导读:本文包含了神经核蛋白论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:细胞焦亡,α-突触核蛋白,炎性小体,Gasdermin-D
神经核蛋白论文文献综述
韩晨阳,张晓玲,杨毅,郭丽,官俏兵[1]（2019）在《α-突触核蛋白激活NLRP3炎性小体介导神经细胞焦亡的发生》一文中研究指出目的:研究α-突触核蛋白(α-synuclein)对于神经细胞焦亡发生的影响和机制。方法:以小鼠海马神经元细胞HT22细胞株为对象,体外培养后用α-synuclein干预细胞,以CCK-8法检测细胞活力,确定IC_(50)值。设置对照组(Con组)后,采用TUNEL染色法检测细胞焦亡水平,免疫荧光法观察Gasdermin-D-N(GSDMD-N)的表达,Western blot法检测细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、细胞凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、Gasdermin-D(GSDMD)、GSDMD-N、Caspase-1的表达水平,酶联免疫吸附法检测培养基中IL-18、IL-1β的表达水平。采用Caspase-1抑制剂预处理HT22后,同样使用IC_(50)值的α-synuclein干预细胞,同时设置α-synuclein组(单纯α-synuclein干预)和α-synuclein+ML132组,检测细胞焦亡的水平。结果:α-synuclein的IC_(50)值为50 nmol/L。α-synuclein干预后细胞焦亡数目显着增高,TUNEL染色显示阳性细胞数目多于Con组,免疫荧光染色结果显示细胞中GSDMD-N的表达水平上调,细胞中NLRP3、ASC、GSDMD-N、Caspase-1的表达水平显着高于Con组,而GSDMD水平下调,同时细胞培养基中IL-18、IL-1β的水平上调。Caspase-1抑制剂处理后,50 nmol/L的α-synuclein干预后,细胞焦亡水平显着低于α-synuclein组,同时免疫荧光染色结果显示GSDMD-N的水平下调,细胞中NLRP3、ASC、GSDMD-N、Caspase-1的表达水平显着低于α-synuclein组,而GSDMD水平上调,培养基中IL-18和IL-1β的水平下调。结论:α-synuclein可以通过激活NLRP3炎性小体活化继发神经细胞焦亡的发生,在帕金森病的发生发展中具有一定的作用。(本文来源于《中国临床药理学与治疗学》期刊2019年06期）
杨程程[2]（2019）在《应用AAV介导小鼠坐骨神经过表达α-synuclein并结合外源α-synuclein注射建立突触核蛋白病小鼠模型》一文中研究指出背景突触核蛋白病包括不同种类的神经退行性蛋白病理相关的疾病,常见的突触核蛋白病包括帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)、路易体痴呆(Lewy Body Dementia,LBD)、多系统萎缩(Multiple System Atrophy,MSA)等,它们通常伴有中枢神经系统神经元或少突胶质细胞丢失,有的还伴有周围神经的损害,它们都具有由α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)聚集形成的病理改变,有的分布在神经元中,有的分布在神经胶质细胞中。有研究表明在PD、LBD等以神经元内α-syn阳性包涵体形成为主要特征的疾病,其脑、脊髓的α-syn可以在神经元之间通过突触传递,从而造成广泛的病理改变。而对于MSA这一疾病,α-syn包涵体主要在少突胶质细胞里形成,造成少突胶质细胞死亡、神经元髓鞘脱失等病理改变及相应的临床表现。另外神经元亦发生退行性改变,但是其本身发生病变造成的,还是受少突胶质细胞的影响,原因尚未阐明。