自主跑轮运动4 weeks和8 weeks后,CT-L蛋白酶体活性均升高约1.2倍。这些结果表明自主跑轮运动能够促进海马CT-L和C-L蛋白酶体活性,CT-L蛋白酶体活性升高最显着,运动4 weeks后CT-L蛋白酶体活性升高逐渐趋于稳定。3.成年小鼠（P90）自主跑轮运动2 weeks和8 weeks后,进行运动总距离和CT-L蛋白酶体活性的相关分析。在运动2 weeks内,运动距离与蛋白酶体活性呈正相关（r=0.5,P=0.08）。然而,运动8 weeks后,运动距离与蛋白酶体活性没有相关性（r=0.19,P=0.68）,这些结果表明长时间的运动并没有导致CT-L蛋白酶体活性的进一步增强,反而逐渐趋于稳定,这与长时间运动后CT-L蛋白酶体活性检测结果趋于稳定相一致。因此,我们选择CT-L蛋白酶体活性的升高平台期——自主跑轮运动4 weeks,进行以下实验。第二部分运动上调IGF-1激活糜蛋白酶样活性对成年小鼠海马神经发生及学习记忆的影响方法:1.成年BALB/c小鼠（P90）随机分为自主跑轮运动组（Runner）和静坐对照组（Sedentary）,自主跑轮运动4 weeks后,Elisa检测成年小鼠血清及海马IGF-1的含量。2.体外分离培养成年小鼠（P90）海马NPCs,加入不同浓度IGF-1作用,Brd U和Tuj1免疫荧光染色检测NPCs增殖和分化能力,同时检测NPCs的CT-L蛋白酶体活性及蛋白酶体亚单位PSMB5的表达。3.成年小鼠（P90）腹腔注射IGF-1受体（IGF-1R）抑制剂picropodophyllin（PPP）及其溶剂对照10%DMSO,20 mg/kg,每天注射2次,连续注射4weeks,同时进行自主跑轮运动后,分离海马组织检测CT-L蛋白酶体活性;在自主跑轮运动开始的第一天腹腔注射Brd U（100 mg/kg/d）,连续注射7 days,同时进行自主跑轮运动及腹腔注射PPP 4 weeks后,灌注取脑,冰冻切片,Ki67,DCX,Brd U/DCX免疫荧光染色检测NPCs增殖、分化和存活能力;应用Ymaze自发交替及新物体识别行为学检测海马学习记忆能力。结果:1.成年小鼠自主跑轮运动4 weeks后,Elisa检测成年小鼠血清及海马IGF-1含量发现,运动组血清和海马IGF-1含量较静坐组分别上调1.3倍（P<0.05）和1.2倍（P<0.01）;q PCR结果显示自主跑轮运动后海马IGF-1 m RNA的表达升高1.3倍（P<0.05）。这些结果表明运动能够上调血清和海马IGF-1的含量。2.体外分离培养成年小鼠海马NPCs,不同浓度的IGF-1 20,50和100 ng/m L作用后,Brd U掺入实验结果显示随着IGF-1浓度的升高,NPCs的增殖能力呈上升趋势,其中IGF-1 50 ng/m L和100 ng/m L分别上调1.4倍（P<0.05）和1.7倍（P<0.001）;Tuj1免疫荧光染色显示IGF-1 50 ng/m L和100 ng/m L作用后分别较对照组上调1.4倍（P<0.05）和1.6倍（P<0.001）;蛋白酶体活性检测结果显示,IGF-1 50 ng/m L和100 ng/m L的CT-L蛋白酶体活性升高,同时q PCR结果也显示IGF-1作用后PSMB5 m RNA的表达也升高;提示IGF-1作用后,激活成年海马NPCs的CT-L蛋白酶体活性,促进NPCs增殖与分化能力。3.成年小鼠自主跑轮运动同时每天腹腔注射2次IGF-1R抑制剂PPP及溶剂对照10%DMSO（20 mg/kg）4 weeks,海马CT-L蛋白酶体活性检测结果显示,PPPrunner组小鼠海马CT-L蛋白酶体活性较DMSO-runner降低30%（P<0.05）;提示抑制IGF-1作用后,海马CT-L蛋白酶体活性降低。4.Ki67、DCX免疫荧光染色显示PPP-runner组小鼠海马DG区Ki67阳性细胞数为219.6±72.3,较对照DMSO-runner组（319.2±101.5）呈下降趋势（P=0.08）;自主跑轮运动PPP组小鼠海马DG区DCX阳性细胞数为650.2±195.9较对照DMSO-runner组DCX阳性细胞数991.4±258.9显着降低（P<0.05）;同时,应用Metamorph分析DCX阳性细胞的突起长度结果显示,PPP-runner组海马DG区DCX阳性细胞突起的平均长度为65.6μm±14.0μm,小于DMSO-runner对照组103.0μm±22.2μm（P<0.01）,具有显着的统计学差异。这些结果表明,PPP抑制IGF-1作用后,能够抑制海马DG区NPCs的增殖和分化能力。Brd U/DCX免疫双标表示小鼠海马DG区NPCs的存活能力。成年小鼠连续7 days腹腔注射Brd U 100 mg/kg/d后,自主跑轮运动及腹腔注射PPP 4 weeks,Brd U/DCX免疫双标结果显示,PPP-runner组海马DG区Brd U/DCX双阳性细胞数为128.2±41.2,较DMSO-runner对照组246.1±82.5明显下降（P<0.05）,提示PPP抑制IGF-1作用后,海马DG区NPCs的存活能力降低。5.应用Y-maze自发交替及新物体识别行为学检测海马学习记忆能力。Y-maze自发交替实验结果显示,PPP-runner组和DMSO-runner对照组的Y-maze的入臂次数即活动度没有差异,但PPP-runner组Y-maze自发交替正确率较DMSO-runner对照组显着降低（P<0.05）。新物体识别检测在训练期间,PPP运动组与DMSO对照运动组探索物体所花费的时间相似,表明两组小鼠的活动度相似;在检测时期,PPP运动组探索新物体的时间百分比为61.2%±8.5%较DMSO对照运动组69.7%±7.9%明显下降（P<0.05）。这些结果均表明,PPP抑制IGF-1的作用后,能够抑制成年小鼠海马的学习和空间记忆能力。第三部分IGF-1/Nrf2对成年小鼠自主跑轮运动后海马神经发生及学习记忆的影响方法:1.应用Western blot检测自主跑轮运动4 weeks后,成年小鼠（P90）海马组织Nrf2核转位情况。2.体外分离培养成年小鼠（P90）海马NPCs,加入IGF-1作用,Nrf2免疫荧光染色检测Nrf2核转位情况。3.体外培养小鼠N2a细胞,作为工具细胞研究IGF-1,Nrf2及CT-L活性之间的关系。不同浓度的IGF-1作用于N2a细胞,检测CT-L蛋白酶体活性,Western blot检测Nrf2核转位情况。4.体外培养N2a细胞,Lipofectamine?RNAi MAX转染试剂转染Nrf2-si RNA及其对照si RNA 8 pmol 48 hours后,加入IGF-1 100 ng/m L作用24 hours,检测CT-L蛋白酶体活性。5.N2a细胞过夜贴壁,待其达到70%-80%的融合,Turbofect转染试剂共转染质粒PSMB5-Luciferase,Renilla,pc DNA3-Myc3-Nrf2及其对照质粒PSMB5-Luciferase,Renilla,pc DNA3 48 hours后,加入IGF-1 100 ng/m L作用24 hours,双荧光素酶报告系统检测转录因子Nrf2对蛋白酶体亚单位PSMB5的转录情况。N2a细胞过夜贴壁,待其达到70%-80%的融合,Turbofect转染Nrf2-si RNA及其对照si RNA 8 pmol 8 hours后共转染质粒PSMB5-Luciferase和Renilla作用48 hours,再加入IGF-1 100 ng/m L作用24 hours,双荧光素酶报告系统检测转录因子Nrf2对蛋白酶体亚单位PSMB5的转录情况。6.成年BALB/c小鼠（P90）双侧海马立体定位注射AAV-sh RNA-Nrf2及其对照AAV-sh RNA-SC 1μL/侧（2-3 x 1012/m L）,注射5 weeks后,随机分为AAVsh RNA-Nrf2自主跑轮运动组和AAV-sh RNA-SC自主跑轮运动组,进行自主跑轮运动4 weeks,检测海马CT-L蛋白酶体活性,免疫荧光染色检测两组海马齿状回颗粒下层Ki67、DCX的表达水平,观察敲减Nrf2对海马CT-L蛋白酶体活性及对NPCs增殖和分化能力的影响;应用Y-maze自发交替及新物体识别行为学检测海马学习记忆能力。