一、T细胞活化的负调节机制（论文文献综述）
宋梦昭[1]（2021）在《猪瘟病毒C株及其非结构蛋白对猪肺泡巨噬细胞Toll样受体介导的天然免疫应答的影响》文中研究说明猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus,CSFV）引起的一种严重的猪传染性疾病,感染动物出现白细胞减少、发热、出血和流产等症状,具有较高的病死率。CSF严重影响养猪业的健康发展,因此我国和一些国家采用我国上世纪50年代研制的兔化弱毒疫苗（C株疫苗）预防接种来控制疫情,取得了良好的效果。CSFV石门株和C株感染宿主后引起不同的免疫反应,石门株能抑制宿主的天然免疫进而建立持续性感染,而C株能刺激宿主产生特异性抗体起保护作用,但其机理尚不清楚。Toll样受体（Toll-like receptors,TLRs）作为天然免疫系统中模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）家族成员之一,识别病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）之后诱导Ⅰ型干扰素和促炎细胞因子的产生。本团队前期研究发现CSFV石门株和C株能够引起TLRs基因差异性表达,并且石门株抑制TLR3介导的信号通路来影响宿主天然免疫;通过慢病毒包装系统过表达CSFV石门株蛋白来研究其对TLRs信号通路的影响,发现病毒蛋白不同程度的引起TLRs信号通路的变化。鉴于CSFV石门株与C株引起宿主不同的免疫反应,因此,本文旨在研究CSFV C株及其非结构蛋白对猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）TLRs介导的天然免疫的影响,获得了以下结果。（1）CSFV C株感染3D4/21细胞后的不同时间,C株对TLRs介导的天然免疫应答的影响呈现动态调节过程。C株感染24 h后,显着抑制TLR2、TLR7及其下游关键分子My D88、IRF7的表达（P<0.05或P<0.01）而显着促进TLR3、TLR4和TRIF表达（P<0.05）,主要抑制TLR2和TLR7介导的信号通路,从而避免TLRs过度激活;C株感染48 h和72 h后,显着上调TLR2、TLR3、TLR4和TLR7及其信号通路下游关键蛋白（My D88、TRIF、IRF3和IRF7）、下游免疫效应因子Ⅰ型干扰素和IL-6表达（P<0.05或P<0.01）,从而有助于清除病毒。（2）通过慢病毒包装系统在3D4/21细胞中过表达CSFV C株非结构蛋白,研究CSFV C株非结构蛋白通过TLRs信号通路对宿主天然免疫的影响。结果表明,p7、NS4B、NS5A和NS5B均能诱导ERK1/2的磷酸化;p7促进TLR2、TLR3、TLR7和TRIF的表达,并抑制TLR4表达,主要通过TLR3介导的信号通路影响天然免疫;Npro上调TLR2和TLR7的表达;NS3促进TLR2和TLR7表达而抑制TLR3表达;NS4A促进TLR2和TLR3表达;NS2上调TLR2、TLR7、My D88、IRF7和IFN-α表达,主要促进TLR7介导的信号通路;NS4B上调TLR3、TRIF、IRF3和IFN-β表达,促进TLR3-TRIF-IRF3依赖的信号通路来影响天然免疫;NS5A上调My D88、IRF7、IFN-α的表达,促进My D88-IRF7介导的TLRs信号通路;NS5B促进TLR2和TLR4表达,并且促进TLRs信号通路下游关键蛋白以及Ⅰ型干扰素、促炎细胞因子IL-1β和IL-6的表达。综上所述,本研究表明在CSFV C株感染3D4/21细胞的早期（24 h）,C株通过抑制TLR2和TLR7介导的信号通路来阻止TLRs过度激活,从而防止C株疫苗毒过早被清除;C株感染的中晚期（48 h,72 h）,通过促进TLR2、TLR3、TLR4和TLR7介导的信号通路诱导Ⅰ型干扰素和IL-6表达,从而有助于清除病毒;表明CSFV C株各非结构蛋白通过不同程度地促进或抑制TLR2、TLR3、TLR4和TLR7介导的信号通路来调节下游细胞因子的表达,从而影响宿主的天然免疫。研究结果为阐明CSFV C株及其非结构蛋白通过TLRs介导的信号通路对天然免疫的影响提供了新的科学资料。
涂振阳[2]（2021）在《基于脊柱结核病灶Tollip与TLR4表达水平及其相关性研究》文中进行了进一步梳理目的:通过定量及定性检测脊柱结核（spinal tuberculosis,STB）病灶组织、STB病灶旁组织及非结核组织三种组织Toll相互作用蛋白（Toll interacting protein,Tollip）和Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）的表达水平。分析三组间Tollip和TLR4表达是否存在差异,并探讨三种组织的Tollip和TLR4表达是否存在相关性。初步阐释负反馈调节因子Tollip在STB免疫应答过程中可能扮演的重要角色。方法:选取2019年12月至2020年11月于右江民族医学院附属医院住院并行手术治疗的STB患者15例,术中分别取STB病灶组织（结核病灶组）及STB病灶旁组织（结核病灶旁组）,同期选取腰椎管狭窄症（lumbar spinal stenosis,LSS）行手术治疗患者13例,术中取椎管减压组织（非结核组）。分别采用蛋白质免疫印迹（western blot,WB）、实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR,RT-q PCR）检测结核病灶组、结核病灶旁组及非结核组三种组织Tollip和TLR4在蛋白水平的表达量及mRNA水平的相对表达量。分析三组间Tollip和TLR4表达差异及各组内的Tollip和TLR4在蛋白水平及mRNA水平的相关性。此外,对结核病灶组、结核病灶旁组及非结核组三种组织的Tollip和TLR4表达水平进行免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）定性检测,并分析组间表达差异及各组内两种蛋白表达的相关性。结果:（1）WB检测结果:结核病灶组、结核病灶旁组及非结核组Tollip蛋白表达量分别为429.19±160.75、319.68±162.46、[5.96（2.96,326.80）],三组间表达差异具有统计学意义（χ2=13.21,P=0.001）,结核病灶组Tollip蛋白的表达水平显着高于非结核组（χ2=10.55,P=0.001）;结核病灶组、结核病灶旁组及非结核组TLR4蛋白表达量分别为686.25±98.25、[199.08（118.70,460.85）]、[14.82（5.35,198.29）],三组间表达差异具有统计学意义（χ2=24.07,P<0.001）,结核病灶组TLR4表达水平显着高于结核病灶旁组（χ2=11.43,P=0.001）及非结核组（χ2=18.55,P<0.001）,结核病灶旁组显着高于非结核组（χ2=6.54,P=0.011）。Tollip和TLR4蛋白表达量相关性分析结果显示:结核病灶组Tollip和TLR4蛋白表达量呈负相关（r=-0.725,P=0.002）,非结核组Tollip和TLR4蛋白表达量呈正相关（r=0.703,P=0.007）。（2）RT-q PCR检测结果:结核病灶组、结核病灶旁组及非结核组Tollip的mRNA相对表达量分别[1.85（1.00,4.18）]、[1.00（0.43,1.20）]、[0.52（0.44,1.26）],三组间差异具有统计学意义（χ2=11.98,P=0.003）,结核病灶组Tollip的mRNA相对表达量显着高于结核病灶旁组（χ2=6.22,P=0.013）及非结核组（χ2=10.41,P=0.001）;结核病灶组、结核病灶旁组及非结核组TLR4的mRNA相对表达量分别[2.67（1.04,6.91）]、[1.00（0.47,1.02）]、[0.36（0.24,0.82）],三组间差异具有统计学意义（χ2=18.34,P<0.001）,结核病灶组TLR4的mRNA相对表达量显着高于结核病灶旁组（χ2=10.38,P=0.001）及非结核组（χ2=12.26,P<0.001）,结核病灶旁组显着高于非结核组（χ2=5.89,P=0.015）。TLR4和Tollip的mRNA相对表达量相关性分析结果显示:结核病灶旁组Tollip和TLR4的mRNA相对表达量呈正相关（r=0.687,P=0.005）,非结核组Tollip和TLR4的mRNA相对表达量呈正相关（r=0.855,P<0.001）。（3）IHC:Tollip的低度表达、中度表达及强度表达在结核病灶组（6.67%,1/15）、（53.33%,8/15）、（40.00%,6/15）、结核病灶旁组（33.33%,5/15）、（46.67%,7/15）、（20.00%,3/15）及非结核组（15.38%,2/13）、（61.54%,8/13）、（23.08%,3/13）三组间差异无明显统计学意义（χ2=4.489,P=0.344）;TLR4的低度表达、中度表达及强度表达在结核病灶组（13.33%,2/15）、（66.67%,10/15）、（20.00%,3/15）、结核病灶旁组（26.67%,4/15）、（66.67%,10/15）、（6.66%,1/15）及非结核组（23.08%,3/13）、（46.15%,6/13）、（30.77%,4/13）三组间的差异无明显统计学意义（χ2=3.508,P=0.477）。在IHC检测结果中,结核病灶组、结核病灶旁组及非结核组Tollip和TLR4相关性分析结果均无统计学意义（χ2=2.833,P=0.586;χ2=5.486,P=0.241;χ2=7.438,P=0.114）。结论:（1）STB病灶组织中,Tollip和TLR4蛋白表达量及mRNA相对表达量较结核病灶旁组织及非结核组织显着增加,提示Tollip可能在STB病灶的免疫应答过程中发挥重要的作用。（2）在相关性具有统计学意义的组中,STB病灶组织Tollip和TLR4在蛋白水平上呈负相关,结核病灶旁组织Tollip和TLR4的mRNA水平上呈正相关,非结核组织的Tollip和TLR4在蛋白及mRNA水平上呈正相关。提示在STB发生、发展过程中,可能存在Tollip对TLR4信号传导通路负反馈调控作用,并且STB病灶组织较STB病灶旁组织及非结核组织的作用更加明显。