根据既往文献,正常施万细胞内能够表达一定量的α-syn,而且MSA患者周围神经施万细胞存在过量α-syn阳性包涵体沉积,另外有数据统计表明10%-40%临床诊断为MSA的病人存在周围神经症状且经过电生理检查发现确实有周围神经病理改变,表明施万细胞的病变可能参与了MSA的发病过程。腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)作为一种理想的载体,它与反转录病毒、慢病毒、腺病毒相比有不同的特点,具有无致病性、能够感染许多不同的组织、不但能感染分裂期细胞而且能感染非分裂期细胞,还能够长期稳定在体内或体外表达其所携带的基因的特征。因此我们选用携带含有施万细胞特异性启动子及人全长α-syn基因的AAV载体8型介导α-syn在小鼠坐骨神经中过表达。先前有研究表明仅使用AAV介导α-syn的过表达或仅注射外源性α-syn纤维体来模仿PD的发病过程会存在有进展慢、表达数量不足、不能完全模拟疾病的发病过程等缺陷,因此在本实验中试图将以上两种方式结合,期望加速并较好的模拟出疾病的发展过程。目的本研究拟通过应用AAV介导小鼠坐骨神经过表达α-syn并结合外源α-syn纤维体注射建立突触核蛋白病小鼠模型探讨α-syn是否能在施万细胞内形成阳性包涵体,且施万细胞内阳性包涵体的形成是否能导致小鼠运动功能的损伤及周围神经电生理的改变,从而进一步探讨突触核蛋白病的发病机制。方法1.用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)标记不同衣壳类型AAV空白载体,观察其对施万细胞的亲和力,从而选择合适的AAV载体。2.构建携带有蛋白脂质蛋白启动子(proteolipid protein promoter,PLP)及人全长α-syn基因的AAV8型载体(AAV8-PLP-SYN)。3.制备α-syn纤维体。4.以仅注射AAV(AAV组)和仅注射α-syn纤维体(α-syn组)的C57BL/6小鼠作为对照组,AAV与α-syn纤维体序贯注射(AAV+α-syn组)的C57BL/6小鼠作为实验组。分别于注射前,注射后1、2、3、4个月时对小鼠进行行为学测试和坐骨神经电生理检测,每隔2周进行免疫荧光染色并观察包涵体的形成情况。5.进行行为学、电生理相关数据的统计。结果1.使用GFP标记AAV2、AAV5、AAV8型载体,转染小鼠坐骨神经,发现AAV8型载体可在小鼠坐骨神经施万细胞内大量分布。2.透射电镜下可观察到制备成功的α-syn纤维体的存在。3.实验组小鼠可在短时间内观察到坐骨神经施万细胞内α-syn阳性包涵体的形成,2个月后病理改变显着。而对照小鼠则无明显的病理异常。4.免疫荧光显微镜观察可见施万细胞中α-syn阳性包涵体与施万细胞特异标志物环核苷酸-3'磷酸水解酶(cyclic nucleotide 3'phosphohydrolase,CNPase)存在共定位。5.小鼠坐骨神经电生理检测显示注射药物4个月后,实验组小鼠坐骨神经传导速度明显下降且神经电生理检测结果异常的小鼠数量占比约为85%,对照组无明显异常(P<0.05)。6.小鼠行为学测试结果显示实验组小鼠在4月龄时运动功能明显受损,对照组无明显改变(P<0.05)。结论α-syn过表达于小鼠坐骨神经施万细胞结合外源α-syn纤维体注射共同诱导了小鼠坐骨神经α-syn阳性包涵体形成,并产生运动功能障碍及周围神经电生理异常,提示神经胶质细胞中α-syn阳性包涵体的形成可能参与了突触核蛋白病。(本文来源于《郑州大学》期刊2019-05-01）
孙乐平[3]（2019）在《分子伴侣介导自噬在甲基苯丙胺诱导的α-突触核蛋白相关神经毒性中的作用》一文中研究指出研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是冰毒中最普遍滥用的苯丙胺(Amphetamine)类物质之一,大量研究表明,如果长期服用METH可破坏多巴胺能神经元末梢,还能杀死产生其他神经递质的神经细胞,产生与帕金森病(Parkinson's disease,PD)及阿尔兹海默症(Alzheimer's disease,AD)患者类似的神经退行性病变。