结果:1.成年小鼠（P90）自主跑轮运动4 weeks后,海马Western blot检测Nrf2的表达情况,结果显示,自主跑轮运动组Nrf2核转位较对照组上调1.3倍（P<0.001）,提示自主跑轮运动能够促进成年海马Nrf2核转位。2.体外分离培养成年（P90）海马NPCs,传代诱导其贴壁,不同浓度的IGF-1（50,100 ng/m L）作用后,Nrf2免疫荧光染色结果显示,IGF-1实验组Nrf2核转位较对照组升高1.4倍（P<0.001）,提示IGF-1作用后NPCs的Nrf2转录活性升高。3.不同浓度IGF-1（10,20,50和100 ng/m L）作用于N2a细胞后,提取N2a细胞核浆蛋白,Western blot结果显示,IGF-1 100 ng/m L组Nrf2转录活性较对照组升高1.2倍（P<0.01）;CT-L蛋白酶体活性检测结果显示,IGF-1 20,50,100ng/m L作用组CT-L蛋白酶体活性分别提高1.2倍（P<0.05）和1.3倍（P<0.001）,提示IGF-1作用N2a细胞后,N2a细胞的Nrf2转录活性增加,CT-L蛋白酶体活性升高。4.成年小鼠（P90）自主跑轮运动及腹腔注射IGF-1抑制剂PPP 4 weeks后,提取海马组织核浆蛋白,Western blot结果显示PPP-runner组小鼠海马Nrf2核转位较DMSO-runner降低20%（P<0.05）,表明PPP抑制IGF-1后,能够抑制自主跑轮运动诱导的海马Nrf2的核转位。这些结果表明,Nrf2作为IGF-1下游的效应分子,参与CT-L蛋白酶体活性的激活。5.体外培养N2a细胞,Lipofectamine?RNAi MAX转染试剂转染Nrf2-si RNA及其对照si RNA 8 pmol 48 hours后,加入IGF-1 100 ng/m L作用24 hours,CT-L蛋白酶体活性检测结果显示,IGF-1作用后CT-L蛋白酶体活性上调1.4倍（P<0.001）;然而,在IGF-1作用后,敲减Nrf2能够显着降低CT-L蛋白酶体活性（P<0.05）。当仅敲减Nrf2后,与对照组相比CT-L蛋白酶体活性无变化。这些结果表明在IGF-1的作用下,Nrf2才能够激活CT-L蛋白酶体活性。6.N2a细胞共转染质粒PSMB5-Luciferase,Renilla,pc DNA3-myc3-Nrf2及其对照质粒PSMB5-Luciferase,Renilla,pc DNA3 48 hours后,加入IGF-1作用24 hours,双荧光素酶报告系统检测结果显示过表达Nrf2后,PSMB5的转录活性升高3.5倍（P<0.05）;IGF-1作用后,过表达Nrf2组PSMB5的转录活性较对照组升高6.5倍（P<0.05）,提示IGF-1作用后过表达Nrf2能够进一步促进PSMB5的转录活性。Turbofect转染Nrf2-si RNA及其对照si RNA 8 pmol 8 hours后,共转染质粒PSMB5-Luciferase和Renilla 48 hours,IGF-1 100ng/m L作用24 hours,双荧光素酶报告系统检测结果显示,IGF-1作用后,PSMB5的转录活性上调1.4倍（P<0.05）;然而,在IGF-1作用后,敲减Nrf2能够显着降低PSMB5的转录活性（P<0.01）。当仅敲减Nrf2后,与对照组相比PSMB5的转录活性无变化。这些结果表明在IGF-1作用下,Nrf2才能促进蛋白酶体亚单位PSMB5的转录。7.成年BALB/c小鼠（P90）双侧海马立体定位注射AAV-sh RNA-Nrf2及其对照AAV-sh RNA-SC 1μL/侧（2-3 x 1012/m L）;注射后5 weeks后,自主跑轮运动4weeks,CT-L蛋白酶体活性检测结果显示AAV-sh RNA-Nrf2组CT-L蛋白酶体活性较AAV-sh RNA-SC对照组降低30%（P<0.05）,提示敲减Nrf2后,能够抑制海马蛋白酶体活性。8.Ki67、DCX免疫荧光染色结果显示,AAV-sh RNA-Nrf2运动组小鼠海马DG区Ki67阳性细胞数为195.4±85.0较对照AAV-sh RNA-SC运动组海马DG区Ki67阳性细胞数303.8±97.2减少（P<0.05）;自主跑轮运动AAV-sh RNA-Nrf2组小鼠海马DG区DCX阳性细胞数为554.6±238.8较对照AAV-sh RNA-SC运动组海马DG区DCX阳性细胞数887.2±297.2显着降低（P<0.05）。同时应用Metamorph分析DCX阳性细胞的突起长度结果显示,AAV-sh RNA-Nrf2运动组海马DG区DCX阳性细胞突起的平均长度42.0μm±8.4μm,小于对照AAVsh RNA-SC运动组64.2μm±15.4μm（P<0.01）,具有统计学差异。这些结果表明,敲减Nrf2后,能够抑制海马DG区NPCs的增殖和分化能力。9.Y-maze自发交替实验和新物体识别实验主要评鉴小鼠的空间学习记忆能力。Ymaze自发交替实验结果显示AAV-sh RNA-Nrf2运动组和对照AAV-sh RNA-SC运动组的Y-maze的入臂次数即活动度没有差异,但AAV-sh RNA-Nrf2运动组Y-maze自发交替正确率较对照AAV-sh RNA-SC运动组显着降低（P<0.05）。而且,新物体识别实验在训练期间,AAV-sh RNA-Nrf2运动组和对照AAV-sh RNASC运动组探索物体所花费的时间相似,表明两组小鼠的活动度相近;在检测时期,AAV-sh RNA-Nrf2运动组探索新物体的时间百分比较对照AAV-sh RNA-SC运动组下降15%（P<0.05）。这些结果表明,敲减Nrf2后,能够抑制成年小鼠海马的学习和空间记忆能力。结论:1随着年龄的增加海马CT-L蛋白酶体活性,C-L蛋白酶体活性,T-L蛋白酶体活性均下降;自主跑轮运动2 weeks后,海马CT-L蛋白酶体活性和C-L蛋白酶体活性升高,其中CT-L蛋白酶体活性升高最显着,且自主跑轮运动4 weeks后,CT-L蛋白酶体活性升高趋于稳定。2自主跑轮运动上调IGF-1的含量;IGF-1作用于离体培养NPCs后能够激活CT-L蛋白酶体活性,促进成年小鼠NPCs的增殖、分化和存活能力。3抑制IGF-1作用后,能够抑制海马CT-L蛋白酶体活性的升高,减弱运动诱导的神经发生及认知功能的改善。4 IGF-1作用于离体培养NPCs及N2a细胞后,能够诱导Nrf2核转位,上调蛋白酶体亚单位PSMB5的转录活性,激活CT-L蛋白酶活性。5敲减Nrf2后,能够抑制海马CT-L蛋白酶体活性的升高,减弱IGF-1诱导的神经发生及认知功能。
徐雅倩[8]（2020）在《肾脑复元汤对人脐带间充质干细胞增殖及细胞周期的影响》文中研究说明目的:通过检测肾脑复元汤不同剂量含药血清在不同时间段对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord-mesenchymal stem cells,h UC-MSCs）的增殖作用及对其周期的影响,探究肾脑复元汤联合h UC-MSCs在动物实验中最佳时效及量效关系,为二者联合在干预缺血性脑卒中神经保护作用积累实验依据。方法:1.采用高、中、低剂量肾脑复元汤水煎液灌服SPF级SD大鼠,制备含药血清,以正常血清为对照。2.经CCK-8观察含药血清对细胞增殖的影响,选择20%质量分数的血清浓度及用于后续干预体外培养的h UC-MSCs;3.流式细胞术检测不同时间各组细胞周期情况;4.免疫蛋白印迹{Western blot}法检测β-catenin、c-myc、cyclin D1的蛋白表达水平。结果:1.CCK-8法检测:10%含肾脑复元汤血清在48小时对h UC-MSCs的增殖活性最佳。2.流式细胞周期结果表明:10%肾脑复元汤含药血清在处理细胞后48小时可以诱导细胞周期向G2/M期转变。3.Western blot法检测:10%肾脑复元含药血清干预h UC-MSCs在一定程度上对β-catenin、c-Myc、cyclin D1蛋白表达起到促进作用,且在48小时时间段最佳。结论:肾脑复元汤可促进对促进h UC-MSCs增殖及诱导细胞周期向G2/M期转变,且在10%含药血清在48小时段最佳,从为二者联合治疗缺血性脑卒中提供依据,且有保护神经元的作用,此作用可能与其促进蛋白β-catenin,c-Myc、cyclin D1表达有关。
