导读:本文包含了整合载体构建论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:纤维素酶,枯草芽孢杆菌,同源重组,酶活性分析
整合载体构建论文文献综述
聂利波[1]（2017）在《枯草芽孢杆菌纤维素酶基因整合载体的构建》一文中研究指出纤维素酶是一种常见的生物降解酶,能够破坏β-1,4葡萄糖甘键,将纤维素降解为葡萄糖。在畜牧养殖方面,畜禽体内微生物对纤维素的消化吸收效果很那达到养殖者的要求,但是纤维素降解后的产物对畜禽的身体发育却能够产生积极的效果。为了追求纤维素在畜禽生产中的高利用率,本试验构建一株能够降解纤维素的重组菌,对扩大饲料原料来源具有参考意义。本试验选取纤维素酶CelKg基因为目的基因,以野生型枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)LN基因组中M1、M2为同源片段,以启动子P43基因作为启动子构建整合载体,将其转入野生型B.subtilis LN中,以期获得能够高效表达纤维素酶的重组菌,并对其进行酶活性分析。主要研究如下:选择质粒pGEM-T Easy为载体,利用T4连接酶将纤维素酶Cel Kg基因、启动子P43基因和同源片段M1、M2连接在一起构建重组质粒pGEM-Kmpgmt,将其转化后,通过蓝白斑筛选、聚合酶链式反应(PCR)验证,双酶切验证挑选重组大肠杆菌Kpg。在野生型B.subtilis LN感受态细胞的制备过程中,分别添加体积比为1%、2%、3%、4%和5%的吐温-80、甲醇和丙酮,统计感受态细胞的复活菌数。将外源质粒pGEM-kmpgt通过化学转化的方式转入制备好的B.subtilis感受态细胞中,以P4326F/P4326R为引物,利用PCR验证转化结果,并计算转化效率。试验结果显示,在野生型B.subtilis LN感受态细胞的制备过程中添加4%的甲醇,所制备的感受态细胞复活数最多为546个/μL,经转化后最多可获得52个转化子/μg,转化效率最高。利用spizizen转化法,将重组质粒pGEM-Kmpgmt转入野生型B.subtilis LN感受态细胞,以双交换的形式将纤维素酶基因CelKg转移至野生型B.subtilis LN基因组中,通过PCR验证目的片段成功整合到野生型B.subtilis LN中,获得重组菌B.subtilis Kpg。刚果红染色结果显示重组菌对羧甲基纤维素钠有降解作用。通过对重组菌菌落和菌液的观察,符合B.subtilis菌落和菌液的形态特征。在1000×倍的显微镜下观察重组菌,菌体呈杆状,均有芽孢出现,和野生型B.subtilis LN形态相同。对重组菌B.subtilis Kpg的最适培养时间、其表达的纤维素酶的最佳反应温度和最佳反应环境进行分析,结果显示重组菌B.subtilis Kpg在37℃条件下摇瓶培养,生长至18 h时上清液中纤维素酶活力最大为55.22 U/mL,与野生型B.subtilis LN相比提高了115%。B.subtilis Kpg纤维素酶的最适反应温度为60℃,此时纤维素酶活性最大为108.45 U/mL,反应液pH值为6时,纤维素酶活性达到97.72 U/mL。将重组菌B.subtilis Kpg添加到麸皮中进行发酵,测定其表达的纤维素酶对纤维素的实际降解能力。研究结果发现重组菌B.subtilis Kpg能够显着降低麸皮中的纤维素含量,同时发现重组菌B.subtilis Kpg和野生型B.subtilis LN均能将无机氮转化为真蛋白,增加麸皮中的真蛋白量。通过对重组菌B.subtilis Kpg的酶学性质研究和对发酵麸皮含量的分析,初步确定了重组菌B.subtilis Kpg对纤维素的降解能力,以及在发酵麸皮的利用价值,为B.subtilis工程菌的构建和实际应用提供部分的理论支撑。(本文来源于《河南科技大学》期刊2017-05-01）
郭建军,龚小华,袁林,曾静,付锦楠[2]（2015）在《干酪乳杆菌同源整合载体的构建与鉴定》一文中研究指出构建乳酸菌同源重组载体,以实现外源基因在乳酸菌中的整合型表达。PCR扩增lacZ基因表达盒lacZ-cassette,和upp基因表达盒upp-cassette,SOE-PCR扩增lacZ-P-upp,产物回收后连接到pORI28载体中,构建载体pORZP;根据干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393全基因组中lai基因序列设计引物,PCR扩增lai基因两端同源重组臂lai-up和lai-down基因序列,产物经回收后,连接至pORZP载体中,得同源重组载体pORZPlai。双酶切及DNA测序结果证实,成功构建了同源重组载体pORZP-lai,为实现外源基因在乳酸菌中的非抗性、整合型表达奠定了基础。(本文来源于《江西科学》期刊2015年04期）