何泳龙[3]（2020）在《miR-150与白藜芦醇在痛风炎症中的作用机制研究》文中指出背景与目的:痛风（gout）是尿酸或尿酸盐（monosodium urate,MSU）晶体沉积于全身关节及其关节周围组织或器官而引起以高尿酸血症、急慢性痛风性关节炎、痛风石、尿酸性尿路结石以及尿酸性肾病为主要表现的一组临床综合征。近年来,在全球范围内痛风的发病率和患病率呈逐年升高趋势,且有年轻化趋势。流行病学资料显示,欧洲痛风患病率达1.4%,而我国痛风患病率1%3%。高尿酸血症是痛风发生的生化基础和最直接原因。研究证实,MSU可作为DAMPs激活TLRs介导的免疫炎症信号通路,释放IL-1β、TNF-α、IL-6等致炎因子。痛风区别于其它自身炎症性疾病或自身免疫性疾病的显着特征之一是急性发作后710天后可自行缓解,痛风这一特征的具体分子机制尚不清楚,是目前痛风发病机制中急需解决的问题之一。micro RNAs是一类长度约为18-25nt的内源性高度保守的非编码小RNA,它通过与靶基因的3’-UTR结合,形成RNA诱导的沉默复合体,来降解m RNA和/或抑制靶m RNA转录后翻译。mi RNAs在炎症反应的调节作用受到广泛的关注。近年来,越来越多的研究发现,mi RNAs在痛风发病过程中发挥重要作用。本课题组前期研究发现,mi R-150在MSU刺激的野生型小鼠骨髓诱导的巨噬细胞中呈高表达,提示mi R-150可能参与MSU诱导的炎症反应。中医认为痛风属于“痹症”范畴,是因脾胃运化功能失常所致。湿热瘀阻型和痰瘀互结证是痛风急性发作期最常见的证型,其治疗以清热利湿为主,而虎杖具有清热利湿的效果。近年来,发现虎杖提取物白藜芦醇具有通过调节细胞信号通路和mi RNAs来发挥抗炎作用而被广泛关注。有研究显示,白藜芦醇可能通过抑制NF-κB的活化来调控TLR4信号通路来抑制巨噬细胞分泌细胞因子发挥抗炎作用,但具体机制还有待进一步研究。本课题拟通过研究痛风患者mi R-150的变化情况、mi R-150调控痛风炎症机制以及白藜芦醇调控痛风炎症的机制探讨mi R-150在痛风炎症中的作用。材料与方法:1.收集痛风（其中,急性期60例（acute gout,AG）、间歇期60例（intercritical gout,IG）患者）和同期体检的48例健康体检者（health control,HC）外周静脉血标本以及临床和实验室资料,其中。采用RT-q PCR检测痛风患者外周血单个核细胞中mi R-150、SOCS1、STAT3、NF-κB P65 m RNA表达水平,Western blot检测痛风患者PBMCs中SOCS1、p-STAT3和p-NF-κB P65蛋白水平,并通过相关性分析mi R-150与实验室资料的相关关系。2.利用生物信息学分析并鉴定THP-1细胞中mi R-150的靶分子（1）结合文献查阅及利用生物信息学软件Target Scan、mi Rbase、RNAhybrid 2.2预测,筛选出与痛风炎症相关的mi R-150靶分子;（2）构建作用靶点双荧光素酶报告载体,与mi R-150 mimic（过表达）共转染至293T细胞中,观察mi R-150是否能与靶基因3’-UTR区中预测位点结合;（3）mi R-150 mimic（过表达mi R-150）和mi R-150 inhibitor（抑制mi R-150表达）共转染THP-1细胞,采用RT-q PCR法检测mi R-150和SOCS1 m RNA的表达,运用Western blot法检测SOCS1蛋白的水平。3.mi R-150 mimic/inhibitor对MSU刺激THP-1巨噬细胞炎症的影响（1）mi R-150 mimic/inhibitor转染THP-1细胞48h后予以100ng/ml PMA诱导分化24h,再予以100μg/ml的MSU刺激6h后收集细胞和上清液;（2）采用流式细胞术检测经（1）中处理后细胞凋亡情况;RT-q PCR法检测mi R-150、SOCS1 m RNA水平;Western blot法检测SOCS1、p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白水平;采用ELISA法检测上清液中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达水平;4.白藜芦醇及SOCS1 si RNA对MSU刺激THP-1巨噬细胞炎症的影响（1）白藜芦醇单独或联合SOCS1 si RNA干预100μg/ml MSU刺激经100ng/ml PMA诱导分化的THP-1细胞,收集细胞和上清液;（2）采用流式细胞术检测经（1）中处理后的细胞凋亡情况;RT-q PCR检测SOCS1 m RNA水平;Western blot法检测SOCS1、p-STAT3、p-NF-κB p65蛋白水平;采用ELISA法检测上清液中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的表达水平;5.采用SPSS13.0统计软件包及Graph Pad Prism 5对所有数据进行分析统计,基因表达以2^（-??CT）表示,结果以均数±标准差（x±s）表示,多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）,进一步组间两两比较采用t检验（Bonferroni法）,相关性分析采用Spearman。P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.与健康对照组比较,痛风患者除炎症指标如WBC、GR、ESR和CRP外,与代谢相关的多个指标如血尿酸、BMI、血脂、血糖、血压均显着增高（P<0.01或P<0.05）;2.AG组患者外周血单个核细胞中mi R-150显着低于IG组和HC组（P均<0.05）,而IG与HC组之间差异无统计学意义（P>0.05）;3.利用生物信息学在线软件预测到SOCS1为mi R-150的靶基因;通过构建含有mi R-150作用靶点的双荧光素酶报告载体,证实了mi R-150能与SOCS1 m RNA上预测的结合位点结合;通过转染mi R-150 mimic/inhibitor至THP-1细胞后,结果发现,与Blank组比较,mi R-150 mimic组mi R-150显着上调（P<0.01）,而mi R-150inhibitor组mi R-150显着降低（P<0.01）;与Blank组比较,mi R-150mimic组SOCS1 m RNA和蛋白的表达水平显着下降（P<0.01）,而mi R-150 inhibitor组SOCS1 m RNA和蛋白的表达水平显着升高（P<0.01）。4.mi R-150对MSU刺激THP-1巨噬细胞炎症的影响:（1）RT-q PCR结果显示mi R-150在MSU刺激的THP-1巨噬细胞中表达显着增加（P<0.01）;RT-q PCR和Western blot结果显示SOCS1 m RNA和蛋白水平在MSU刺激的THP-1巨噬细胞中显着降低（P<0.05）;上清液中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达水平显着增加（P均<0.01）（2）mi R-150过表达时,RT-q PCR及Western blot结果显示SOCS1m RNA和蛋白表达水平均显着下调（P均<0.01）,Western blot结果显示p-NF-κB和p-STAT3蛋白表达显着升高（P均<0.05）;ELISA结果显示细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平显着增加（P均<0.01）;而mi R-150表达抑制时,结果显示SOCS1m RNA和蛋白表达水平均显着增加（P均<0.01）,而p-NF-κB和p-STAT3蛋白表达显着下降（P均<0.05）;上清液中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平显着降低（P均<0.01）;（3）AG组和IG组PBMCs中SOCS1 m RNA和蛋白均显着低于HC组（P<0.01,P<0.05）,且AG组显着低于IG组（P<0.05）。AG组STAT3和NF-κB p65 m RNA水平显着高于IG组和HC组（P<0.05,P<0.01）,AG组p-STAT3和p-NF-κB p65蛋白水平显着高于IG组和HC组（P均<0.01）5.流式细胞术结果显示不同浓度的白藜芦醇、白藜芦醇单独或联合SOCS1 si RNA组细胞活性均大于96%,凋亡率小于5%,说明白藜芦醇联合MSU和SOCS1 si RNA以及不同浓度白藜芦醇联合MSU刺激THP-1细胞对细胞活性无显着影响（P均>0.05）。6.不同浓度（0,25,50,100μM）Res联合MSU刺激THP-1细胞后,结果发现mi R-150在各组间差异无统计学差异（P>0.05）。Res50μmol/L、100μmol/L联合MSU组SOCS1 m RNA和蛋白表达水平较MSU组显着增加（P均<0.05）,且SOCS1的表达水平呈现浓度依赖性;同时我们发现Res 50μmol/L、100μmol/L联合MSU组NF-κB p65 m RNA和p-NF-κB p65蛋白水平较MSU组显着下降,且随着Res浓度增加下降越明显（P<0.05,P<0.01）;7.不同浓度（0,25,50,100μM）Res联合MSU刺激THP-1细胞后,结果发现Res 50μmol/L、100μmol/L联合MSU组IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达水平较MSU组显着下降（P均<0.01）,且随着Res浓度增加而下降;8.SOCS1 si RNA联合MSU刺激THP-1细胞后,与MSU组比较,SOCS1 m RNA和蛋白水平显着下降（P均<0.01）,而p-NF-κB p65和p-STAT3蛋白表达水平显着增加（P均<0.01）;9.与Res100+MSU组比较,SOCS1 si RNA组中SOCS1的m RNA和蛋白表达水平显着下降（P均<0.05）,而p-NF-κB p65和p-STAT3蛋白表达水平明显增加（P均<0.05）;上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达水平显着增加（P均<0.01）。与SOCS1 si RNA联合MSU组比较,SOCS1 si RNA+Res100+MSU组SOCS1 m RNA和蛋白表达水平增加（P均<0.01）,而p-NF-κB p65和p-STAT3蛋白表达水平明显下调（P均<0.01）;上清液中IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白表达水平显着降低（P均<0.01）。小结:1.除炎症指标如WBC、GR、ESR、CRP外,痛风患者代谢指标如BMI、血压、血糖、血脂等多项实验室指标均高于健康对照者,说明痛风患者容易伴发代谢相关性疾病。2.mi R-150在痛风患者PBMCs中和MSU诱导的巨噬细胞炎症反应中表达异常,提示mi R-150可能参与了痛风的发病。3.预测并验证了SOCS1为mi R-150靶分子;并通过转染实验发现SOCS1 m RNA和蛋白水平能够被mi R-150抑制,提示mi R-150可能通过降解SOCS1 m RNA而发挥抑制作用。4.SOCS1在痛风患者和MSU诱导的炎症反应中表达显着降低,而STAT3、NF-κB p65 m RNA和p-STAT3和p-NF-κB p65蛋白水平在痛风患者和MSU诱导的炎症反应中显着增加,提示SOCS1、NF-κB和STAT3信号通路可能参与痛风发病过程。5.mi R-150可能通过下调SOCS1的表达,进而促进NF-κB信号通路和STAT3的活化,使炎症因子分泌增多,进而加重炎症反应。6.白藜芦醇通过上调MSU诱导的THP-1巨噬细胞炎症反应中SOCS1的水平,降低p-NF-κB p65和p-STAT3以及炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6水平的降低,SOCS1 si RNA抑制SOCS1的表达后能逆转白藜芦醇的这种抑制效应,提示白藜芦醇调控NF-κB和STAT3的活化来抑制MSU诱导的痛风炎症反应可能是通过上调SOCS1的表达实现的。