高校[9]（2020）在《骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤和认知障碍的保护作用及机制研究》文中研究表明研究背景蛛网膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）是常见的脑血管疾病之一,一种危及生命的神经系统疾病,具有较高的死亡率和致残率。SAH发生的主要原因是动脉瘤的自发破裂。随着神经外科诊疗技术的进步,许多SAH病人可以存活下来,但难以完全恢复正常的认知功能,因受认知障碍的困扰,从而使其生活质量下降。以往认为脑血管痉挛是导致SAH后神经损伤和认知障碍的主要原因,而越来越多的证据表明早期脑损伤（early braindamage,EBI）才是影响SAH患者不良预后的更为重要的因素。EBI是指蛛网膜下腔出血后72小时内所发生的脑损伤。区别于脑血管痉挛产生的脑损伤,EBI所涉及的病理生理过程更为复杂,包括颅内压和脑血流量改变、血脑屏障受损、神经元凋亡、小胶质细胞异常活化等。针对EBI进行深入研究,将有助于提出改善SAH患者预后的治疗手段,从而减轻家庭乃至社会负担。近期,间充质干细胞来源的细胞外囊泡（extracellular vesicle,EV）或外泌体引起了许多关注,被认为是潜在的药物载体,同时有望替代基于间充质干细胞的细胞疗法。更重要的是,使用EV或外泌体（exosomes）可以规避细胞治疗的致瘤性等潜在安全问题。外泌体可以通过其包含的蛋白、脂质、mRNA和非编码RNA等成分调节受体细胞的功能。间充质干细胞EV或外泌体被证实可治疗肝损伤、肾损伤、急性心肌梗死等疾病。间充质干细胞疗法在20世纪初已被应用于卒中和创伤性脑损伤的治疗中。但最近的研究表明,间充质干细胞的分化成功能性细胞的能力较弱,其对于损伤修复的促进作用主要通过其所分泌的细胞因子和外泌体所介导。例如Michael Chopp等学者证明MSC外泌体可以被神经细胞接受,而且这些miR-133过表达的外泌体可以促进缺血性脑卒中神经功能恢复。虽然段传志等发现静脉输注间充质干细胞可以减轻SAH大鼠神经炎症介导的损伤,然而,间充质干细胞EV或外泌体在SAH的作用和机制仍不清楚,故深入探究间充质干细胞外泌体对SAH的干细胞治疗实际应用具有重要现实意义。本课题利用大鼠线栓穿刺法SAH模型,探讨了 MSC-EV对SAH后EBI的神经保护作用,揭示了 EV中的miR-21在认知障碍恢复中的分子机制。首先,通过给予尾静脉注射途径的MSC-EV干预,探究了 MSC-EV是否能减轻EBI中的病理改变,并进一步发现其通过抑制神经元凋亡发挥了神经保护作用的机制。而后,结合EV-RNA测序分析和SAH患者脑脊液miRNA芯片结果,筛选发现miR-21介导了 MSC-EV保护作用,并深入研究了 miR-21/PTEN/AKT轴在EBI过程中神经元应激和神经元凋亡的相关机制。本课题对SAH患者神经损伤恢复提供了潜在治疗手段,具有重要的临床应用价值。第一部分MSC-EV对于SAH大鼠后早期脑损伤的神经保护作用的研究1.目的（1）MSC-EV的分离和鉴定。（2）MSC-EV对蛛网膜下腔出血大鼠是否具有神经保护作用。（3）MSC-EV是否能够减轻大鼠在蛛网膜下腔出血后的认知障碍。（4）通过EV染色示踪技术确定MSC-EV的靶细胞。（5）MSC-EV对于神经元凋亡的分子保护机制。2.方法1、构建线栓穿刺法的大鼠SAH实验模型为研究蛛网膜下腔出血后早期脑损伤,我们选用了穿刺法模型,使用成年雄性SD大鼠,体重在280-330g范围内。麻醉大鼠后,分离颈动脉,自颈外动脉将尼龙线栓插入颈内动脉,进而深入颅内刺破前交通动脉,以完成模型构建。2、骨髓间充质干细胞EV的提取和鉴定培养大鼠骨髓间充质干细胞,收集细胞培养上清,利用超速离心法提取细胞外囊泡（EVs）,通过qNano粒径分析系统、EV特异性蛋白的Western blot检测、电镜等方法对其进行特征鉴定。3、动物分组、给药成年雄性SD大鼠被随机分为假手术组（Sham组）、SAH组,SAH+EVs,其中EVs是提取自大鼠骨髓间充质干细胞的细胞外囊泡,通过尾静脉注射的方式给予SAH大鼠,剂量为100ug/只,SAH组则注射相同体积的PBS溶液。4、MSC-EV对SAH大鼠死亡率和行为学的影响观察并记录各组存活情况,并在SAH模型建立后48h,对各组大鼠进行改良Garcia神经功能学评分,以检测各组的神经行为学变化,评估MSC-EV对SAH大鼠神经功能的影响。5、MSC-EV改善SAH大鼠脑组织的组织学检测深度麻醉处死动物后,灌注取脑固定,制备石蜡切片,进行常规HE染色和尼氏染色观察水肿等病理表现;在此基础上利用TUNEL和NeuN/cleaved Caspase-3荧光染色检测神经元凋亡情况。6、凋亡相关蛋白及通路的检测处死动物后,分别提取前额叶皮质、海马组织进行蛋白提取,使用Western blot定量检测各组大鼠的凋亡相关蛋白的表达情况。7、水迷宫实验SAH造模两周后,对各组大鼠进行水迷宫实验,评估其SAH后的学习记忆功能恢复情况。实验前4天,放置隐藏平台,训练大鼠寻找固定位置的平台;第5天,撤去平台,观察各组大鼠对固定平台的记忆强度。8、EV荧光染色示踪利用PKH67染色的MSC-EV,联合神经细胞的免疫荧光染色,检测MSC-EV是否被神经细胞接受。3.结果（1）通过超速离心法提取的骨髄间充质干细胞来源的EV,符合国际鉴定标准qNano粒径分析显示囊泡颗粒直径大小分布于50-200nm,Western blot显示相较于细胞蛋白,所提取的MSC-EV表达丰富的EV特异蛋白指标CD9、TSG101,而表达较少内质网特异蛋白Calnexin。（2）MSC-EV可减轻SAH后脑组织病理损伤、脑水肿大鼠脑组织切片的HE染色、Nissl染色显示,SAH组发生明显的组织损伤改变,细胞固缩、染色加深不一;而相较于SAH组,SAH+EV组中细胞形态有明显改善,细胞形态更为饱满,发生固缩的细胞显着减少。宏观上利用干湿重法检测的全脑含水量结果显示,SAH大鼠明显较假手术组大鼠脑含水量更高,提示脑水肿发生,而间充质干细胞来源的EV明显改善了脑水肿情况。（3）MSC-EV能减轻SAH后神经功能损伤,并提高认知功能恢复采用改良的Garcia评分系统对大鼠进行神经功能评价,SAH组总评分显着低于Sham组,而在给予MSC来源的细胞外囊泡后,SAH+EV组相较于SAH组总评分有所提高。为进一步检测认知功能的恢复情况,在水迷宫实验中发现,间充质干细胞细胞外囊泡给药组大鼠表现明显好于PBS组,找到潜伏平台的时间更短,且在去除平台后,其穿越原平台位置及象限的次数也更多,提示其有更深的记忆形成。（4）MSC-EV可被神经元接受,并抑制神经元凋亡PKH67荧光标记的EV示踪实验显示,EV荧光信号主要存在于神经元中,同时,在肝脏、肾脏和脾脏中也有分布。另外,TUNEL染色显示,SAH后前额叶皮质和海马均有细胞凋亡产生,而MSC-EV能显着减少凋亡细胞数量。NeuN/Cas3免疫荧光双染显示,SAH后凋亡细胞主要为神经元,SAH+EV组凋亡神经元数量显着减少。而且,Western blot检测显示,SAH后前额叶皮质和海马组织中Bcl-2表达下调,Bax和活化的Caspase3表达上调,在给予MSC-EV的SAH大鼠中,Bcl-2的下调显着减弱,Bax和活化Caspase3的上调显着降低。4.结论（1）通过超速离心法能从MSC培养基上清中提取到符合国际鉴定标准的MSC来源的细胞外囊泡。（2）MSC-EV能够减轻SAH后脑组织病理损伤、脑水肿。（3）MSC-EV能减轻SAH后神经功能损伤,并提高认知功能恢复。（4）MSC-EV可被神经元接受,并抑制神经元凋亡。第二部分 miR-21介导的MSC-EV在SAH后的神经保护作用的分子机制研究1.目的（1）揭示MSC-EV对于SAH神经保护作用的分子机制。