在METH所引起的神经毒性机制中,α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)发挥了重要作用且α-Syn的异常增多和异常聚集是其产生神经毒性的主要原因。分子伴侣介导自噬(Chaperone-mediated autophagy,CMA)是自噬溶酶体降解途径的一员。Hsc70不仅是CMA途径传输系统中将基质蛋白输送到溶酶体腔内的关键分子伴侣,并且在神经退行性疾病的神经元死亡中也起到关键作用。Lamp2a是CMA途径的限速步骤,Lamp2a的表达水平与CMA活性水平直接相关且可以通过上调或下调Lamp2a的表达水平来调控CMA活性。已有研究表明CMA功能损坏在帕金森病的病理机制中及α-Syn的异常聚集中起到重要作用。而CMA在METH诱导的α-Syn相关病理学改变中是否起到一定的作用尚不明确。因此,本研究关注CMA与METH处理后α-Syn诱导的神经毒性之间的关系具有十分重要的意义。目的:本研究旨在阐明CMA活性水平变化与METH诱导的α-Syn高表达、异常聚集及所产生的神经毒性之间的关系,探究METH对CMA途径关键分子Lamp2a和Hsc70表达水平的影响及通过调控CMA活性对METH诱导的神经毒性的影响,为METH神经毒性的分子靶向治疗研究提供一定的理论基础和研究方向。方法:1、检测METH处理后产生的毒性作用以及CMA途径关键分子Lamp2a和Hsc70表达水平的变化METH处理细胞后,检测α-Syn、pS129 α-Syn及Lammp2a、Hsc70和Lampl的表达水平。2、探究在SH-SY5Y细胞中沉默Lamp2a对CMA活性及METH诱导的神经毒性的影响用Lamp2a基因小干扰RNA(siRNA)片段并处理细胞后,检测α-Syn、pS129α-Syn、α-Syn异常聚集形式(5G4)、Lamp2a、Hsc70以及细胞凋亡水平的变化情况。3、探究在SH-SY5Y细胞中过表达Hsc70对CMA活性及METH诱导的神经毒性的影响用Hsc70基因过表达质粒并处理细胞后,检测α-Syn、pS129 α-Syn、α-Syn异常聚集形式(5G4)、Lamp2a、Hsc70以及细胞凋亡水平的变化情况。结果:1、METH诱导αα-Syn表达升高、磷酸化α-Syn表达升高并降低CMA活性。2、下调Lamp2a的表达加重了METH诱导的神经毒性,降低了CMA活性。3、上调Hsc70缓解了METH诱导的神经毒性,提高了CMA活性。结论:METH处理神经元细胞后,会使得α-Syn异常表达和异常聚集,从而产生细胞毒性促使细胞发生凋亡;同时METH会影响Lamp-2a的表达水平从而影响CMA的活性。降低Lamp-2a的表达促进了α-Syn异常表达和异常聚集,促进了细胞凋亡的发生;而对Hsc70的过表达处理使得METH诱导产生的细胞毒性得以缓解。故CMA在METH诱导的神经毒性中起到重要作用,而且Hsc70可以作为一个有效的保护分子以缓解METH导致的细胞毒性。(本文来源于《南方医科大学》期刊2019-04-27）
练勇伶[4]（2019）在《甲基苯丙胺引起的神经毒性中α-突触核蛋白与Tau蛋白之间的相互作用研究》一文中研究指出研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH),俗称安非他明类兴奋剂,对中枢神经系统(Central nervous system,CNS)具有强烈的神经毒性作用,冰毒滥用者更容易损伤多巴胺能神经元,出现帕金森病(Parkinson's disease,PD)、阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)等神经退行性症状的风险较高。正常的可溶性蛋白异常堆积成不可溶性的沉积体是许多神经退行性疾病的典型病理特征。α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)异常聚集并积累形成路易小体是帕金森病的一个特异性标志。查询资料显示,α-syn是一种由SNCA基因编码、共140个氨基酸组成的蛋白质,正常状态下,α-syn在不折迭的单体形式和折迭形成的聚合物形式之间保持动态平衡。