董玉珍[4]（2019）在《过敏性紫癜患儿血清可溶性CTLA-4的水平变化及意义探讨》文中进行了进一步梳理目的:通过观察过敏性紫癜（HSP）患儿血清可溶性细胞毒性T细胞相关抗原4（s CTLA-4）的水平变化特点,探讨s CTLA-4在儿童HSP发病机制中的作用,并为HSP治疗寻找新的方向。方法:收集2017年10月至2018年05月在青岛大学附属医院儿科和高密市人民医院儿科住院的49例过敏性紫癜患儿作为研究对象（HSP组）,62名门诊健康查体儿童为正常对照组。HSP患儿根据紫癜急性期和经治疗后4周内有无出现尿检异常（血尿或/和蛋白尿）分为肾损害组（HSPN组）和无肾损害组（NHSPN组）;根据急性期有无消化道症状（腹痛、便血或呕血等）分为两组进行比较;根据有无前驱感染（发热、咳嗽等）分为两组进行比较。HSP患儿和对照组儿童均采集清晨空腹静脉血3ml,充分离心后,分离血清并收集及储存在-80℃的冰箱中。血清s CTLA-4水平检测应用双抗体夹心ELISA方法,血清免疫球蛋白（Ig A、Ig G、Ig M和Ig E）检测采用免疫投射比浊法。结果:HSP患儿其急性期血清s CTLA-4水平为（3749.5±804.5）pg/ml,显着低于健康对照组组（5101.8±566.7）pg/ml,差异有极显着的统计学意义（P<0.01）。HSPN组患儿血清s CTLA-4水平为（3801.6±839.7）pg/ml,NHSPN组患儿血清s CTLA-4水平为（3724.3±799.0）pg/ml,两者之间差异无统计学的意义（P>0.05）。但HSPN组和NHSPN组患儿血清s CTLA-4水平均显着低于健康对照组（P<0.01）。有前驱感染组HSP患儿血清s CTLA-4水平为（3446.1±773.2）pg/ml,无前驱感染组HSP患儿血清s CTLA-4水平为（4065.6±723.0）pg/ml,两者之间差异无统计学的意义（P>0.05）。有消化道症状组HSP患儿血清s CTLA-4水平为（3927.8±242.3）pg/ml,无消化道症状组HSP患儿血清s CTLA-4水平为（3670.9±126.9）pg/ml,两者之间差异无统计学的意义（P>0.05）。HSP患儿血清s CTLA-4水平和其血清免疫球蛋白（Ig A、Ig G、Ig M和IgE）水平之间都无明显的相关性（r=-0.172、0.068、0.068、0.187,P>0.05）。结论:HSP患儿急性期血清s CTLA-4水平明显降低,有无前驱感染HSP患儿间血清s CTLA-4水平并无明显差异,结果提示HSP患儿急性期存在细胞毒性T细胞功能异常（CTLA-4表达降低）,其在HSP的免疫紊乱中可能扮演重要角色;有、无早期肾损害HSP患儿间血清s CTLA-4水平无明显差异;急性期有无消化道症状HSP患儿间血清s CTLA-4水平也无明显差异;提示血清s CTLA-4水平变化与HSP患儿脏器受累情况无关。
郭坤彬[5]（2019）在《EGFR-TKIs及血根碱在NSCLC中调节MHC-Ⅰ的作用与机制研究》文中研究表明目的:肺癌是我国当前发病率最高的肿瘤,在我国肺癌患者中大约86%为非小细胞肺癌（NSCLC）。驱动基因突变理论和靶向药物的成功研制为非小细胞肺癌治疗提出了精准医疗的新概念。作为我国非小细胞肺癌患者的主要驱动基因突变类型,表皮生长因子受体（EGFR）突变占我国非小细胞肺癌患者的28%（2015年统计数据）。靶向表皮生长因子的酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine Kinase Inhibitors,TKIs）是当前携带EGFR突变NSCLC患者的首选治疗药物,但由于TKIs的耐药进展,目前上市的三代TKIs均已出现耐药患者,EGFR-TKIs靶向治疗并未根本的解决EGFR突变的NSCLC的长期生存率。近年来,免疫检查点抗体药物的出现为晚期肿瘤治疗带来曙光,其中程序性死亡蛋白-1及其配体（PD-1/PD-L1）抗体药物在某些种类的肿瘤治疗上取得了里程碑式的重大突破,使这些肿瘤的长期生存率显着升高。但是多项临床研究表明EGFR突变的NSCLC患者对PD-1/PD-L1抗体药物治疗不敏感,反应率极低,这制约了 PD-1/PD-L1抗体药物在EGFR突变的NSCLC患者中的应用。有文献报道在一些EGFR突变的瘤肿中MHC-Ⅰ分子出现下调,并与EGFR突变呈相关性,这可以部分解释EGFR突变NSCLC患者对PD-1/PD-L1抗体不敏感。本课题从临床标本和体外实验中发现EGFR突变激活对MHC-Ⅰ膜表达及抗原提呈系统的影响,而且应用相应的抑制剂可以逆转这些影响。由于TKIs联合PD-1/PD-L1抗体药物的几个临床实验均因严重不良反应而中止,我们的发现或许可以为PD-1/PD-L1抗体药物与EGFR下游的AKT/mTOR通路抑制剂联合用药提高免疫治疗疗效的理论依据,继而探讨联合用药可行性。血根碱（Sanguinarine）是来源于罂粟科紫堇、白屈菜等的中药单体化合物。紫堇与白屈菜全草皆有解毒、止痒之功效,提示他们所含成分可能影响免疫功能。近年来有文献报道血根碱在多种瘤肿细胞株和动物模型中有抗肿瘤作用[1-5],但其抗肿瘤作用机制尚未十分明确。本课题通过计算机分子模拟,免疫学和分子生物学实验证明血根碱可以通过抑制原癌基因EGFR和AKT的活化,继而影响MHC-Ⅰ分子表达,提示其可能提升肺癌免疫治疗疗效。方法:一、选取EGFR突变的病人标本34例,EGFR野生型病人标本20例,进行对CD8和HLA-ABC的免疫组织化学染色。免疫组织化学染色方法如正文所述,染色后,由两名病理医师进行评分结合计算机软件（ImageJ,Image-Pro Plus）计算灰度密度,得出最后评分。二、通过在正常人肺上皮细胞系Beas-2B中转入EGFR突变质粒,构建稳定表达的细胞系,进行蛋白免疫印迹实验（Western Blot）、流式细胞术、免疫荧光等实验方法检测EGFR激活对MHC-Ⅰ、PD-L1相对表达量和膜表达量;在NSCLC细胞系中进行WB、流式细胞术、qRT-PCR等实验方法检测EGFR-TKIs（阿法替尼,奥希替尼）抑制EGFR对肿瘤细胞系MHC-Ⅰ分子胞膜表达及抗原生产和提呈系统的影响。三、通过在NSCLC细胞系中应用EGFR下游信号通路AKT/mTOR抑制剂,运用蛋白免疫印迹实验、流式细胞术、qRT-PCR等实验方法检测下游信号通路抑制剂对MHC-Ⅰ膜表达及抗原生产和提呈系统的影响,进而解释TKI对MHC-Ⅰ胞膜表达及抗原生产和提呈系统影响的机制。四、通过计算机分子模拟,免疫学和分子生物学实验方法验证血根碱对EGFR、AKT磷酸化活化的影响,验证其对MHC-I分子表达和膜转位的影响。结果:一、组织标本免疫组织化学染色结果:CD8染色,统计显示EGFR野生型组与突变组组织浸润的CD8+T淋巴细胞数量未见统计差异;HLA-ABC染色,结果显示EGFR野生型组与突变组的HLA-ABC在抗体染色灰度上未见统计学差异。通过对组织标本的观察,EGFR野生型组与突变组相比,HLA-ABC膜表达明显增加,且差异有统计学意义（P<0.05）。二、将突变的EGFR转入突变的EGFR正常肺上皮细胞系中,相对转入空载体的 Beas-2B-Vector,Beas-2B-CAG-EGFR-19DEL 细胞膜表面 MHC-Ⅰ 减少,PD-L增加,且差异有统计学意义（P<0.05）;在NSCLC细胞系中,应用EGFR-TKIs的细胞相对控制组,细胞膜表面MHC-Ⅰ增加,且差异有统计学意义（P<0.05）。EGFR-TKIs增加了 NSCLC细胞系抗原产生过程中所需的蛋白酶体核心酶蛋白PSMB8/9和抗原肽转运进内质网的蛋白转运体（TAP2）的表达水平。三、NSCLC细胞系应用EGFR下游信号通路中AKT/mTOR信号通路抑制剂后,与控制组相比,细胞膜表面MHC-Ⅰ增加,且差异有统计学意义（P<0.05）。其增加胞膜MHC-Ⅰ的作用在同时应用PSMB8/9抑制剂时解除,且差异有统计学意义（P<0.05）。NSCLC细胞系应用AKT/mTOR抑制剂后,增加了抗原产生过程中所需的蛋白酶体核心酶蛋白PSMB8/9和抗原肽转运进内质网的蛋白转运体（TAP2）的表达水平。四、分子模拟结果表明血根碱对突变的EGFR有较高的亲和力,同时其对AKT的亲和力也比较高,通过与两个原癌基因蛋白的结合抑制此两个激酶的激活,从而上调MHC-Ⅰ分子的表达并增加其膜转运。结论:一、组织标本中,EGFR野生型组与突变组有类似的CD8+T淋巴细胞浸润水平,HLA-ABC表达量无明显差异。EGFR突变组与野生型组相比,HLA-ABC膜表达显着降低。二、正常肺上皮细胞系中EGFR激活可以减少膜表面MHC-Ⅰ,增加PD-L1。NSCLC细胞系中,应用EGFR-TKIs可使膜表面MHC-Ⅰ增加。三、NSCLC细胞系中,应用EGFR下游信号通路中AKT/mTOR信号通路抑制剂可使膜表面MHC-Ⅰ增加,其作用在同时应用PSMB8/9抑制剂时解除。四、血根碱通过抑制EGFR和AKT的活化,增加MHC-Ⅰ分子表达和膜转位。