（2）结合测序和数据库,鉴定筛选MSC-EV中的关键治疗分子。（3）探究miR-21在大鼠SAH后的脑组织表达改变情况。（4）探究EV-miR-21在神经保护作用中的具体作用机制。2.方法1、MSC-EV的RNA高通量测序收集新鲜MSC培养基上清,超速离心法提取EV,抽提RNA,建库并上机测序。得到测序结果后,进行全面分析RNA种类及注释。2、SAH患者脑脊液miRNA结果分析及靶点筛选下载exRNA atlas数据库中SAH病人CSF miRNA测序数据,标注分组信息,记录miRNA表达情况,进而筛选潜在SAH相关miRNA。3、建立SAH时间梯度的动物模型,分为:Sham组、3h、6h、12h、24h、48h、72h和1周组,在规定时间点对前额叶皮质和海马组织分别取材,提取RNA并采用qPCR检测相关miRNA的表达。4、建立 SAH 大鼠模型,分组如下:Sham,SAH+PBS,SAH+MSC-EV,SAH+MSC-EV（-21）and SAH+MSC-EV+MK2206,MSC-EV（-21）为转染miR-21 inhibitor的MSC后所提取的EV,MK2206则通过立体定位注射以l00ug的剂量注入大鼠侧脑室。5、分离培养大鼠原代神经元,给予OxyHb处理,以进行SAH体外实验。采用qPCR检测神经元内和神经元分泌的EV中miR-21表达情况;进一步通过给予MSC-EV或EV分泌抑制剂GW4869,检测神经元EV中miR-21表达情况,并利用TUNEL技术检测凋亡情况,Western blot检测凋亡相关蛋白。6、SAH后48h,采用改良Garcia神经功能评分系统,对五组大鼠进行神经功能损伤评价。而后通过深度麻醉处死,取脑组织固定或提取蛋白。利用HE染色、TUNEL染色和NeuN/cleaved Caspase-3荧光染色检测神经元凋亡情况;采用Western blot技术对前额叶皮质和海马脑组织中凋亡相关分子进行检测。3.结果（1）miR-21在MSC-EV中表达丰度高,在SAH患者脑脊液中表达增多。RNA测序显示,MicroRNA在MSC-EV总RNA量中占重要比例,超过半数为成熟体形式。进一步分析,其中miR-21、miR-let-7i、let-7c等的表达丰度较高。结合exRNA atlas数据库的SAH患者CSF的miRNA表达结果,发现miR-21在SAH患者脑脊液中表达明显升高,提示miR-21参与了 SAH病理生理进程,而MSC-EV可能通过递送miR-21发挥了神经功能保护作用。（2）miR-21在SAH大鼠脑组织中表达反应性上调。在时间梯度的SAH大鼠模型中,qPCR结果显示前额叶皮质和海马脑区的miR-21表达量在SAH后发病后显着增高,但随着时间延长而减少,提示反应性升高的miR-21可能因外排而减少。同时,荧光原位杂交也显示miR-21在SAH大鼠的前额叶皮质中表达上调。（3）SAH后miR-21在神经元分泌的EV中上调,导致神经元凋亡增多。运用SAH体外模型,我们发现SAH能刺激神经元表达miR-21增多,同时EV中外排miR-21增多。GW4869、MSC-EV均能够提高神经元内的miR-21表达,并抑制神经元凋亡。（4）EV中的miR-21介导了 SAH后的神经保护作用。相较于SAH+EV组,SAH+MSC-EV（-21）组大鼠神经功能评分显着下降,TUNEL阳性细胞显着增多,凋亡神经元数量增多;Bc12表达下调、Bax、C-Cas3、PTEN表达上调。（5）miR-21通过PTEN/Akt轴促进神经元存活。MK2206抑制了 MSC-EV对于SAH大鼠的神经保护作用,使皮层神经元形态固缩严重,凋亡神经元数目显着增多,AKT磷酸化水平显着降低、Bc12表达下调、Bax表达上调、活化的Caspase3增多。4.结论（1）MiR-21-5p在间充质干细胞来源的EV中表达丰度高,且在SAH患者脑脊液中表达增多。（2）MiR-21-5p在SAH大鼠前额叶皮质和海马组织中表达反应性上调,二者高峰出现时间不同,但均在后期表达含量下降。（3）体外实验中,SAH后miR-21-5p在神经元分泌的EV中上调,抑制神经元外排miR-21-5p能促进神经元存活。（4）MiR-21-5p/PTEN/Akt通路介导了 MSC-EV对于SAH大鼠的神经保护作用。
吕颖[10]（2020）在《LncRNAs调节hiPSCs向多巴胺能神经元的诱导分化和干细胞移植治疗帕金森大鼠及PTRF转基因小鼠中造血干细胞功能损伤的研究》文中研究表明目的（1）建立hiPSCs向多巴胺（dopamine,DA）能神经元的诱导分化体系,系统分析诱导分化过程中lncRNAs的表达和功能变化,进一步筛选并探究关键lncRNA MIAT在hiPSCs及诱导分化中的作用。（2）探讨6-OHDA大鼠帕金森（Parkinson’s disease,PD）模型不同脑区基因表达的改变并筛选PD关键基因与通路,为研究PD的分子机制和防治提供新思路。（3）系统比较并评价神经干细胞、间充质干细胞及其诱导细胞、hiPSCs诱导分化细胞移植治疗PD的效果,为移植细胞的选择和时间点的确定提供实验基础。方法（1）单层贴壁培养法建立hiPSCs向DA能神经元的诱导分化体系,RT-qPCR和免疫荧光染色检测神经相关标记物划分细胞所处阶段。将诱导分化中不同阶段细胞进行lncRNAs转录组测序和生物信息学分析,包括基因表达分析、差异基因分析、lncRNAs靶基因预测和功能富集分析。筛选关键lncRNA MIAT进行RT-qPCR表达验证,Cas9转录激活慢病毒构建MIAT过表达稳转细胞系,RT-qPCR、碱性磷酸酶染色、免疫荧光染色检测MIAT在hiPSCs及其向DA能神经元诱导分化中相关标记物的表达。（2）脑立体定位手术构建6-OHDA大鼠PD模型,阿扑吗啡诱导旋转测试筛选成功PD模型,免疫组化检测黑质DA能神经元的含量,高效液相色谱检测纹状体 DA、二羟苯乙酸（dihydroxyphenyl acetic acid,DOPAC）和高香草酸（homovanillic acid,HVA）的含量。分离5个脑区（嗅球、室管膜下区、纹状体、黑质、海马）进行转录组测序、生物信息学分析和RT-qPCR验证。透射电镜观察超微结构改变。（3）移植细胞分组包括:神经干细胞（neural stem cells,NSCs）、绒毛膜间充质干细胞（human placental chorionic-derived mesenchymal stem cells,hpcMSCs）、脐血单个核细胞（cord blood mononuclear cell,CB-MNC）、脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）及其诱导6天、12天、24天的细胞、hiPSCs诱导分化11天、18天和25天的细胞。新型氧化铁纳米颗粒（molday ion rhodamine B,MIRB）标记干细胞并通过脑立体定位手术进行细胞移植。阿扑吗啡诱导旋转测试、旷场试验和抓力测试对动物进行行为学评价。核磁观察细胞在活体脑内的情况,免疫荧光染色观察移植细胞的迁移、增殖、分化以及星形胶质细胞的改变。透射电镜观察脑组织超微结构变化。结果（1）建立了 hiPSCs向DA能神经元诱导分化体系。细胞诱导分化至5-7天处于NSCs阶段,至第1 1天开始进入DA能神经元前体细胞阶段,至第25天TH+神经元的比例约为40%左右。诱导分化体系中存在普遍的lncRNAs差异表达和功能调控。在转录本水平和基因水平存在大量的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）。差异lncRNAs靶基因和差异mRNAs功能富集结果总体相一致,主要参与轴突导向、（Wnt/TGF-β/Hedgehog/MAPK/p53）信号通路、神经退行性疾病（PD/AD/HD）、代谢途径和细胞周期等。iPSCd0 vs iPSCd7前20项显着富集的功能还包括神经元分化调节、中枢神经系统发育、Wnt信号和凋亡等,与诱导分化密切相关。MIAT及其靶基因MAPK10在iPSCd7组的表达量高于iPSCd0组（p<0.05）,与测序结果相一致。