它存在于神经元突触前和核周区域,是神经递质传递所需的突触囊泡的构成成分,参与突触的信息传递。许多因素推动α-syn的溶解度降低从而增加其毒性作用,如SNCA基因突变、α-syn翻译后修饰、线粒体氧化应激和蛋白质降解功能障碍等。这些因素导致病态增加的α-syn异常折迭、聚集形成不可溶性的寡聚体、低聚物、原纤维及纤维,随后沉积成路易小体,最终导致神经细胞的死亡。脑内微管相关蛋白Tau过度磷酸化积聚成神经纤维缠结(Neurofibrillary tangles,NFTs)是阿尔茨海默病的常见特征。Tau蛋白是一种全长440个氨基酸的蛋白质,由MAPT基因编码,调控微管的组装及其稳定性。文献报道有几个因素参与了Tau蛋白的异常聚集过程,但人们普遍认为过度磷酸化在介导Tau蛋白异常聚集中起了关键作用。Tau蛋白异常磷酸化可使Tau蛋白进一步低聚化,形成寡聚体,继续积聚最终会形成成对螺旋原纤丝(Paired helical fibrils,PHFs)甚至产生神经纤维缠结。近期研究表明,Tau蛋白寡聚体内在化显着促进了神经纤维缠结的发生发展,导致神经细胞活力下降,最终引起神经元死亡,导致退行性病变的症状产生。虽然帕金森病和阿尔兹海默症有不同的特点,但大量阿尔兹海默症病例被发现有路易小体的存在,而阿尔兹海默症相关病理变化,尤其是神经纤维缠结,在帕金森病患者的大脑中也较为常见。更重要的是,国内外关于帕金森病及阿尔兹海默症研究表明,α-syn和Tau蛋白具有相互作用,可以促进彼此的异常磷酸化、聚合和积累。α-syn和Tau蛋白直接接触、相互结合,可以相互诱导病理α-syn、Tau蛋白过度表达、聚合,形成原纤维。此外,糖原合成酶激酶3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK3β)是Tau磷酸化的重要激酶,有研究表明α-syn可以通过促进GSK-3β调节Tau蛋白丝氨酸396位点的磷酸化来间接调节磷酸化Tau蛋白(pSer396 Tau)的表达。同时,Tau蛋白的过表达影响了α-syn聚合模式,减少了聚合体的数量但增加聚集体的大小和毒性。因此,帕金森病和阿尔兹海默症有着一定的共同致病机理,α-syn和Tau蛋白之间存在相互作用,可以促进彼此的表达及积聚。在科室前期研究中,我们已经证明了METH会促进α-syn和Tau蛋白的过表达以及pSer396Tau蛋白的过度磷酸化。METH会导致类似帕金森病和阿尔兹海默症的病变,α-syn和Tau蛋白聚集现象也会在同一个模型中,所以,根据前期结果,我们提出假设:METH作用后,α-syn和Tau蛋白相互作用,促进彼此过表达,并增加了彼此的神经毒性作用。因此,本研究试验中,我们旨在探究METH作用后,α-syn是否影响Tau蛋白的表达以及磷酸化,同时Tau蛋白能否促进α-syn的过表达和积聚。目的:在神经退行性疾病如帕金森病和阿尔茨海默病中,α-syn和Tau蛋白是突出存在的并有共定位现象,而类似的神经毒性在甲基苯丙胺滥用者体内也有被发现。METH作用后,α-syn和Tau蛋白有共定位现象,而共定位的意义在于两蛋白间具有相互作用,所以,在本研究中,我们设计了严密的实验,主要是用于探讨α-syn和Tau蛋白在METH滥用模型中是否具有同样的相互作用。本研究可以针对α-syn和Tau蛋白之间的相互作用及其异常表达的恶性循环的病理机制,为METH滥用者和神经退行样变的病人提供潜在的靶向治疗方法。方法:1.METH吸食致死者纹状体标本的免疫组织化学染色在南方医科大学司法鉴定中心案例中选取有METH长期吸入史、死因鉴定为METH中毒致死的人体标本为实验组,无METH吸入史及其他毒品吸入史、死因鉴定为交通事故的人体标本为对照组,其基底节区(纹状体)做α-syn和pSer396 Tau蛋白特异性免疫组织化学染色。2.METH亚急性中毒动物模型的建立本研究用C57 BL/6J小鼠建立METH体外亚急性中毒模型(15mg/kg,每隔12 h一针,共8针)。此亚急性中毒模型模拟了人体滥用METH后的中毒剂量及相近的血药浓度。