裴莹[6]（2019）在《刺络拔罐法对内毒素致热家兔的退热作用机制研究》文中指出目的:本研究采用大肠杆菌内毒素注射法复制发热家兔模型,以非甾体抗炎药物（吲哚美辛）作为对照,观察了刺络拔罐法对内毒素致热家兔血清细胞因子（IL-1β、GM-CSF、IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10、IFN-γ）水平和家兔下丘脑组织中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶（COX-1、COX-2）蛋白表达水平的影响,旨在揭示刺络拔罐法的退热作用机制,体现了刺络拔罐法的退热优势作用,为刺络拔罐法的机理阐释和临床应用提供实验依据。材料与方法:1.动物及分组:选取25只清洁级家兔,适应性喂养1周后,将它们随机分为正常组、模型组、刺络拔罐组、单纯拔罐组和西药治疗（吲哚美辛）组,每组各5只。2.造模方法:除正常组家兔外,其他组家兔均采用大肠杆菌内毒素注射法复制发热模型,用生理盐水稀释大肠杆菌内毒素至200 ng/ml,并按200 ng/kg剂量经家兔耳缘静脉注射给药进行模型复制。3.干预方法:模型复制成功后,西药组家兔给予吲哚美辛混悬液灌胃,灌胃剂量按10ml/kg,其余组家兔则分别给予相同容积的生理盐水灌胃;灌胃后单纯拔罐组家兔、刺络拔罐组家兔在造模成功1小时后分别进行拔罐操作,单纯拔罐组家兔俯卧位被固定在兔板上,在家兔大椎穴处剃毛后,采用内径25mm的透明塑料罐,连接经络罐通仪,固定罐压为-0.03Mpa在穴处拔罐,时间为15分钟;刺络拔罐组家兔按上述固定、剃毛后,先用1寸毫针（固定刺入深度2mm）点刺出血后再拔罐,拔罐方法与单纯拔罐组相同;正常组、模型组和西药治疗（吲哚美辛）组家兔均要以相同方式固定,但不进行拔罐操作。4.指标检测及方法:造模后每1小时记录体温1次,连续测量温度8小时,来观察正常组、模型组、刺络拔罐组、单纯拔罐组和西药治疗（吲哚美辛）组动物的体温变化;之后分别对正常组家兔、模型组家兔、刺络拔罐组家兔、单纯拔罐组家兔和西药治疗（吲哚美辛）组家兔进行耳缘静脉采血,采用酶联免疫吸附试验（ELISA法）检测正常组家兔、模型组家兔、刺络拔罐组家兔、单纯拔罐组家兔和西药治疗（吲哚美辛）组家兔血清细胞因子（IL-1β、GM-CSF、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10、IFN-γ）浓度;采血后用空气栓塞法（耳缘静脉注射10 ml空气）处死动物,并取出全脑,迅速于视交叉与灰结节间取下丘脑,将标本放入EP管中,液氮中保存。采用免疫印迹法（Western blot法）检测正常组家兔、模型组家兔、刺络拔罐组家兔、单纯拔罐组家兔和西药治疗（吲哚美辛）组家兔下丘脑组织诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、环氧合酶（COX-1、COX-2）蛋白表达水平。5.统计方法:实验结果采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析,所有数据均用平均数±标准差（?）来表示,两组组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为具有统计学差异。结果:1.造模后,模型组家兔造模后直肠温度逐渐升高,出现了典型的双相热,约至2h、4h时体温升高至峰值,与正常组比较,显着高于正常组,具有明显统计学差异（P<0.01）,亦提示模型复制成功。刺络拔罐组、单纯拔罐组、西药组家兔经相应治疗后,直肠温度升高程度均较模型组家兔温度明显降低,有统计学差异（P<0.05）,提示刺络拔罐法、单纯拔罐法和西药干预均有明显的退热作用;刺络拔罐组、单纯拔罐组与西药组家兔直肠温度变化的组间比较无统计学差异（P>0.05）,但从数值上看,刺络拔罐组比单纯拔罐组家兔直肠温度降低的更明显,刺络拔罐法的退热作用明显具有优于单纯拔罐法的趋势。2.模型组家兔血清IL-1β,IL-6,GM-CSF,TNF-α水平均较正常组显着升高,具有显着统计学意义（P<0.01）。经相应治疗后,刺络拔罐组、单纯拔罐组、西药组家兔血清中IL-1β,IL-6,GM-CSF,TNF-α水平则明显降低,其中刺络拔罐组和西药组与同时间段模型组家兔血清IL-1β,IL-6,GM-CSF,TNF-α水平相比,始终具有统计学差异（P<0.05）;单纯拔罐组与同时间段模型组家兔血清中的IL-1β,IL-6,GM-CSF水平之间的差异,具有统计学意义（P<0.05）,而与其TNF-α水平相比较无统计学差异（P>0.05）。表明刺络拔罐法、单纯拔罐法和西药干预后均可降低内毒素致热家兔血清细胞因子中IL-1β,IL-6,GM-CSF,TNF-α水平。刺络拔罐组、单纯拔罐组、西药组三组家兔血清IL-1β,IL-6,GM-CSF水平的组间比较,无统计学差异（P>0.05）,而单纯拔罐组与其他两组家兔血清TNF-α水平相比较,具有统计学差异（P<0.05）。无论从总体上,还是从数值上看,刺络拔罐法与单纯拔罐法相比较,可以使模型家兔血清细胞因子水平降低得更明显,具有优于单纯拔罐法的趋势。3.模型组家兔血清IL-4、IFN-γ水平明显低于正常组,具有统计学意义（P<0.05）,其血清IL-10水平也有所降低,但与正常组比较,无统计学差异（P>0.05）;干预治疗后,刺络拔罐组、单纯拔罐组家兔血清IL-4、IFN-γ水平明显被提升,与模型组同时间段内比较具有统计学差异（P<0.05）,而两组家兔血清IL-10水平仍然降低,且与模型组相比无统计学意义（P>0.05）;西药组家兔血清IL-4、IFN-γ、IL-10水平在治疗后均没有明显的提升,与模型组比较无统计学差异（P>0.05）,刺络拔罐组、单纯拔罐组家兔血清IL-4、IFN-γ水平的组间比较,无统计学差异（P>0.05）,但从数值上来看,刺络拔罐组具有更优势的作用趋势。提示经刺络拔罐法和单纯拔罐法干预,可提高内毒素致热家兔血清细胞因子中IL-4,IFN-γ水平,而对于血清IL-10水平无明显提升作用。西药对于家兔血清IL-4、IFN-γ、IL-10水平均无明显提升作用。4.模型组家兔下丘脑组织iNOS蛋白表达增加,与正常组相比具有统计学差异（P<0.05）,经干预治疗后,刺络拔罐组、单纯拔罐组、西药组家兔下丘脑组织iNOS蛋白表达水平均较模型组有明显降低,具有统计学差异（P<0.05）;三组家兔中枢iNOS蛋白表达水平组间比较无统计学差异（P>0.05）,但从数值上看,刺络拔罐法比单纯拔罐法具有更优势作用的趋势。5.模型建立后,模型组兔下丘脑组织COX-2蛋白表达增加,与正常组相比具有统计学差异（P<0.05）,而模型组兔下丘脑组织COX-1蛋白表达没有明显变化,与正常组比无统计学差异（P>0.05）;经干预治疗后,西药组家兔下丘脑组织COX-1、COX-2蛋白表达水平均较模型组有明显降低,二者具有统计学差异（P<0.05）;刺络拔罐组、单纯拔罐组家兔的下丘脑组织中COX-2蛋白表达下降,与模型组比较有统计学差异（P<0.05）,而其COX-1蛋白表达水平没有明显降低,与模型组比较无统计学差异（P>0.05）;刺络拔罐组与单纯拔罐组两组间家兔中枢COX-1、COX-2蛋白表达水平比较无统计学差异（P>0.05）,但从数值上看,刺络拔罐法比单纯拔罐法具有更优势作用的趋势。表明刺络拔罐法、单纯拔罐法对内毒素致热家兔下丘脑组织COX-1蛋白表达没有抑制作用,对中枢COX-2蛋白表达有选择性抑制作用。而西药（吲哚美辛）干预对COX-1和COX-2蛋白表达水平均有显着抑制作用。结论:1.刺络拔罐法与西药治疗同样具有良好的退热作用,但刺络拔罐法具有其优势作用。2.在退热作用起效过程中,刺络拔罐法可降低血清促炎细胞因子（IL-1β、GM-CSF、TNF-α、IL-6）水平,可提高部分血清抗炎因子（IL-4、IFN-γ）水平,可抑制中枢iNOS、COX-2蛋白表达水平,而对中枢COX-1蛋白表达水平没有抑制作用。3.刺络拔罐法退热的优势作用机制在于它可提高部分血清抗炎因子（IL-4、IFN-γ）水平,可抑制中枢COX-2蛋白表达水平的同时,对中枢COX-1蛋白表达水平没有抑制作用。4.刺络拔罐法退热疗效肯定,操作安全,值得临床推广。
范桂花[7]（2019）在《成纤维细胞与T细胞的相互作用及机制研究》文中指出目的:成纤维细胞（fibroblast,Fb）不仅有被动的组织结构作用,其还参与了急性和慢性的炎症的过程,对保持局部内环境稳态和组织的重塑修复发挥重要作用。T细胞（T lymphocyte,T cell）和成纤维细胞一样参与了肿瘤、自身免疫性疾病等特殊机体状态的内环境的调节。近年来T细胞亚群及其机制已被深入研究,然而,T细胞具体的负调节机制仍不清楚。此外,成纤维细胞对T细胞作用的研究存在争议。本课题重点研究成纤维细胞对T细胞的作用机制,帮助我们更好认识T细胞的调节机制。方法:实验思路设计主要分为两个部分进行。第一部分,探讨成纤维细胞对T细胞行为学的影响,包括成纤维细胞对T细胞增殖、活化和分化的影响。第二部分,探讨T细胞对成纤维细胞细胞行为学的影响,包括T细胞对成纤维细胞表达相关膜分子的情况及T细胞对成纤维细胞活化状态的影响。实验方法主要通过小鼠成纤维细胞与T细胞共培养实验,用流式细胞术、qPCR、ELISA和Western blot实验方法对结果进行检测。结果:成纤维细胞对T细胞的影响包括:1.成纤维细胞可通过直接和间接接触两种方式抑制活化T细胞的增殖;2.成纤维细胞不能刺激T细胞活化;3.成纤维细胞可通过直接接触对T细胞的活化发挥抑制作用;4.成纤维细胞对T细胞亚群分化产生影响。T细胞对成纤维细胞的影响包括:1.T细胞可通过直接和间接接触两种方式极大促进PD-L1的表达;2.T细胞分泌的IFN-γ促进成纤维细胞表达PD-L1;3.阻断IFN-γ的作用后,T细胞促进成纤维细胞表达PD-L1的作用减弱。结论:成纤维细胞对T细胞的增殖、活化发挥抑制作用,成纤维细胞对T细胞的分化调控产生影响,并且T细胞也对成纤维细胞的表达的分子也产生影响,特别是T细胞通过直接或者间接的方式促进了成纤维细胞PD-L1的表达,并证明了这一结果可能是通过T细胞分泌的细胞因子IFN-γ导致的。成纤维细胞表达PD-L1可能是参与T细胞负调控机制的关键分子。
成佳楠[8]（2019）在《放疗诱导嗜酸性粒细胞增多促进肿瘤内CD8+T细胞浸润的作用及机制研究》文中提出第一部分:放疗诱导嗜酸性粒细胞增多促进肿瘤内CD8+T细胞浸润的作用及机制研究背景:近年来的研究发现,肿瘤免疫治疗的疗效在很大程度上取决于肿瘤内CD8+T细胞的浸润程度和肿瘤微环境（TME）的状态。放疗可促进肿瘤免疫微环境的炎症反应从而增强CD8+T细胞介导的抗肿瘤反应,因此其可能作为免疫治疗的重要的辅助手段。已有大量证据证实放疗可诱导肿瘤局部I型干扰素介导的免疫微环境改变,然而其诱导的全身性的免疫调节作用仍有待探索。因此,进一步深入阐明放疗对肿瘤免疫微环境的影响,对探索放疗与免疫治疗的联合具有重要意义。在多种动物模型中,我们观察到放疗（RT）通过重塑肿瘤微环境使其利于嗜酸性粒细胞招募,而这种招募作用与CD8+T细胞浸润增强密切相关。当用抗体清除嗜酸性粒细胞后放疗诱导的CD8+T细胞浸润减少,而对肿瘤的控制也被明显削弱,说明放疗诱导的嗜酸性粒细胞增多对于T细胞介导的抗肿瘤作用不可或缺。在对接受过放疗的肿瘤患者进行回顾性分析时我们也发现了嗜酸性粒细胞和CD8+T细胞之间的相关性。利用动物模型我们证实放疗分别增强了回输的细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）和嵌合抗原受体（CAR）T细胞的瘤内浸润。这一现象与临床实践不谋而合,在一例淋巴瘤患者接受CD19CAR-T细胞治疗的过程中我们发现放疗促进了CAR-T细胞浸润,并缩短了治疗起效时间,延长了患者受益持续时间。综上所述,基于我们的动物和临床发现,放疗引起的嗜酸性粒细胞增多可作为参考预测患者的治疗疗效,甚至提供增强T细胞介导的抗肿瘤免疫治疗的新策略。方法:1.放疗促进肿瘤微环境中嗜酸性粒细胞的浸润。（1）建立C57BL/6小鼠的黑色素瘤荷瘤模型（B16-F10）,并对肿瘤进行局部放疗（20Gy）,放疗后第7天取肿瘤组织进行RNA-Seq检测及GSEA分析。