hiPSC-MIAT细胞呈克隆状增殖生长,多能性基因的表达水平与hiPSCs无统计学差异,碱性磷酸酶染色阳性且大量表达OCT4阳性细胞。hiPSC-MIAT诱导至第5天即可见大量细胞向外伸展生长呈分化状态,OCT4、EN1、NURR1基因表达水平高于对照组（p＜0.05）,SOX1和PAX6基因表达水平低于对照组（p<0.05）。（2）成功构建了 6-OHDA大鼠PD模型,黑质TH+神经元减少约90%以上,纹状体DA、DOPAC和HVA的含量分别为对照组的4.28%、8.40%、4.96%。模型大鼠5个脑区均发生了基因改变,GO和KEGG功能富集分析显示DEGs主要参与突触、线粒体、炎症免疫、代谢、发育、损伤修复、记忆、氧化应激、凋亡和神经退行性疾病等生物学过程。韦恩分析5个脑区共有DEGs为Ephx2和Faml11a。PPI分析纹状体主要节点基因为Gng2、Npsr1、Bdnf、Penk和Crh。DA能突触和逆行内源性大麻素信号是PD关键通路,其中存在DA能、谷氨酸能和GABA能突触的共有级联结构,即以Gi/o为中心的Gi/o-GIRK、Gi/o-AC-PKA和Gi/o-MAPK。PD模型5个脑区均存在不同程度的线粒体形态异常。（3）阿扑吗啡诱导旋转测试显示,ADSCd12、iPSCd18和iPSCd25有效比例较高且有效时长到达观察终点32周,其中iPCSd18组有效比例最高。与对照组相比,干细胞移植各组大鼠肌力均有所提升（p<0.05）,移植各组之间无统计学差异。与对照组相比,移植大鼠的总活动路程和总运动时间均显着升高（p<0.05）,各移植组之间无统计学差异。与对照组相比,移植组大鼠的跨区域次数增加,其中ADSCd12组高于iPSCd25组（p<0.05）。MIRB标记的移植细胞能够在脑内生长,细胞移植后能够发生迁移,迁移方式包括局部迁移、向胼胝体迁移和跨脑区的远程迁移。细胞移植后8周,部分移植细胞PCNA染色阳性,移植后32周PCNA+细胞较少。iPSCd18组细胞移植后32周,部分分化为DA能神经元表达TH阳性。细胞移植后8周针道周围大量星形胶质细胞被激活,呈纤维束网状或胞体增大增厚,移植后32周表达减少。细胞移植后8周,大鼠5个脑区的线粒体形态异常均有不同程度的改善。结论（1）hiPSCs向DA能神经元诱导分化体系中,细胞诱导5-7天处于NSCs阶段,11天进入DA能神经元前体细胞阶段,25天TH+细胞比例约为40%。（2）hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程中存在广泛的lncRNAs表达和功能变化,部分功能调节与诱导分化关系密切。（3）LncRNA MIAT及其靶基因MAPK10在诱导第7天细胞中表达升高。过表达MIAT不影响hiPSCs的多能性,但在诱导分化过程中促进hiPSCs向中脑DA能神经元前体细胞分化。（4）6-OHDA大鼠PD模型在病理生化和基因水平都能够很好地模拟人类PD,5个脑区（嗅球、室管膜下区、纹状体、黑质、海马）均发生了基因改变,DEGs主要参与突触、线粒体、炎症免疫、代谢、发育、损伤修复、记忆、氧化应激、凋亡和神经退行性疾病等生物学过程。（5）5个脑区的共有DEGs（Ephx2和Faml11a）和纹状体的主要节点基因（Gng2、Npsr1、Bdnf、Penk和Crh）可能是PD分子机制和治疗的关键靶点。（6）DA能突触和逆行内源性大麻素信号是PD关键通路,其中存在DA能、谷氨酸能和GABA能突触的以Gi/o为中心的共有级联结构（Gi/o-GIRK、Gi/o-AC-PKA和Gi/o-MAPK）,可能是PD突触损伤的关键分子机制。（7）各类干细胞及其诱导细胞移植治疗PD大鼠均能在一定程度上改善动物行为障碍（转数、肌力、自主活动能力）,ADSCd12组、iPSCd18组和iPSCd25组的治疗效果相对较好且维持时间较长,其中iPSCd18组的行为学评价有效比例最高。（8）移植细胞能够在脑内生长并以不同方式迁移,初期具有增殖能力,促进大量星形胶质细胞的表达,后期有所降低,能够分化为DA能神经元,对脑区内线粒体超微结构损伤有一定的改善作用。干细胞功能的年龄依赖性下降在衰老中起着重要作用,但其分子机制尚不清楚。PTRF（polymerase I and transcript release factor）是胞膜窖形成和发挥功能的重要成分,参与调节细胞增殖、内吞作用、信号转导和衰老等生物学功能。本研究旨在通过PTRF转基因小鼠分析PTRF在造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs）衰老中的作用。采用流式细胞术检测免疫细胞和造血干/祖细胞的比例;测定HSCs的细胞周期、衰老和ROS表型。采用RT-qPCR和蛋白免疫印迹检测衰老相关基因和蛋白的表达水平。结果表明,PTRF转基因小鼠骨髓中HSCs数量明显增多,并表现出G1期细胞周期停滞、SA-β-Gal阳性率增加和活性氧水平升高的衰老表型。PTRF过表达的HSCs在体内、体外的自我更新和造血重建能力也显着降低。PTRF通过 ROS-p38-p16 和 caveolin-1-p53-p21 途径诱导 HSCs 衰老。
二、源于骨髓间充质干细胞的神经元存活与c-myc（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、源于骨髓间充质干细胞的神经元存活与c-myc（论文提纲范文）
（1）瞬目反射评估2型糖尿病患者中枢神经系统损害的临床研究及黄芪多糖、人参皂苷Rg1优化人脐带间充质干细胞向神经干细胞转化的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 2型糖尿病的中枢神经系统损害 |
| 1.2 瞬目反射 |
| 1.3 人脐带间充质干细胞转化为神经干细胞 |
| 1.4 黄芪多糖的研究概况 |
| 1.5 人参皂苷Rg1 的研究概况 |
| 1.6 课题的研究目的与意义 |
| 第2章 瞬目反射评估2 型糖尿病患者中枢神经系统损害的临床研究 |
| 2.1 研究对象与方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 临床基本资料分析 |
| 2.2.2 T2DM患者BR各参数的性别差异 |
| 2.2.3 瞬目反射各参数与2 型糖尿病患者的年龄、BMI、病程、Hb A1C之间的相关性分析 |
| 2.2.4 健康组、T2DM无 DSPN 组和T2DM伴 DSPN 组之间瞬目反射的差异分析 |
| 2.2.5 T2DM患者中有头晕症状的患者瞬目反射特点 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论与展望 |
| 第3章 黄芪多糖、人参皂苷Rg1 优化人脐带间充质干细胞向神经干细胞转化的实验研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 脐带标本 |
| 3.1.2 实验试剂及仪器 |
| 3.1.3 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 hUCMSCs的分离、培养及鉴定 |
| 3.2.2 hUCMSCs来源的NSCs的产生及鉴定 |
| 3.2.3 不同浓度APS、人参皂苷Rg1对hUCMSCs生长的影响 |
| 3.2.4 不同浓度APS、人参皂苷Rg1对hUCMSCs向 NSCs转化过程中细胞存活的影响 |
| 3.2.5 APS、人参皂苷Rg1对hUCMSCs向 NSCs转化过程中细胞凋亡的影响 |
| 3.2.6 APS、人参皂苷Rg1对hUCMSCs来源的NSCs中 CD90 及HLA-DR表达的影响 |
| 3.2.7 APS、人参皂苷Rg1对hUCMSCs来源的NSCs中 Nestin蛋白表达的影响 |
| 3.2.8 APS、人参皂苷Rg1对hUCMSCs来源的NSCs中 SOX2 蛋白表达的影响 |
| 3.2.9 PCR结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 结论与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 中药促进神经干细胞增殖、分化的研究进展 |