20只野生型小鼠被随机分为2组:空白对照组(注射生理盐水)和METH亚急性中毒组(n= 10/组)。最后一次注射METH 2 h后麻醉、断颈、取出脑组织,并进行前额叶(E)、中脑(Z)、海马(H)、纹状体(W)四大脑区分区并4%多聚甲醛固定或提取组织蛋白;Western Blot及免疫组化方法检测α-syn,pSer396 Tau和总Tau蛋白等指标表达情况。3.METH中毒细胞模型的建立为了进一步确认在动物体内实验的结果,培养成熟的SH-SY5Y细胞给予不同浓度(0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5mmol/L)的METH处理24h,或暴露于2.0mmol/L的METH不同持续时间(0,2,4,8,12,24h);培养成熟的C57胎鼠原代培养神经元接受不同浓度(0,0.2,0.4,0.6,0.8,l.Ommol/L)的METH处理24h,或暴露于l.Ommol/L的METH不同持续时间(0,2,4,8,12,24,36,48h);收集细胞进行以下各项实验:(1)Western Blot法检测α-syn,pSer396 Tau和总Tau蛋白等指标变化趋势。(2)免疫荧光法检测α-syn,pSer396Tau和总Tau蛋白的表达变化,并采用倒置共聚焦荧光显微镜观察细胞内α-syn,pSer396Tau和总Tau蛋白的表达变化及共定位现象。(3)免疫共沉淀(CO-IP)方法检测α-syn与pSer396Tau的相互作用关系。4.探究α-syn在METH诱导的pSer396 Tau和总Tau蛋白异常表达及其神经毒性中的作用(1)将40只6周龄雄性C57小鼠随机分成4组(n=10只/组):①野生型对照组(Ctrl组);②SNCA敲基因组(SNCA-/-组);③野生型+METH组(METH组);④SNCA敲基因+METH组(SNCA-/-+METH组)。对③野生型+METH组和④SNCA敲基因+METH组给予腹腔注射METH以建立体外亚急性中毒模型(15mg/kg,每隔12 h一针,共8针)。作为对照,对①野生型对照组和②SNCA敲基因组小鼠腹腔注射等量生理盐水。最后一次注射METH 2 h后麻醉、断颈、取出脑组织,并进行前额叶(E)、中脑(Z)、海马(H)、纹状体(W)四大脑区分区并4%多聚甲醛固定或提取组织蛋白;Western Blot及免疫组化方法检测α-syn蛋白敲除效率及pSer396 Tau和总Tau蛋白等指标表达变化情况。(2)针对SNCA基因设计并合成小干扰片段siRNA,采用Lipofectamin3000瞬时转染技术处理SH-SY5Y细胞及C57胎鼠原代培养神经元,实验分为siRNA-NC组、siRNA-SNCA组、siRNA-NC+METH组和siRNA-SNCA+METH组。根据前期浓度及时间实验,siRNA-NC+METH组和siRNA-SNCA+METH组给予对应的METH处理:SH-SY5Y细胞(2.0mmol/L,8h);C57胎鼠原代培养神经元(l.Ommol/L,24h)。Western Blot及免疫荧光方法检测α-syn蛋白敲低效率及pSer396 Tau和总Tau蛋白等指标表达变化情况。5.探究Tau蛋白在METH诱导的α-syn蛋白异常表达及其神经毒性中的作用将40只6周龄雄性C57小鼠随机分成4组(n=10只/组):①野生型对照组(Ctrl组);②MAPT敲基因组(MAPT-/-组);③野生型+METH组(METH组);④MAPT敲基因+METH组(MAPT-/-+METH组)。对③野生型+METH组和④MAPT敲基因+METH组给予腹腔注射METH以建立体外亚急性中毒模型(15mg/kg,每隔12 h一针,共8针)。作为对照,对①野生型对照组和②MAPT敲基因组小鼠腹腔注射等量生理盐水。最后一次注射METH 2 h后麻醉、断颈、取出脑组织,并进行前额叶(E)、中脑(Z)、海马(H)、纹状体(W)四大脑区分区并4%多聚甲醛固定或提取组织蛋白;Western Blot及免疫组化方法检测总Tau蛋白敲除效率及pSer396 Tau和α-syn蛋白等指标表达变化情况。