检测内容包括:炎症信号,粒细胞活性,粒细胞免疫信号。（2）取放疗后第7天的肿瘤组织,通过流式细胞术检测肿瘤内免疫细胞亚群变化。检测内容包括:CD45阳性淋巴细胞,DC细胞,NK细胞,嗜酸性粒细胞,CD4+T细胞,CD8+T细胞,单核细胞,中性粒细胞,Ly6Chi细胞。（3）建立小鼠B16-F10黑色素瘤双侧荷瘤模型,一侧肿瘤接受局部20Gy放疗,另一侧不做处理。之后将CFSE标记的活化的嗜酸性粒细胞回输到受辐射小鼠体内,48小时后取肿瘤组织,进行流式细胞术检测双侧肿瘤中CFSE阳性嗜酸性粒细胞。（4）利用Transwell方法检测经放射的肿瘤组织对嗜酸性粒细胞的趋化作用。（5）PCR检测经放射肿瘤组织中与嗜酸性粒细胞趋化和生存相关分子的mRNA表达水平。2.细胞毒性T淋巴细胞的招募与嗜酸性粒细胞的浸润密切相关。（1）在B16-F10黑色素瘤动物模型中,对肿瘤进行局部放疗（20Gy）或不处理,PCR检测两组肿瘤组织中与T细胞趋化和功能相关的因子的mRNA表达水平。流式细胞术检测小鼠肿瘤组织中嗜酸性粒细胞与CD8+T细胞的相关性。（2）建立4T1乳腺癌动物模型,流式细胞术检测小鼠肿瘤组织中嗜酸性粒细胞与CD8+T细胞的比例。PCR检测经放射肿瘤组织中分别与T细胞的趋化和功能,嗜酸性粒细胞的趋化和生存相关分子的mRNA表达水平。（3）建立MC38结肠癌动物模型,流式细胞术检测小鼠肿瘤组织中嗜酸性粒细胞与CD8+T细胞的比例。PCR检测经放射肿瘤组织中分别与T细胞的趋化和功能,嗜酸性粒细胞的趋化和生存相关分子的mRNA表达水平。3.嗜酸性粒细胞变化可作为放疗患者的独立预后因素。（1）统计嗜酸性淋巴肉芽肿患者外周血中嗜酸性粒细胞数量,免疫组化检测手术标本中嗜酸性粒细胞的数量,分析外周血与组织浸润嗜酸性粒细胞数量的一致性。（2）收集整理既往接受过放疗的非小细胞肺癌患者（NSCLC）234例,统计患者放疗前后外周血中嗜酸性粒细胞的数量变化,并将外周血中嗜酸性粒细胞的升高与患者的无进展生存期（PFS）作相关分析。（3）收集整理既往接受过放疗的鼻咽癌患者（NPC）249例。统计患者放疗前后外周血中嗜酸性粒细胞的数量变化,并将外周血中嗜酸性粒细胞的升高与患者的无进展生存期（PFS）作分析。4.嗜酸性粒细胞在CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫过程中至关重要。（1）采用anti-Siglec-F抗体清除荷瘤小鼠体内的嗜酸性粒细胞,流式细胞术检测清除效果。（2）流式细胞术检测嗜酸性粒细胞清除小鼠体内的CD8+T细胞及效应性CD8+T细胞的比例,并与嗜酸性粒细胞做相关性分析。（3）PCR检测嗜酸性粒细胞清除小鼠体内小鼠肿瘤组织IFN-gamma相关的mRNA信号。（4）嗜酸性粒细胞清除后测量小鼠的肿瘤体积变化情况。5.嗜酸性粒细胞浸润可促进过继免疫治疗的疗效。（1）利用B16-F10黑色素瘤双侧荷瘤模型,通过尾静脉回输Pmel活化的CD8+T细胞,流式细胞术检测双侧肿瘤中Pmel阳性CD8+T浸润情况。（2）建立NPG小鼠双侧荷瘤模型,尾静脉回输CAR-T细胞,流式细胞术检测双侧肿瘤中CAR-T浸润情况。6.放疗可使接受CAR-T治疗的患者受益更多。（1）监测入组临床试验的患者疾病进展。（2）整理患者血常规信息。（3）肿瘤局部穿刺样本检测。结果:1.放疗可促进肿瘤微环境中嗜酸性粒细胞的浸润。（1）RNA-Seq结果提示,放疗后肿瘤组织内活性氧通路、I型干扰素信号、γ干扰素信号及炎症反应信号通路明显增强。其中,关于粒细胞趋化、迁移及活化的基因富集程度明显升高。（2）放疗后肿瘤浸润多种免疫细胞比例增多,其中CD8+T细胞及嗜酸性粒细胞增加明显。（3）双侧荷瘤模型中,与未处理侧肿瘤相比,经放射侧肿瘤内CFSE阳性嗜酸性粒细胞浸润明显增加。（4）体外实验发现,与对照组相比,放射处理的肿瘤组织招募嗜酸性粒细胞的能力更强。（5）PCR检测发现放疗后嗜酸性粒细胞趋化和生存相关的因子表达明显升高。2.嗜酸性粒细胞的浸润与细胞毒性T淋巴细胞的招募密切相关。（1）PCR检测发现,放疗后肿瘤组织中与T细胞趋化和功能相关分子的mRNA表达明显增高。流式细胞术检测发现小鼠肿瘤组织中嗜酸性粒细胞的比例与CD8+T细胞及效应CD8+T细胞的比例均高度相关。（2）在4T1乳腺癌动物模型中,流式细胞术检测也发现放疗后肿瘤组织内浸润的CD45阳性免疫细胞,嗜酸性粒细胞,CD8+T细胞的比例都明显升高,且嗜酸性粒细胞的比例与CD8+T细胞的比例高度相关。PCR检测发现,放疗后肿瘤组织中T细胞及嗜酸性粒细胞的趋化和功能相关分子的表达均明显升高。（3）在MC38结肠癌动物模型中,流式细胞术检测也同样发现放疗后肿瘤组织内浸润的CD45阳性免疫细胞,嗜酸性粒细胞,CD8+T细胞的比例都明显升高,且嗜酸性粒细胞的比例与CD8+T细胞的比例高度相关。PCR检测发现,放疗后肿瘤组织中T细胞及嗜酸性粒细胞的趋化和功能相关分子的表达均明显升高。3.嗜酸性粒细胞变化可作为放疗患者的独立预后因素。（1）非小细胞肺癌患者中,外周血中的嗜酸性粒细胞数量与肺癌组织免疫组化染色计数高度相关,提示外周血中嗜酸性粒细胞的数量可用来预测肿瘤组织中嗜酸性粒细胞的浸润程度。（2）非小细胞肺癌患者中,放疗后外周血中嗜酸性粒细胞的数量明显升高,且升高倍数为1.67倍或者2倍以上的患者无进展生存期更长。（3）在鼻咽癌患者中,放疗后外周血中嗜酸性粒细胞的数量也明显升高,且升高倍数为2倍或者2.20倍以上的患者无进展生存期更长。4.嗜酸性粒细胞在CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫过程中至关重要。（1）流式细胞术检测证明anti-Siglec-F抗体有效的清除了小鼠体内的嗜酸性粒细胞。（2）嗜酸性粒细胞清除后,肿瘤浸润CD8+T细胞及效应性CD8+T细胞的比例都明显降低,且与嗜酸性粒细胞的比例高度相关。（3）PCR检测发现嗜酸性粒细胞清除后,肿瘤组织IFN-gamma相关的mRNA表达明显降低。（4）嗜酸性粒细胞清除削弱了放疗对小鼠肿瘤生长的控制。5.嗜酸性粒细胞可促进过继免疫治疗的疗效。（1）B16-F10黑色素瘤双侧荷瘤模型中,与对照侧相比,放疗侧肿瘤内浸润的Pmel CD8+T细胞的比例和数量明显增多。（2）Raji淋巴瘤NPG小鼠双侧荷瘤模型中,与对照侧相比,放疗侧肿瘤内浸润的CAR-T细胞明显增多,且CAR-T细胞与嗜酸性粒细胞的浸润密切相关。6.放疗可使接受CAR-T治疗的患者受益更多。（1）一例恶性淋巴瘤患者中,放疗联合CAR-T回输治疗延缓肿瘤复发。（2）放疗后该患者外周血中嗜酸性粒细胞的数量明显升高。（3）PCR检测肿瘤穿刺样本发现,放疗侧肿瘤内CAR-T细胞浸润明显高于非放疗侧。结论:放疗促进肿瘤微环境中嗜酸性粒细胞的浸润。细胞毒性T淋巴细胞的招募与嗜酸性粒细胞的浸润密切相关。嗜酸性粒细胞变化可作为放疗患者的独立预后因素。嗜酸性粒细胞在CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫过程中至关重要。放疗可促进过继免疫治疗的疗效。放疗可增强恶性淋巴瘤患者CAR-T细胞免疫治疗的疗效。第二部分:肿瘤局部的突变多样性引起了免疫的异质性背景:肿瘤是一种遗传性疾病,肿瘤细胞的生长是由激活致癌因子的突变引发的。这一过程也涉及到遗传性或非遗传性促癌基因的激活或抑癌基因的失活。在多种癌症中,肿瘤的发生伴随着突变的积累,突变的积累可以通过增加肿瘤细胞的遗传多样性程度,加速肿瘤细胞的进化适应性,从而为肿瘤细胞群提供选择性优势。然而,这种遗传多样性是有代价的:肿瘤细胞相较于正常细胞分化程度越高,越容易被免疫系统识别为异体细胞。虽然长期以来人们一直认同这种可能性的存在,但直到最近几年才证实肿瘤的总突变负荷（TMB）有助于癌症的免疫识别,而且它可能在一定程度上决定个体对抗肿瘤免疫治疗的反应。结合全外显子组测序、转录组分析和T细胞库分析,我们选取了15例非小细胞肺癌（NSCLC）患者手术切除肿块的多位点组织进行空间特征分析。结果表明肿瘤组织的免疫微环境具有高度的空间异质性,瘤内区域差异与个体间差异一样大。虽然局部总突变量与局部T细胞克隆扩增有关,但局部抗肿瘤细胞毒性与新抗原丰度没有直接关系。综上所述,这些发现提醒我们,免疫学特征不应该仅通过TMB或单位点活检的微环境分析来预测。方法:我们招募了15名新诊断的非小细胞肺癌患者,对于每个从原发肿瘤肿块中采集的多个活检样本,我们进行了多种基因组和免疫原性的基因组分析,包括全外显子组测序（WES）、转录组分析（RNA-seq）和T细胞库测序。为了进一步提高肿瘤免疫微环境评估的准确性,我们开发了一种机器学习方法,将多维免疫相关变量集成起来进行数据挖掘。通过使用一种随机森林算法,输入278个变量将肿瘤位点的免疫微环境分类为“热”肿瘤区域和“冷”肿瘤区域。结果:1.突变负荷与T细胞扩增相关2.突变负荷与细胞毒性不相关3.肿瘤微环境存在空间异质性4.突变异质性与免疫异质性相关结论:瘤内区域间的免疫微环境存在高度的空间异质性,需要综合全面地评价TME免疫表型。
李芳[9]（2019）在《胭脂鱼运动型气单胞菌败血症及弯口吸虫病初步研究》文中研究说明随着高密度水产养殖的发展,鱼类疾病已经成为制约该行业发展的重要因素。淡水鱼类运动型气单胞菌败血症（motile Aeromonas septicemia,MAS）与弯口吸虫病（Clinostomum disease）（又称黄蛆病,yellow grubs disease）,分别是典型的鱼类细菌性疾病和复殖吸虫病。胭脂鱼（Myxocyprinus asiaticus）为我国特有鱼类,属于二级保护动物,同时因其为亚口鱼科鱼类在亚洲的唯一分布,因此胭脂鱼兼具重要的经济价值和研究价值。近年来,上述两种疾病在胭脂鱼养殖过程中时常发生,给鱼苗培育和养殖生产造成了较大损失。本研究针对胭脂鱼养殖场频发的上述两种疾病展开病因学、病理学及免疫应答机制等内容的研究,以期为深入解析宿主对MAS的免疫应答机制和防控胭脂鱼MAS和弯口吸虫病提供新视角和参考资料。1、胭脂鱼运动型气单胞菌败血症初步研究为鉴定某养殖基地患运动型气单胞菌败血症的胭脂鱼幼鱼病原菌,利用传统病原菌分离方法,从患病胭脂鱼内脏和腹水中分离致病菌,采用形态学观察、生理生化特性分析、16S rRNA和cpn60、rpoB、gyrB基因序列分析并构建系统发育树的方法进行细菌种类鉴定,通过回感实验、半致死量（LD50）实验和16个毒力基因检测确定菌株致病性,同时开展32种药物敏感性试验;为获得胭脂鱼运动型气单胞菌败血症病理材料,对筛选出的健康胭脂鱼幼鱼进行腹腔注射200μL2.0×108 cfu/mL(LD50-24h)的嗜水气单胞菌菌液,于感染后第4、12、24 h取中肾、头肾、脾脏和肝脏用于组织结构观察,第24 h取中肾、头肾、脾脏和肝脏用于超微结构观察,结合半定量描述方法对不同时间点各组织损伤程度进行评价,以黑色素巨噬细胞中心（melano-macrophage center,MMC）为参考指标,采用定量分析方法描述各组织中MMC响应策略,以评价组织免疫反应水平;为探究诸多病理现象背后的分子机制,对致病菌感染前、后（第4 h）的胭脂鱼脾脏进行转录组分析,使用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测19个免疫相关基因在感染后第4、12和24 h的表达情况。