| 参考文献 |
（2）人皮肤角质形成细胞来源的诱导性多能干细胞的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一章 富含干细胞的人皮肤角质形成细胞的获取 |
| 一、试剂和材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 人皮肤角质形成细胞重编程产生诱导性多能干细胞 |
| 一、试剂、材料和使用设备 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 诱导性多能干细胞超微结构的对比研究 |
| 一、试剂材料和仪器 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 总结和展望 |
| 第四章 综述 |
| 综述 1 表皮干细胞增殖和分化机制研究 |
| 参考文献 |
| 综述 2 皮肤干细胞在皮肤再生及创伤修复中的作用 |
| 参考文献 |
| 综述 3 人皮肤源性多潜能干细胞的研究现状和应用前景 |
| 参考文献 |
| 负责科研项目 |
| 参与科研项目 |
| 读博期间发表的论文 |
| 缩写词表 |
| 致谢 |
（3）成纤维细胞联合血管内皮细胞促进脂肪干细胞增殖及成骨分化研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 血管内皮细胞、脂肪干细胞及成纤维细胞的鉴定及体外培养 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 六、参考文献 |
| 第二章 通过共培养血管内皮细胞及成纤维细胞诱导脂肪干细胞成骨分化的研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料和方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、结论 |
| 六、参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 成纤维细胞的生物学特性及分化潜能 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（4）猪诱导多能性干细胞定向分化为血管内皮细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 血管内皮细胞与心血管疾病 |
| 1.1.1 血管内皮细胞的发生 |
| 1.1.2 血管内皮细胞的病变与心血管疾病 |
| 1.1.3 心血管疾病的治疗现状 |
| 1.2 多能性干细胞 |
| 1.2.1 多能性干细胞的分类和特征 |
| 1.2.2 多能性干细胞应用的前景和挑战 |
| 1.3 多能性干细胞向血管内皮细胞的定向分化 |
| 1.3.1 多能性干细胞向血管内皮细胞定向分化的研究进展 |
| 1.3.2 多能性干细胞向血管内皮细胞定向分化的鉴定 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物及材料 |
| 2.1.2 主要仪器及设备 |
| 2.1.3 主要试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 常用试剂及配制方法 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 病毒包装 |
| 2.2.3 猪诱导多能性干细胞的建系 |
| 2.2.4 细胞多能性鉴定 |
| 2.2.5 Realtime-PCR检测 |
| 2.2.6 猪多能性干细胞向血管内皮细胞的诱导分化 |
| 2.2.7 流式细胞分选 |
| 2.2.8 血管内皮细胞的功能鉴定 |
| 2.2.9 数据统计与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 猪多能性干细胞的获得及鉴定 |
| 3.1.1 猪诱导多能性干细胞的获得及鉴定 |
| 3.1.2 猪多能性干细胞的培养及鉴定 |
| 3.2 不同来源的猪多能性干细胞向中胚层分化潜能的比较 |
| 3.2.1 不同来源的猪多能性干细胞向中胚层诱导过程中的形态比较 |
| 3.2.2 不同来源的猪多能性干细胞向中胚层诱导过程中谱系标记基因的表达比较 |
| 3.3 piPSCs向中胚层分化的诱导体系的筛选 |
| 3.4 piPSCs向血管内皮细胞诱导分化体系的建立 |
| 3.4.1 不同处理对piPSCs向中胚层分化过程中谱系标记基因表达的影响 |
| 3.4.2 不同处理对piPSCs向血管内皮细胞分化效率的影响 |
| 3.4.3 piPSCs来源的血管内皮细胞(pi PSC-ECs)的鉴定 |
| 3.5 piPSCs和 h ESCs向血管内皮细胞分化进程的比较 |
| 3.5.1 piPSCs和 h ESCs向中胚层分化过程中谱系标记基因的表达比较 |
| 3.5.2 piPSCs和 h ESCs向血管内皮细胞分化效率的比较 |
| 3.5.3 pi PS-ECs和 h ES-ECs的形态、基因表达和体外功能的比较 |
| 4 讨论 |
| 4.1 不同来源的猪多能性干细胞向中胚层的分化潜能 |
| 4.2 猪多能性干细胞向中胚层分化的调控 |
| 4.3 猪诱导多能性干细胞来源的血管内皮细胞的鉴定 |
| 4.4 多能性干细胞向血管内皮细胞诱导分化体系的物种特异性 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（5）miR-221在人乳牙牙髓干细胞神经分化过程中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 人乳牙牙髓干细胞 |
| 1.2 人乳牙牙髓干细胞在神经疾病中的应用 |
| 1.3 miRNA在神经疾病发生的作用 |
| 1.4 miRNA调控神经增殖与分化 |
| 1.5 Wnt/β-catenin信号通路调控神经增殖与分化 |
| 第2章 miRNA-221 在人乳牙牙髓干细胞神经分化过程中的表达模式及作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料、实验试剂及相关试剂配制 |
| 2.1.2 主要实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 人乳牙牙髓干细胞的形态观察及鉴定 |
| 2.2.2 人乳牙牙髓干细胞体外神经元分化体系的建立 |
| 2.2.3 miR-221 在人乳牙牙髓干细胞神经分化过程中的表达规律 |
| 2.2.4 miR-221 促进人乳牙牙髓干细胞神经分化效率 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 miRNA-221 的靶基因确定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料、实验试剂及相关试剂配制 |
| 3.1.2 主要实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 生物信息学分析预测miR-221 的靶基因是CHD8 |
| 3.2.2 双荧光素酶报告基因分析验证miR-221 的靶基因是CHD8 |
| 3.2.3 miR-221 抑制人乳牙牙髓干细胞CHD8 的表达 |
| 3.2.4 CHD8 在人乳牙牙髓干细胞神经分化过程中表达下调 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 miRNA-221 调控人乳牙牙髓干细胞Wnt/β-catenin通路的分子机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料、实验试剂及相关试剂配制 |