韩光杰,赵松,刘琴,李传明,徐健[3]（2015）在《PuGV-Ps增效蛋白质基因特征及其整合载体的构建》一文中研究指出为了明确增效蛋白质基因特性,获得重组增效苏云金杆菌,本试验通过生物信息学方法分析了转宿主东方粘虫颗粒体病毒(Pu GV-Ps)增效蛋白质基因(En)的特征及二级结构,利用In-fusion技术构建了整合载体。基于Pu GV-Ps增效蛋白质基因进化树显示,颗粒体病毒与多角体病毒为2个明显的分支,美洲粘虫颗粒体病毒(Pu GV)与转宿主东方粘虫颗粒体病毒的增效蛋白质基因遗传距离极小。6种颗粒体病毒增效蛋白质氨基酸序列比对结果显示,增效蛋白质N端相似性较高,均含有锌离子结构域(244位)与催化域(526~565位);增效蛋白质基因二级结构中α螺旋和无规则卷曲占整个片段的73%,且N端以不规则卷曲为主;利用改进的In-fusion技术构建整合载体,双酶切结果显示增效蛋白质基因连接方向正确,p LTV1-En构建成功;通过高温整合获得重组工程菌Bt71En。表明,Pu GV-Ps与Pu GV增效蛋白质基因同源性较高,其二级结构复杂,影响载体构建,通过高温处理连接片段可以明显提高载体的连接效率。(本文来源于《江苏农业学报》期刊2015年02期）
秦艳青[4]（2013）在《乳酸乳球菌主要分泌蛋白的鉴定及其同源整合载体的构建研究》一文中研究指出在乳酸乳球菌的表达研究中,我们发现在培养基上清中始终有一条稳定且表达量较大的蛋白条带。为了探究这些蛋白的本质,挖掘主要蛋白质的潜在功能,本研究利用蛋白质组学技术对该蛋白条带进行了鉴定,并根据结果对打分值最高的蛋白进行了基因克隆、序列分析以及结构预测。同时,通过对该基因编码蛋白的开放阅读框(ORF)及其上下游表达元件进行预测和解析,利用其潜在的启动子、信号肽及终止子等序列,通过引入报告基因,进行了新型乳酸菌分泌型表达载体的设计和构建。培养乳酸乳球菌Lactococcus lactisl.2472,收集上清进行SDS-PAGE,将其中表达量最大的蛋白条带进行切胶回收,胰酶消化后,LC-MS质谱鉴定。对结果进行分析后,以打分值最高的乳球菌未知蛋白为研究对象,根据其ORF前后序列设计引物,提取Lactococcus lactis1.2472基因组DNA为模板,通过PCR技术扩增该未知蛋白基因usp45(后简称usp),PCR产物经纯化回收后克隆至pMD18-T载体中,转化E.coliDH5a感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒进行Sac Ⅰ和Sph Ⅰ酶切及PCR初步鉴定后,对usp基因进行序列测定。测序结果表明,usp基因序列全长2004bp,编码738个氨基酸的,理论分子质量51kDa；4种核苷酸中,GC含量为38.73%、AT含量为61.27%；含有启动子、SD序列、信号肽以及终止信号;序列测定结果与GenBank中已登录的序列进行比较,核苷酸和氨基酸序列同源性与Lactococcus lactis subsp.菌株(登录号：CV56CP002365.1)相比最为接近,分别为99.9%和99.7%,仅有3个碱基发生了变化,均为无义突变,未导致氨基酸序列的改变。蛋白结构预测提示,。为研究usp蛋白对乳酸乳球菌生长的影响,以usp基因上、下游序列为重组臂,以红霉素抗性基因(Emr)为报告基因,进行同源整合载体构建,以敲除usp基因。同时在重组臂设计时,充分考虑usp ORF的启动子、信号肽和终止子序列,为外源基因在乳酸菌中的同源重组和转入提供前提。PCR扩增Emr基因,连接到T载体中,构建载体pMDE;PCR扩增usp ORF两端的同源重组左臂LB和右臂RB基因序列,克隆至pMDE载体中,获得同源重组载体pMDELR,电转化至Lactococcus lactis1.2472感受态细胞中,挑选阳性克隆,采用PCR和SDS-PAGE方法进行鉴定。结果表明：成功获得同源重组臂LB和RB,红霉素抗性基因替换了乳球菌中的usp基因,整合到了乳球菌基因组中。usp基因敲除后,通过乳酸菌生长曲线测定、相差显微镜和扫描电镜观察,野生型和敲除型略有不同,但总体不影响细菌的生长。本研究具有重要的意义,usp45基因的成功克隆、敲除实验以及外源基因表达的初步研究,为进一步探究usp的功能及构建新型乳酸菌分泌型表达载体奠定了基础。(本文来源于《吉林农业大学》期刊2013-06-01）