主要研究结果及结论如下:（1）从自然发病胭脂鱼幼鱼内脏团和腹水中分离到两株优势菌,经生理生化特征和分子标记鉴定,证实两个菌株分别为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）（命名为BBAh1）和维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）（命名为BBAv1）。（2）回感实验证实分离到的嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌均为胭脂鱼MAS致病菌,两个菌株中分别检测到7个毒力基因（aerA、alt、ascV、hlyA、lip、ompA和aspA）和8个毒力基因（aerA、alt、ascV、hlyA、lip、aexT、ast和flaA）,二者对胭脂鱼幼鱼的7天半致死量(LD50-7d)分别为1.93×105 cfu/g和8.77×105 cfu/g;且嗜水气单胞菌致死性更强,维氏气单胞菌致肠炎比例更高。（3）对32种药物的敏感性实验结果表明,两个菌株药敏特征相似,对28种药物显示出相似的敏感性,这可能与两个菌株来源于同一环境有关;建议使用两个菌株都十分敏感的头孢噻肟、氨曲南、头孢曲松和头孢呋辛等药物来治疗胭脂鱼运动型气单胞菌败血症。（4）MAS的组织显微结构病理特征表现为:内皮细胞损伤、溶血、血液凝集、MMC响应、组织坏死、淋巴细胞浸润、粒细胞胞质嗜酸性增强、肝细胞空泡化、凝固样坏死和胞质嗜酸性变性以及红细胞萎缩变性等;超微结构病理特征表现为:肾小球毛细血管塌陷,系膜细胞肿胀,足细胞增生,滤过装置遭到严重破坏;巨噬细胞功能活跃,表现为大量吞噬各类损伤细胞,包含淋巴细胞和嗜酸性粒细胞;肝脏狄氏间隙遭到严重破坏,肝细胞中糖原消失,线粒体外嗜肿胀,自噬溶酶体增多。上述现象说明:胭脂鱼MAS导致组织发生严重的病理变化,进而导致机体造血、排泄和代谢等功能障碍,是细菌感染致病和致死的主要原因。（5）MAS发展进程中组织MMC响应策略:中肾、头肾和脾脏MMC响应策略基本一致,表现为单个MMC面积越来越大,数量越来越多,相对组织面积越来越大;肝脏MMC响应策略与上述组织存在差别,即感染后12 h内,肝脏中MMC各指标基本无变化,至感染后第24 h,组织中MMC数量和相对组织面积才显着增加（P<0.05）。（6）组织MMC响应策略反映出组织器官免疫应答策略,即脾脏在细菌感染引发的免疫应答中占据主导地位,其次为头肾、中肾,肝脏免疫反应能力最弱;另外,由于脾脏MMC响应最为敏感,因此其更适宜用作评价机体生理状态或免疫水平的生物指标。（7）嗜水气单胞菌急性感染后第4 h,胭脂鱼脾脏共获得1390个显着差异表达基因（q<0.05）,其中907个表达显着上调,483个表达显着下调;随机抽取8个差异表达基因进行qRT-PCR验证,发现qRT-PCR结果与转录组结果表达趋势基本一致,进而证明了转录组数据的可靠性。（8）1390个差异表达基因显着富集于16个二级GO类别,主要为白介素1受体绑定（GO:0005149）、白介素1受体复合物（GO:0045323）、细胞因子受体绑定（GO:0005126）、炎症反应（GO:0006954）、生长因子受体绑定（GO:0070851）和免疫反应（GO:0006955）等;15条KEGG信号通路,主要包含:NF-kB信号通路（ko04064）、TNF信号通路（ko04668）、NOD样受体信号通路（ko04621）、Toll样受体信号通路（ko04620）和炎性肠炎疾病IBD（ko05321）等;上述GO类别和信号通路均与机体免疫反应相关。（9）qRT-PCR检测结果显示:模式识别受体（TLR2、TLR4、TLR6和PGRP5）、白介素（IL1B、IL6、IL8、IL10、IL11和IL12）、趋化因子（CXCL1、CXCL2和CXCL8）、免疫细胞活性调节分子（CD68、CD200、CD247、CSF3和CSF3R）及补体（C6和C7）等诸多免疫相关分子均积极参与到机体抗菌活动中。（10）据转录组和qRT-PCR结果推测胭脂鱼对嗜水气单胞菌感染的免疫应答机制可能如下:病原菌进入机体后,其病原体相关分子模式（PAMP）便被模式识别受体（如TLRs和PGRP5）所识别,接着收到信号的受体细胞开始分泌细胞因子,如IL1和TNF等,这些细胞因子进而激活MAPK信号通路,而MAPK信号通路的激活将直接启动其下游的NF-kB信号通路应答,活化的NF-kB进入核内与靶基因上游特定序列结合从而起始转录,至此机体开始启动强烈的免疫反应来抵御病原菌的进一步感染,组织学层面可见免疫细胞大量增殖,吞噬作用活跃,MMC响应强烈,炎性细胞浸润组织等,但与此同时,MAPK和NF-kB信号通路似乎还启动了负调节机制来避免机体炎症反应过度。2、胭脂鱼弯口吸虫病初步研究本研究从自然发病的人工池塘中随机抽取148尾胭脂鱼幼鱼进行编号和生长指标（全长、体长和体质量）测量;随后通过解剖从鱼体组织中剥离寄生虫包囊,并记录包囊寄生部位和数量用于计算感染率、感染强度、局部感染率和局部感染强度;使用解剖针分离出包囊中的囊蚴并将其保存于70%酒精,后采用形态学（制作囊蚴标本）结合分子生物学方法（CO1和ITS）鉴定囊蚴种类;针对复殖吸虫生活史中第一中间宿主淡水螺类和终末宿主食鱼鸟类,在发病胭脂鱼养殖场进行寄生虫生活史调查。主要研究结果及结论如下:（1）囊蚴形态学和分子标记鉴定结果证实本研究分离到的寄生虫为扁弯口吸虫（Clinostomum complanatum）。这是胭脂鱼乃至亚口鱼科鱼类作为扁弯口吸虫中间宿主的首次记录,且证实囊蚴生殖系统形态特征是鉴别此类寄生虫的可靠形态学依据,CO1（6.87%）较ITS（1.68%）变异位点率更高,鉴别弯口吸虫的效率也更高。（2）抽查样本中共有96尾胭脂鱼受到扁弯口吸虫感染,感染率为64.9%,感染强度为1-7（2.3±1.38）个囊蚴/尾;较躯干部和尾部而言,囊蚴在胭脂鱼头部分布较多,相应的局部感染率和局部感染强度分别为0.557和0.545。（3）感染组与未感染组胭脂鱼在全长和体长上均无显着差异（P>0.05）,就体质量和肥满度而言,感染组（体质量=6.44±0.19 g;肥满度=1.70±0.03 g/cm3）则显着低于未感染组（体质量=10.36±0.51 g;肥满度=2.51±0.03 g/cm3）（P<0.01）。（4）扁弯口吸虫在发病渔场生活史完整:以椭圆萝卜螺（Radix swinhoei）和小土蜗（Galba pervia）为第一中间宿主,胭脂鱼幼鱼为第二中间宿主,食鱼鸟类白鹭（Egretta garzetta）、池鹭（Ardeola bacchus）和普通翠鸟（Alcedo bengalensis）为终末宿主。（5）防治建议:1)年终彻底清塘并用生石灰杀灭螺类,清除池塘引水渠中大量繁殖的宿主螺类;2)在鱼苗、鱼种培育池上方设置防鸟网。综上研究,首次在患运动型气单胞菌败血症的胭脂鱼中同时分离到具有强烈致病性的嗜水气单胞菌和维氏气单胞菌,并根据药敏实验结果筛选出适于治疗胭脂鱼运动型气单胞菌败血症的药物;通过对嗜水气单胞菌急性感染前后胭脂鱼幼鱼肾、脾和肝脏显微和超微结构变化的观察,发现一系列未见报道的运动型气单胞菌败血症的病理现象,以及组织中黑色素巨噬细胞中心应答情况;通过嗜水气单胞菌刺激胭脂鱼脾脏的转录组分析,以及qRT-PCR对免疫相关基因在感染前后的表达量检测,发现以TLRs和PGRP5为代表的PRRs在早期病原识别中发挥着重要作用,此步骤是激活其下游信号通路、产生免疫应答的关键。本研究还发现胭脂鱼乃至亚口鱼科鱼类为扁弯口吸虫的中间宿主;弄清楚了扁弯口吸虫在发病渔场的完整生活史过程;提出了清塘杀螺、防鸟等防控措施。研究结果丰富了鱼类病害研究内容,为生产实践上防控胭脂鱼此类疾病亦有重要的指导作用。
吴劲松[10]（2019）在《看不见的战争:癌细胞与免疫细胞——2018年诺贝尔生理学或医学奖解读》文中研究指明对2018年诺贝尔生理学或医学奖"利用抑制免疫负调控疗法治疗癌症"的研究进行解读,阐明抑制免疫负调节机制,并联系高中生物学知识为高中教学与命题提供参考。
二、T细胞活化的负调节机制（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、T细胞活化的负调节机制（论文提纲范文）
（1）猪瘟病毒C株及其非结构蛋白对猪肺泡巨噬细胞Toll样受体介导的天然免疫应答的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩略词中英文对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 Toll样受体介导的天然免疫与猪瘟病毒研究进展 |
| 1.1 天然免疫概述 |
| 1.2 Toll样受体与天然免疫 |
| 1.2.1 TLRs的结构及其功能 |
| 1.2.2 TLRs的生物合成及转运机制 |
| 1.2.3 TLRs介导的抗病毒天然免疫信号通路 |
| 1.2.4 TLRs信号通路负调节机制 |
| 1.3 猪瘟病毒研究进展 |
| 1.3.1 猪瘟病毒概述 |
| 1.3.2 猪瘟病毒结构蛋白的生物学特性及功能 |
| 1.3.3 猪瘟病毒非结构蛋白的生物学特性及功能 |
| 1.4 猪瘟病毒与天然免疫 |
| 1.4.1 宿主对CSFV感染的抗病毒天然免疫反应 |
| 1.4.2 CSFV对抗病毒天然免疫反应的干扰 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 猪瘟病毒C株对Toll样受体介导的天然免疫应答的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒、细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养、消化及铺板 |
| 2.2.2 病毒感染细胞 |
| 2.2.3 细胞总RNA 的提取及cDNA 的合成 |
| 2.2.4 实时荧光定量PCR |
| 2.2.5 病毒复制曲线的绘制 |
| 2.2.6 Western blot检测目的基因的表达 |
| 2.2.7 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 CSFV C株的复制曲线 |
| 2.3.2 CSFV C株感染后对TLR2、TLR3、TLR4和TLR7 表达的影响 |
| 2.3.3 CSFV C株感染后对TLRs信号通路关键蛋白表达的影响 |