| 4.1.2 主要实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 人乳牙牙髓干细胞神经分化过程中Wnt/β-catenin通路特征蛋白表达上调 |
| 4.2.2 miR-221 通过抑制CHD8 激活人乳牙牙髓干细胞的Wnt/β-catenin通路 |
| 4.2.3 miR-221 通过激活Wnt/β-catenin通路提高人乳牙牙髓干细胞神经分化效率 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 miRNA-221 通过抑制CHD8 激活Wnt/β-catenin通路促进人乳牙牙髓干细胞神经分化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料、实验试剂及相关试剂配制 |
| 5.1.2 主要实验方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 miR-221 通过抑制CHD8 促进人乳牙牙髓干细胞增殖 |
| 5.2.2 miR-221 通过CHD8 促进人乳牙牙髓干细胞周期由G0/G1向S期转变 |
| 5.2.3 miR-221 通过抑制CHD8 抑制人乳牙牙髓干细胞凋亡 |
| 5.2.4 miR-221 通过抑制CHD8 促进人乳牙牙髓干细胞神经分化效率 |
| 5.2.5 CHD8 通过Wnt/β-catenin通路调控人乳牙牙髓干细胞神经分化 |
| 5.3 讨论 |
| 第6章 讨论和结论 |
| 6.1 讨论 |
| 6.2 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间的研究成果 |
| 综述 人乳牙牙髓干细胞的研究进展及其调控机制 |
| 参考文献 |
（6）沉默SNHG12后BMSCs对脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 BMSCs原代培养及鉴定 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第二章 LncRNA SNHG12对大鼠BMECs的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 BMSCs对大鼠BMECs的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 沉默SNHG 12后BMSCs对大鼠BMECs的作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 沉默SNHG12后BMSCs对大鼠I/R损伤的作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词对照表 |
| 学习期间发表论文 |
| 致谢 |
（7）运动通过IGF-1/Nrf2通路激活糜蛋白酶样活性促进成年小鼠海马神经发生（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 自主跑轮运动对海马蛋白酶体活性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同年龄小鼠海马三种蛋白酶体活性及相应蛋白酶体亚单位的变化 |
| 2.2 成年小鼠自主跑轮运动后海马三种蛋白酶体活性的变化 |
| 2.3 成年小鼠自主跑轮运动4 周和8 周后海马糜蛋白酶样活性的变化 |
| 2.4 自主跑轮运动总距离与海马糜蛋白酶样活性相关性分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 运动上调IGF-1激活糜蛋白酶体活性对成年小鼠海马神经发生及学习记忆的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 成年小鼠自主跑轮运动对血清及海马IGF-1 含量的影响 |
| 2.2 .IGF-1 作用对成年海马NPCs增殖及分化能力的影响 |
| 2.3 .IGF-1 作用对成年海马NPCs的糜蛋白酶样活性的影响 |
| 2.4 抑制IGF-1 对运动小鼠海马糜蛋白酶样活性的影响 |
| 2.5 抑制IGF-1 对运动小鼠海马神经发生及学习记忆能力的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第三部分 IGF-1/Nrf2 对成年小鼠自主跑轮运动后海马神经发生及学习记忆的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 成年小鼠自主跑轮运动对海马Nrf2 转录激活的影响 |
| 2.2 .IGF-1 作用对NPCs的 Nrf2 转录激活的影响 |
| 2.3 .IGF-1 作用对N2a细胞Nrf2 转录活性及糜蛋白酶样活性的影响 |
| 2.4 抑制IGF-1 对运动小鼠海马Nrf2 转录激活的影响 |
| 2.5 Nrf2对N2a细胞蛋白酶体亚单位PSMB5 转录活性的影响 |
| 2.6 敲减Nrf2 对运动小鼠海马糜蛋白酶样活性的影响 |
| 2.7 敲减Nrf2 对运动小鼠海马神经发生及学习记忆能力的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（8）肾脑复元汤对人脐带间充质干细胞增殖及细胞周期的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词 |
| 引言 |
| 第一部分 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 药物与实验试剂 |
| 1.3 实验仪器 |
| 1.4 主要液体及试剂配置 |
| 2.实验内容与方法 |
| 2.1 肾脑复元汤含药血清配备 |
| 2.2 细胞培养、传代 |
| 2.3 分组 |
| 2.4 检测指标 |
| 2.5 统计学处理 |
| 第二部分 实验结果分析与讨论 |
| 1.实验结果分析 |
| 1.1 细胞形态观察 |
| 1.2 不同浓度肾脑复元汤对hUC-MSCs的增殖活性 |
| 1.3 肾脑复元汤对hUC-MSCs细胞周期的影响 |
| 1.4 Western blot法检测β-catenin、c-Myc、cyclin D1 蛋白表达 |
| 2.讨论 |
| 2.1 缺血性脑卒中神经保护治疗必要性 |
| 2.2 hUC-MSCs的神经保护作用 |
| 2.3 肾脑复元汤对缺血性脑卒中的作用 |
| 2.4 肾脑复元汤与hUC-MSCs通过神经保护对脑梗死治疗的可能机制 |
| 2.5 β-catenin,c-Myc、cyclin D1 蛋白表达对细胞增殖及细胞周期的影响 |
| 3.问题及展望 |
| 3.1 存在的问题 |
| 3.2 展望 |
| 4.结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 干细胞治疗缺血性脑卒中的研究进展 |
| 参考文献 |
（9）骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤和认知障碍的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 MSC-EV对于SAH大鼠后早期脑损伤的神经保护作用的研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 miR-21介导的MSC-EV在SAH后的神经保护作用的分子机制研究 |
| 1.前言 |
| 2.材料和方法 |
| 3.结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.附图 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
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| 英文文章 |