袁文杰,陈丽杰,孔亮,孜力汗,任剑刚[5]（2013）在《rDNA介导的菊粉酶基因整合载体构建及在K.marxianus中应用》一文中研究指出为提高Kluyveromyces marxianus(K.marxianus)发酵菊芋粉生产乙醇过程中的菊粉酶活性,以酿酒酵母rDNA为整合位点,构建菊粉酶基因的整合表达载体pFA6a-rDNA-pgk-inu.经Sph I线性化后,采用电击法转化K.marxianus,使表达载体整合到K.marxianus的染色体上.经PCR鉴定的阳性转化子能够分泌菊粉酶且能在无筛选压力下稳定遗传50代.重组菌K/r-2分泌的菊粉酶活力为140U/mL,比出发菌株提高了80%.以粗菊芋粉生料为底物进行了补料发酵,重组菌株的发酵终点乙醇浓度为76.5g/L,比出发菌株提高了5g/L,达到理论转化率的96%.这些研究工作为非粮作物菊芋生产燃料乙醇奠定了基础.(本文来源于《大连理工大学学报》期刊2013年02期）
秦艳青,金宁一,李昌,任大勇,沈明浩[6]（2012）在《乳酸乳球菌同源整合载体的构建及鉴定》一文中研究指出构建乳酸乳球菌同源整合载体,实现外源基因在乳酸菌中的同源重组和转入。PCR扩增红霉素抗性基因,连接到T载体中,构建载体pMDE;根据乳酸乳球菌Lactococcus lactis1.2472全基因组中usp基因序列设计引物,PCR扩增usp基因两端的同源重组臂LB和RB基因序列,PCR产物经回收后,克隆至pMDE载体中,获得同源重组载体pMDELR,电转化至Lactococcus lactis1.2472感受态细胞中,挑选阳性克隆,采用PCR和SDS-PAGE方法进行鉴定。结果表明:成功扩增同源重组臂LB和RB,红霉素抗性基因替换了乳球菌中的usp基因,整合到了乳球菌基因组中。(本文来源于《吉林农业大学学报》期刊2012年06期）
张玲[7]（2012）在《利用Biobrick法构建解脂耶氏酵母多拷贝整合载体及基因剂量效应的研究》一文中研究指出在21世纪生物科学领域,合成生物学是一门正在迅速发展的新兴交叉学科,它从最基本的要素开始,先一步步建立零部件,再将这些零部件组织起来,建立出能体现不同功能的天然生物系统。由于传统的分子克隆技术获得重组DNA需要依赖PCR,酶切和连接等分子生物学手段,满足不了合成生物学研究的需要。每需要一个零部件,就必须设计一个独特的克隆方法,而且克隆一个组件过程中的中间产物一般不能应用到别的组件上,毫无疑问这是一种资源上的浪费。随着基因工程技术的迅速发展,如何提高目标蛋白在宿主菌的表达量和稳定性受到了国内外的高度重视,特别是一些具有生物活性的小分子多肽受到了高度关注。通过构建目的基因多拷贝的串联表达方式为小分子多肽的高效表达显现出了广阔的前景,而且多拷贝表达策略在一定程度上可以提高目的蛋白的表达量,为目的基因异源表达的工业化生产打下一定的技术基础。本文研究是在生物砖方法的基础上,通过PCR的方法在解脂耶氏酵母表达载体pINA1296启动子上游和终止子下游分别引入HindⅢ、NheⅠ、XbaⅠ、BamHⅠ各两组酶切位点,最终成功地实现了载体的改造,命名为pINA1296I。为了便于重组子的筛选,本研究分别选取了来源于黑曲霉(Aspergillus niger)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的甘露聚糖酶基因克隆到已改造好的pINA12961载体上,利用生物砖方法来实现体外串联多拷贝目的基因。将构建好的一系列不同拷贝数载体转化解脂耶氏酵母polg菌株中,通过测定蛋白浓度和酶活来研究基因的剂量效应关系。通过测定摇瓶表达上清中的蛋白浓度及酶活,结果表明man-A随着拷贝数的增加蛋白量及酶活性也逐渐增加。5拷贝时蛋白量及酶活达到最大,6拷贝开始下降。该酶最适pH值为3.5,最适温度为65℃。70℃处理10分钟,活性仅剩余24%。pH2.0-8.0范围内室温处理1h,在pH3.0-6.5范围内最稳定,可保持95%以上的活性。Man-B蛋白浓度及酶活与拷贝数呈正相关性,6拷贝蛋白量及酶活达到最大,所以利用生物砖的方法体外串联多拷贝基因在一定程度上可以提高目的蛋白的表达量。(本文来源于《湖北大学》期刊2012-05-24）