| 2.3.4 CSFV C株感染后对TLRs信号通路下游免疫效应分子表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 猪瘟病毒C株非结构蛋白对TLR2、TLR3、TLR4和TLR7 介导的天然免疫应答的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 细胞、菌株及质粒 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 CSFV C株非结构蛋白慢病毒载体的构建 |
| 3.2.2 过表达CSFV C株非结构蛋白慢病毒的包装 |
| 3.2.3 慢病毒滴度的测定 |
| 3.2.4 过表达CSFV C株非结构蛋白慢病毒细胞系的构建及鉴定 |
| 3.2.5 实时荧光定量PCR |
| 3.2.6 Western blot检测相关基因的蛋白表达 |
| 3.2.7 ELISA检测细胞因子的表达 |
| 3.2.8 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 过表达CSFV C株非结构蛋白慢病毒载体的构建 |
| 3.3.2 CSFV C株非结构蛋白慢病毒的包装及病毒滴度的测定 |
| 3.3.3 过表达CSFV C株非结构蛋白细胞系的建立及鉴定 |
| 3.3.4 CSFV C株非结构蛋白对TLR2、TLR3、TLR4和TLR7 表达的影响 |
| 3.3.5 CSFV C株非结构蛋白对TLRs信号通路关键蛋白的影响 |
| 3.3.6 CSFV C株非结构蛋白对TLRs信号通路下游免疫效应分子的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 本文的创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）基于脊柱结核病灶Tollip与TLR4表达水平及其相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英汉缩略词对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学 |
| 2 结果 |
| 2.1 STB患者与非结核组的年龄、性别比较 |
| 2.2 WB检测结果 |
| 2.3 RT-qPCR检测结果 |
| 2.4 IHC结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 STB与 Tollip |
| 3.2 STB与 TLR4 |
| 3.3 STB TLR4 与 Tollip 表达水平的相关性 |
| 不足与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 结核病的 TLR4 信号传导通路及 Tollip 调节机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文及获得的科研成果 |
（3）miR-150与白藜芦醇在痛风炎症中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英汉缩略语名词对照 |
| 前言 |
| 第一部分 miR-150在痛风患者外周血单个核细胞中的变化特点 |
| 1.材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3.讨论 |
| 4.小结 |
| 第二部分 miR-150及其靶基因和相关分子的变化特点 |
| 1 材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 mi R-150对MSU刺激THP-1 巨噬细胞炎症的影响及机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四部分 白藜芦醇通过影响SOCS1的表达调控痛风炎症反应 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 全文附图 |
| 综述 两个世界的相互联系:microRNA和NLRP3炎性体 |
| Reference |
| 致谢 |
| 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（4）过敏性紫癜患儿血清可溶性CTLA-4的水平变化及意义探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 对象与方法 |
| 1.1 主要器材 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 研究对象 |
| 1.4 标本的采集及保存 |
| 1.5 sCTLA-4的测定 |
| 1.5.1 检测前准备 |
| 1.5.2 操作步骤 |
| 1.5.3 结果及判断 |
| 1.6 免疫球蛋白的测定 |
| 1.7 统计学分析及处理 |
| 第二章 结果 |
| 2.1 HSP患儿急性期血清s CTLA-4 表达水平变化 |
| 2.2 有/无前驱感染HSP患儿间血清s CTLA-4 表达水平比较 |
| 2.3 有/无肾损害HSP患儿间血清s CTLA-4 表达水平比较 |
| 2.4 有/无消化道症状HSP患儿血清s CTLA-4 表达水平比较 |
| 2.5 HSP患儿血清s CTLA-4 水平与血清免疫球蛋白水平变化的相关性 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（5）EGFR-TKIs及血根碱在NSCLC中调节MHC-Ⅰ的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 EGFR突变的NSCLC的药物治疗现状 |
| 一、EGFR信号通路与EGFR-TKIs作用机制 |
| 二、EGFR突变受体酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)的分子靶向治疗 |
| 三、NSCLC的抗PD-1/PD-L1免疫治疗 |
| 第二节 MHC-Ⅰ分子在细胞免疫中的重要作用和EGFR下游的PI3K/AKT/MTOR信号通路及其对抗原处理和提呈系统的影响 |
| 一、MHC-Ⅰ及抗原加工与提呈系统 |
| 二、PI3K/AKT/mTOR信号通路及其在癌生物学中的功能 |
| 三、EGFR-TKIs耐药机制和现状 |
| 四、肿瘤微环境对免疫治疗的影响 |
| 五、抗PD-1/PD-L1免疫治疗的作用机制及耐药机制 |
| 六、PI3K/AKT/mTOR信号通路对抗原加工提呈系统的影响 |
| 第三节 中医对肿瘤的认识及血根碱抗肿瘤作用研究现状 |
| 一、中医对肿瘤的认识 |
| 二、血根碱抗肿瘤作用研究现状 |
| 第四节 本课题研究的科学假说 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 NSCLC组织标本免疫组化实验 |
| 一、实验目的、材料与方法 |
| 二、标本来源与实验步骤 |
| 三、统计方法与图形处理 |
| 四、实验结果 |
| 五、小结 |
| 第二节 细胞系与分子模拟实验(材料与方法) |
| 一、细胞培养 |
| 二、蛋白免疫印迹实验 |
| 三、流式细胞仪检测细胞表面HLA-ABC、PD-L1蛋白表达 |
| 四、免疫荧光(直接法和间接法结合应用) |
| 五、实时荧光定量聚合酶链式反应实验Quantitative Real-Time PCR(qRT-PCR) |
| 六、AutoDock软件分子模拟实验 |
| 第三节 EGFR-TKIs调节MHC-Ⅰ的作用与机制 |
| 一、EGFR配体激活或者突变激活都降低细胞膜上MHC-Ⅰ分子表达 |
| 二、EGFR-TKIs抑制EGFR激活增加细胞膜表面MHC-Ⅰ分子表达 |
| 三、EGFR-TKIs和AKT/mTOR抑制剂均增加肿瘤细胞系细胞膜表面MHC-Ⅰ |
| 四、EGFR激活突变减少抗原加工提呈系统基因表达 |
| 五、阿法替尼/MK2206/MG-132增加抗原加工提呈系统基因表达 |
| 六、EGFR通过下游AKT/mTOR调控STAT1/STAT3活化并影响PSMB8/9表达 |
| 七、小结 |
| 第四节 血根碱调节MHC-Ⅰ的作用与机制 |
| 一、分子模拟表明血根碱与T790M突变的EGFR有较高的亲和力 |
| 二、Autodock分子模拟显示血根碱与AKT有较高的亲和力 |
| 三、血根碱抑制NCI-H1975中T790M突变的EGFR和AKT的磷酸化活化并上调MHC-Ⅰ分子 |
| 四、血根碱增加EGFR突变的NSCLC细胞株的MHC-Ⅰ膜表达 |
| 五、血根碱通过抑制EGFR-AKT-mTOR信号通路调控MHC-Ⅰ表达 |
| 六、小结 |
| 第三章 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（6）刺络拔罐法对内毒素致热家兔的退热作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 实验一 刺络拔罐法对内毒素致热家兔血清细胞因子水平的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验二 刺络拔罐法对内毒素致热家兔下丘脑组织iNOS、COX-1、COX-2 蛋白表达水平的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（7）成纤维细胞与T细胞的相互作用及机制研究（论文提纲范文）
| 本文主要缩略词语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 实验材料 |
| 2.1 主要实验试剂信息表 |
| 2.2 主要实验仪器信息表 |
| 2.3 主要实验耗材信息表 |
| 2.4 实验动物 |
| 2.5 主要溶液配制 |
| 第三章 实验方法 |
| 3.1 小鼠原代细胞培养 |
| 3.1.1 小鼠组织器官分离备用 |
| 3.1.2 小鼠原代成纤维细胞培养与传代 |
| 3.1.3 小鼠T细胞原代细胞分选与培养 |
| 3.1.4 小鼠原代树突状细胞的分离与培养 |
| 3.2 蛋白质免疫印迹 |
| 3.2.1 蛋白样品制备 |
| 3.2.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 3.2.3 蛋白质免疫印迹方法与步骤 |
| 3.3 实时荧光定量PCR |
| 3.3.1 细胞总RNA样本提取 |
| 3.3.2 RNA逆转录为cDNA |
| 3.3.3 实时荧光定量PCR方法与步骤 |
| 3.4 酶联免疫吸附试验 |
| 3.4.1 试剂及材料准备 |
| 3.4.2 酶联免疫吸附试验方法与步骤 |
| 3.5 流式细胞术 |
| 3.5.1 上机前准备 |
| 3.5.3 上机步骤 |
| 3.6 实验数据统计分析 |