（10）LncRNAs调节hiPSCs向多巴胺能神经元的诱导分化和干细胞移植治疗帕金森大鼠及PTRF转基因小鼠中造血干细胞功能损伤的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词 |
| 第一部分 LncRNAs调节hiPSCs向多巴胺能神经元的诱导分化和干细胞移植治疗帕金森大鼠模型的研究 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 hiPSCs向多巴胺能神经元诱导分化中lncRNAs的差异表达及lncRNA MIAT的调节作用 |
| 前言 |
| 第一节 hiPSCs向多巴胺能神经元诱导分化体系的建立 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. hiPSCs的细胞培养与多能性鉴定 |
| 2. hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程和细胞形态 |
| 3. hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程中相关基因表达 |
| 4. hiPSCs向DA能神经元诱导分化过程中相关标志物的免疫荧光染色 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二节 hiPSCs向多巴胺能神经元诱导分化过程中lncRNAs的表达变化和功能分析 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. 测序样本总RNA的质量检测 |
| 2. LncRNAs测序数据质量评估 |
| 3. 比对分析结果 |
| 4. 表达量分析结果 |
| 5. 差异基因表达与验证 |
| 6. 差异基因聚类 |
| 7. 差异表达mRNAs的富集分析结果 |
| 8. LncRNAs co-expression靶基因预测与功能分析 |
| 9. LncRNAs co-location靶基因预测与功能分析 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三节 LncRNA MIAT调节hiPSCs的神经分化 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. LncRNA MIAT与共表达靶基因KEGG通路分析与验证 |
| 2. 成功构建转录激活过表达lncRNA MIAT的hiPSCs细胞系 |
| 3. 过表达lncRNA MIAT对hiPSCs多能性的影响 |
| 4. 过表达lncRNA MIAT对hiPSCs向DA能神经元诱导分化的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 6-OHDA大鼠帕金森模型的建立和不同脑区的转录组分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. 6-OHDA大鼠PD模型的损伤程度 |
| 2. 测序样本总RNAs的质量检测 |
| 3. mRNAs测序数据质量评估 |
| 4. 比对分析结果 |
| 5. 5个脑区的表达量分析结果 |
| 6. 5个脑区的差异表达基因(DEGs)与验证 |
| 7. 5个脑区的差异基因聚类分析与韦恩分析 |
| 8. 5个脑区的差异基因富集分析 |
| 9. 5个脑区的PPI分析与验证 |
| 10. KEGG分析关键信号通路的验证 |
| 11. 6-OHDA大鼠PD模型5个脑区的线粒体超微结构改变 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 干细胞移植治疗6-OHDA大鼠帕金森模型的效果评价 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. 干细胞鉴定 |
| 2. APO诱导旋转测试不同类型干细胞移植治疗的行为学效果评价 |
| 3. 旷场试验和抓力测试 |
| 4. 移植细胞在脑内的存活、迁移、增殖和分化 |
| 5. 细胞移植后星形胶质细胞的表达 |
| 6. 细胞移植后超微结构改变 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 第二部分 PTRF转基因小鼠中造血干细胞的功能受损 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计方法 |
| 结果 |
| 1. PTRF的表达随年龄增长而增加并促进髓系分化 |
| 2. PTRF过表达耗损HSCs |
| 3. PTRF过表达损伤HSCs的功能 |
| 4. PTRF诱导HSCs衰老 |
| 5. PTRF通过Cav-1激活了HSCs的衰老通路 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 长链非编码RNA在神经发育和帕金森病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件1 hiPSCs质检报告(赛贝公司) |
| 附件2 表5-1 iPSCd0组与iPSCd7组转录本水平差异显着的lncRNAs |
| 附件3 表5-2 iPSCd0组与iPSCd7组基因水平差异显着的mRNAs |
| 附件4 表5-3模型组与对照组在OB区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件5 表5-4模型组与对照组在SVZ区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件6 表5-5模型组与对照组在Str区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件7 表5-6模型组与对照组在SN区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 附件8 表5-7模型组与对照组在Hippo区排名前10的DEGs(含上调和下调) |
| 个人简介 |
| 致谢 |
四、源于骨髓间充质干细胞的神经元存活与c-myc（论文参考文献）
- [1]瞬目反射评估2型糖尿病患者中枢神经系统损害的临床研究及黄芪多糖、人参皂苷Rg1优化人脐带间充质干细胞向神经干细胞转化的实验研究[D]. 肖丽. 南昌大学, 2021(01)
- [2]人皮肤角质形成细胞来源的诱导性多能干细胞的研究[D]. 杨玉花. 苏州大学, 2020(06)
- [3]成纤维细胞联合血管内皮细胞促进脂肪干细胞增殖及成骨分化研究[D]. 杨桂然. 昆明医科大学, 2020
- [4]猪诱导多能性干细胞定向分化为血管内皮细胞的研究[D]. 伟人悦. 东北农业大学, 2020(04)
- [5]miR-221在人乳牙牙髓干细胞神经分化过程中的作用及机制研究[D]. 文冰. 南昌大学, 2020
- [6]沉默SNHG12后BMSCs对脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究[D]. 李远志. 南方医科大学, 2020(01)
- [7]运动通过IGF-1/Nrf2通路激活糜蛋白酶样活性促进成年小鼠海马神经发生[D]. 牛晓洁. 山西医科大学, 2020(10)
- [8]肾脑复元汤对人脐带间充质干细胞增殖及细胞周期的影响[D]. 徐雅倩. 湖南中医药大学, 2020(03)
- [9]骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤和认知障碍的保护作用及机制研究[D]. 高校. 山东大学, 2020(12)
- [10]LncRNAs调节hiPSCs向多巴胺能神经元的诱导分化和干细胞移植治疗帕金森大鼠及PTRF转基因小鼠中造血干细胞功能损伤的研究[D]. 吕颖. 北京协和医学院, 2020(05)