文晶,颜若雯[8]（2012）在《全市深入开展学雷锋活动座谈会发言(摘要)》一文中研究指出市教育工委书记、教委副主任 赵为粮 4月，市教委将对教育系统100个雷锋服务站、100个雷锋服务岗等学习实践平台进行授牌，并组织评审、表彰50名雷锋式教师、100所学雷锋先进学校、200个雷锋式集体、300个雷锋式学生。通过再树先进典型，实(本文来源于《重庆日报》期刊2012-03-12）
高晓娜[9]（2012）在《产甘油假丝酵母WL2002-5整合载体的构建研究》一文中研究指出产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)WL2002-5是本实验室从自然界筛选到的优良的工业化甘油生产菌株。与其他酵母相比,具有生长速度快、耐高渗透压、甘油产率高等诸多优势,在生物合成3-羟基丙酸、1,3丙二醇等重要化合物方面有广泛的应用前景,是基因工程领域潜在的优良宿主。而目前对该菌株分子水平的研究较少,适用于该菌株的转化载体非常缺乏。本文以构建适用于该工业菌株的表达体系并以其为基础建立叁碳化合物生物转化平台为目标,在充分了解C. glycerinogenes研究现状的基础上,构建整合载体。主要结果如下:1.构建了适用于C. glycerinogenes的低分子量的通用整合载体pGAPZU。将1.0 kb的URA3基因片段插入pGAPZB质粒构建出pGAPZU质粒。该质粒以pGAPZB为基本框架,URA3基因为整合位点,Zeocin为筛选标记。电转化后筛选得到Zeocin抗性菌株,实验结果证实pGAPZU质粒DNA可转入C. glycerinogenes细胞。2.构建了既含有双GAP启动子又含有绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的pGUGGA整合载体。该质粒以pGAPZB为基本框架,URA3基因为整合位点,Zeocin为筛选标记,具有单独表达盒的GFP编码基因为报告基因。用BstXI单酶切pGUGGA质粒DNA,使该质粒线性化后用电转化法将质粒DNA转入C. glycerinogenes细胞,筛选到Zeocin抗性菌株,经过诊断PCR分析证明pGUGGA质粒DNA整合到了该酵母的URA3基因中,SDS-PAGE和荧光显微镜观察证明GFP在该酵母中正确表达。该研究证实转化该酵母的质粒DNA能达到5.9 kb。pGUGGA载体的构建提供了在C. glycerinogenes细胞共表达两个或多个不同基因的载体构建方法。该研究获得的酵母转化子是URA3营养缺陷型酵母,可以作为以URA3为筛选标记的转化宿主应用于C. glycerinogenes的分子改造和遗传学研究。3.获得了低成本C. glycerinogenes的抗性筛选标记。C. glycerinogenes常用抗性筛选标记仅有Zeocin,因其价格较高,限制了C. glycerinogenes分子生物学方面的研究。经300多种质粒抗性查询,常用抗性选择标记有九种,其中四种为真菌抗性标记:Zeocin、Cu~(2+)、G418和Hygromycin B。敏感性实验结果表明G418、Hygromycin B、Cu~(2+)、Zeocin对该菌株在YEPD培养基上的最低抑制浓度分别为400μg/mL,500μg/mL,18 mmol/L和100μg/mL;抗生素联用G418:Zeocin(1:1)可降低转化子筛选成本。实验结果说明该菌株对G418、Hygromycin B等真菌抗生素具有较强抗性,对Cu~(2+)、Zeocin较敏感。Cu~(2+)是一种低成本C. glycerinogenes抗性筛选标记。4.构建了含有低成本选择性筛选标记CUP1基因的整合载体pGUC。将来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的铜抗性CUP1基因插入pGAPZU质粒构建出pGUC质粒,HindIII单酶切pGUC质粒后电转化至C. glycerinogenes,筛选到Zeocin抗性菌株。经过诊断PCR分析证明pGUC质粒DNA整合到了该酵母的URA3基因中。以野生型C. glycerinogenes为对照,测试了重组型C. glycerinogenes对Cu~(2+)的敏感性,在YEPD固体培养基中,野生型C. glycerinogenes在18 mmol/L的Cu~(2+)中不能生长,而重组型C. glycerinogenes在21 mmol/L的Cu~(2+)中能生长。本实验结果显示CUP1基因能提高C.glycerinogenes的铜抗性,21 mmol/L的Cu~(2+)可以作为筛选重组型C. glycerinogenes的筛选条件。该载体提供了低成本的C. glycerinogenes遗传改造工具。(本文来源于《江南大学》期刊2012-03-01）