| 第四章 结果 |
| 第一部分: 成纤维细胞对T细胞的影响 |
| 4.1.1 成纤维细胞抑制T细胞活化和增殖 |
| 4.1.2 成纤维细胞影响T细胞分化 |
| 第二部分: T细胞对成纤维细胞的影响及机制研究 |
| 4.2.1 T细胞影响成纤维细胞膜分子表达和活化状态 |
| 4.2.2 T细胞促进成纤维细胞表达PD-L1分子 |
| 4.2.3 T细胞分泌的细胞因子IFN-γ促进成纤维细胞高表达PD-L1分子 |
| 第五章 讨论 |
| 第六章 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间发表论文 |
（8）放疗诱导嗜酸性粒细胞增多促进肿瘤内CD8+T细胞浸润的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一部分 :放疗诱导嗜酸性粒细胞增多促进肿瘤内CD8~+T细胞浸润的作用及机制研究 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 放疗促进肿瘤微环境中嗜酸性粒细胞的浸润 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果及分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 嗜酸性粒细胞浸润与细胞毒性T淋巴细胞的招募密切相关 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果及分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 嗜酸性粒细胞变化可作为放疗患者的独立预后因素 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果及分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 嗜酸性粒细胞在CD8~+T 细胞介导的抗肿瘤免疫过程中至关重要 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果及分析 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 嗜酸性粒细胞可促进过继免疫治疗的疗效 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.3 结果及分析 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 放疗可使CAR-T治疗患者受益更多 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料与方法 |
| 7.3 结果及分析 |
| 7.4 讨论 |
| 第二部分 :肿瘤局部的突变多样性引起了免疫的异质性 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果及分析 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 放疗对肿瘤微环境的影响研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表及撰写的文章 |
| 致谢 |
（9）胭脂鱼运动型气单胞菌败血症及弯口吸虫病初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 鱼类运动型气单胞菌败血症研究进展 |
| 1.1.1 运动型气单胞菌简介 |
| 1.1.2 病原菌鉴定方法 |
| 1.1.3 运动型气单胞菌败血症的病症及危害 |
| 1.1.4 运动型气单胞菌的致病基础与感染途径 |
| 1.1.5 转录组研究鱼类运动型气单胞菌败血症 |
| 1.1.6 运动型气单胞菌败血症的防治措施 |
| 1.2 鱼类弯口吸虫病研究进展 |
| 1.2.1 弯口吸虫简介 |
| 1.2.2 弯口吸虫病的病症及危害 |
| 1.2.3 弯口吸虫与宿主互作研究 |
| 1.2.4 弯口吸虫病流行病学研究 |
| 1.2.5 弯口吸虫病的防治方法 |
| 1.3 本研究目的与意义 |
| 第2章 胭脂鱼运动型气单胞菌败血症病原菌分离鉴定及防治药物筛选 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验鱼来源 |
| 2.1.2 病原菌分离与鉴定 |
| 2.1.3 人工感染实验 |
| 2.1.4 病原菌毒力因子鉴定 |
| 2.1.5 药敏实验 |
| 2.1.6 数据处理与分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 患病胭脂鱼病症描述 |
| 2.2.2 病原菌生理生化和分子标记鉴定结果 |
| 2.2.3 病原菌回感实验结果 |
| 2.2.4 病原菌毒力因子鉴定结果 |
| 2.2.5 药敏实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 生理生化和分子生物学方法鉴定病原菌 |
| 2.3.2 毒力因子分布与气单胞菌致病性的关系 |
| 2.3.3 气单胞菌的耐药性问题 |
| 2.3.4 胭脂鱼运动型气单胞菌败血症的防治措施 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 胭脂鱼运动型气单胞菌败血症的病理特征 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细菌感染实验 |
| 3.1.2 显微结构观察样本处理 |
| 3.1.3 超微结构观察样本处理 |
| 3.1.4 组织病理特征定量与半定量描述 |
| 3.1.5 数据统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 病理特征的定量与半定量描述 |
| 3.2.2 MAS对肾、脾和肝脏组织结构的影响 |
| 3.2.3 MAS对肾、脾和肝脏超微结构的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 MAS诸多病理现象背后的意义 |
| 3.3.2 MAS进程中组织MMC响应策略 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 胭脂鱼对运动型气单胞菌败血症的免疫应答机制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细菌感染和取材 |
| 4.1.2 感染前后脾脏总RNA提取 |
| 4.1.3 RNA质检、cDNA建库和测序 |
| 4.1.4 实验数据处理 |
| 4.1.5 差异表达基因及其功能通路分析 |
| 4.1.6 实时荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 4.1.7 数据统计分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 RNA-seq分析和de novo组装 |
| 4.2.2 基因功能注释 |
| 4.2.3 Unigene功能注释和代谢通路分析 |
| 4.2.4 差异表达基因鉴定和注释 |
| 4.2.5 差异表达基因的GO富集分析 |
| 4.2.6 差异表达基因的代谢通路分析 |
| 4.2.7 实时荧光定量PCR验证差异表达基因 |
| 4.2.8 MAS引起大量免疫相关基因表达显着上调 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 胭脂鱼脾脏的免疫功能 |
| 4.3.2 MAS激活信号转导通路 |
| 4.3.3 MAS导致机体产生强烈的免疫反应 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 胭脂鱼弯口吸虫病病原、病症及病因初步研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验鱼来源 |
| 5.1.2 寄生虫分离与鉴定 |
| 5.1.3 感染状况分析 |
| 5.1.4 病因调查分析 |
| 5.1.5 数据处理与分析 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 囊蚴形态特征 |
| 5.2.2 囊蚴分子标记CO1和ITS序列分析及系统发育树构建 |
| 5.2.3 囊蚴在胭脂鱼组织中的寄生部位与感染情况分析 |
| 5.2.4 囊蚴寄生对胭脂鱼生长指标的影响 |
| 5.2.5 弯口吸虫生活史调查结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 胭脂鱼是扁弯口吸虫的又一中间宿主 |
| 5.3.2 扁弯口吸虫寄生对胭脂鱼生长存在明显不利影响 |
| 5.3.3 如何有效防治胭脂鱼的弯口吸虫病 |
| 5.4 小结 |
| 结论与展望 |
| 本研究的主要创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表论文情况 |
| 在读期间主持及参与项目情况 |
四、T细胞活化的负调节机制（论文参考文献）
- [1]猪瘟病毒C株及其非结构蛋白对猪肺泡巨噬细胞Toll样受体介导的天然免疫应答的影响[D]. 宋梦昭. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [2]基于脊柱结核病灶Tollip与TLR4表达水平及其相关性研究[D]. 涂振阳. 右江民族医学院, 2021(01)
- [3]miR-150与白藜芦醇在痛风炎症中的作用机制研究[D]. 何泳龙. 成都中医药大学, 2020(02)
- [4]过敏性紫癜患儿血清可溶性CTLA-4的水平变化及意义探讨[D]. 董玉珍. 青岛大学, 2019(01)
- [5]EGFR-TKIs及血根碱在NSCLC中调节MHC-Ⅰ的作用与机制研究[D]. 郭坤彬. 广州中医药大学, 2019(08)
- [6]刺络拔罐法对内毒素致热家兔的退热作用机制研究[D]. 裴莹. 辽宁中医药大学, 2019(01)
- [7]成纤维细胞与T细胞的相互作用及机制研究[D]. 范桂花. 厦门大学, 2019(09)
- [8]放疗诱导嗜酸性粒细胞增多促进肿瘤内CD8+T细胞浸润的作用及机制研究[D]. 成佳楠. 中国人民解放军陆军军医大学, 2019(03)
- [9]胭脂鱼运动型气单胞菌败血症及弯口吸虫病初步研究[D]. 李芳. 西南大学, 2019(01)
- [10]看不见的战争:癌细胞与免疫细胞——2018年诺贝尔生理学或医学奖解读[J]. 吴劲松. 中学生物教学, 2019(Z1)