支晓慧,王丽娜,朱平,王伟,孔建强[10]（2011）在《基于rDNA序列的酵母整合载体的构建及应用》一文中研究指出目的构建一个基于rDNA序列的酵母整合载体。方法通过PCR扩增得到酿酒酵母rDNA序列;通过常规分子生物学技术构建以rDNA序列为整合位点的酵母整合载体。为了确证该载体的效能,将青蒿紫穗槐-4,11-二烯合酶基因克隆到该载体上,构建了含紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的整合型酿酒酵母工程菌。提取该工程酵母的基因组,通过紫穗槐-4,11-二烯合酶基因的特异引物进行扩增,确认紫穗槐-4,11-二烯合酶基因是否已整合到酵母基因组上。发酵酵母工程菌,对发酵产物进行GC-MS检测,确认是否产生紫穗槐-4,11-二烯。结果构建了1个酵母整合载体,具有如下特点:①能将外源基因表达盒序列整合到酿酒酵母rDNA序列上,增加目的基因的拷贝数;②选择标记能反复应用,方便获得多拷贝的整合形式;③整合片段不需要酶切线性化,节省了内切酶,而且简化了操作程序。酵母基因组PCR结果表明,紫穗槐-4,11-二烯合酶基因已经整合到了酵母基因组上。以朱栾倍半萜为标准品,对该酿酒酵母工程菌的代谢产物进行GC-MS检测,发现其能产生紫穗槐-4,11-二烯,产量达到(91.33±7.57)mg/L朱栾倍半萜当量。结论初步成功构建了一个基于rDNA序列的酵母整合载体。(本文来源于《中国医药生物技术》期刊2011年05期）
整合载体构建论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
构建乳酸菌同源重组载体,以实现外源基因在乳酸菌中的整合型表达。PCR扩增lacZ基因表达盒lacZ-cassette,和upp基因表达盒upp-cassette,SOE-PCR扩增lacZ-P-upp,产物回收后连接到pORI28载体中,构建载体pORZP;根据干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393全基因组中lai基因序列设计引物,PCR扩增lai基因两端同源重组臂lai-up和lai-down基因序列,产物经回收后,连接至pORZP载体中,得同源重组载体pORZPlai。双酶切及DNA测序结果证实,成功构建了同源重组载体pORZP-lai,为实现外源基因在乳酸菌中的非抗性、整合型表达奠定了基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
整合载体构建论文参考文献
[1].聂利波.枯草芽孢杆菌纤维素酶基因整合载体的构建[D].河南科技大学.2017
[2].郭建军,龚小华,袁林,曾静,付锦楠.干酪乳杆菌同源整合载体的构建与鉴定[J].江西科学.2015
[3].韩光杰,赵松,刘琴,李传明,徐健.PuGV-Ps增效蛋白质基因特征及其整合载体的构建[J].江苏农业学报.2015
[4].秦艳青.乳酸乳球菌主要分泌蛋白的鉴定及其同源整合载体的构建研究[D].吉林农业大学.2013
[5].袁文杰,陈丽杰,孔亮,孜力汗,任剑刚.rDNA介导的菊粉酶基因整合载体构建及在K.marxianus中应用[J].大连理工大学学报.2013
[6].秦艳青,金宁一,李昌,任大勇,沈明浩.乳酸乳球菌同源整合载体的构建及鉴定[J].吉林农业大学学报.2012
[7].张玲.利用Biobrick法构建解脂耶氏酵母多拷贝整合载体及基因剂量效应的研究[D].湖北大学.2012
[8].文晶,颜若雯.全市深入开展学雷锋活动座谈会发言(摘要)[N].重庆日报.2012
[9].高晓娜.产甘油假丝酵母WL2002-5整合载体的构建研究[D].江南大学.2012
[10].支晓慧,王丽娜,朱平,王伟,孔建强.基于rDNA序列的酵母整合载体的构建及应用[J].中国医药生物技术.2011