6.初步探讨P-GSK-3β在α-syn调节Tau蛋白表达及磷酸化中的作用(1)免疫共沉淀(CO-IP)方法检测SH-SY5Y细胞及C57胎鼠原代培养神经元中α-syn与P-GSK-3β的相互作用关系。(2)针对α-syn基因设计并合成siRNA,采用Lipofectamin3000瞬时转染技术处理SH-SY5Y细胞及C57胎鼠原代培养神经元,实验分为NC组、siRNAl组、METH组和siRNAl+METH组。Western Blot检测GSK-3β及P-GSK-3β等指标表达情况。结果:1.METH吸食致死者纹状体标本的免疫组化染色结果显示,α-syn与pSer396 Tau蛋白表达显着增加,此两异常表达的蛋白共同存在同一脑区中。2.体内外实验中,METH作用后,α-syn,pSer396 Tau和总Tau蛋白的表达显着增加本研究用C57小鼠建立METH体外亚急性中毒模型(15mg/kg,每隔12 h一针,共8针)。此METH亚急性中毒模型模拟了人体滥用冰毒后的中毒剂量及相近的血药浓度。20只野生型小鼠被随机分为2组:空白对照组(注射生理盐水)和亚急性中毒组(n= 10/组)。蛋白免疫印迹分析显示,METH作用后,四个脑区的α-syn,pSer396 Tau和总Tau蛋白的表达均显着增加(P<0.05)。众所周知,中脑黑质是多巴胺能神经元胞体聚集的区域,纹状体区则是多巴胺能神经元的轴突投射区,免疫组织化学染色对中脑和纹状体进行检测,α-syn,pSer396 Tau和总Tau蛋白的过表达结果与蛋白免疫印迹结果相同。为了进一步确认在体内实验的结果,SH-SY5Y细胞给予不同浓度(0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5mmol/L)的METH处理24h,蛋白免疫印迹分析、免疫共沉淀及双色免疫荧光法是用来衡量α-syn,pSer396 Tau和总Tau蛋白的表达。目前的结果表明,α-syn,pSer396 Tau和总Tau蛋白的表达呈METH剂量依赖性升高(P<0.05)。为评估时间对α-syn,pSer396Tau和总Tau蛋白表达的影响,分组使SH-SY5Y细胞暴露于2.0mmol/L的METH不同持续时间(0,2,4,8,12,24h)。根据蛋白免疫印迹分析可得,METH作用后,α-syn,pSer396Tau和总Tau蛋白的表达均呈升高趋势(P<0.05)。与空白组相比,METH处理后α-syn,pSer396 Tau和总Tau蛋白的表达于2.0 mmol/L、8 h显着增加了8.39倍、2.34倍和3.32倍(P<0.05)。此外,免疫荧光染色结果表明,在2.0mmol/L、8h的METH处理条件下α-syn、pSer396Tau表达显着增加,并存在共定位现象。CO-IP的相互作用结果也证实了α-syn与pSer396 Tau蛋白共定位现象。在原代培养的神经元中也观察到类似的结果。C57胎鼠原代培养神经元接受不同浓度(0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mmol/L)的METH处理24h,或暴露于1.0mmol/L 的 METH 不同持续时间(0,2,4,8,12,24,36,48h),以验证METH是否影响α-syn,pSer396Tau和总Tau蛋白的表达。蛋白免疫印迹分析表明,1.0 mmol/L、24 h METH处理组比空白对照组α-syn,pSer396 Tau和总Tau蛋白的表达显着增加了2.06倍,1.62倍和1.61倍(P<0.05)。免疫荧光染色结果与这些结果一致,在原代培养神经元中,METH处理后α-syn、pSer396 Tau亦存在共定位现象。CO-IP的相互作用结果也证实了α-syn与pSer396 Tau蛋白共定位现象。3.在体外和体内实验中,α-syn影响pSer396 Tau和总Tau的表达前述体内外实验已经表明,METH可以诱发α-syn,pSer396 Tau和总Tau蛋白过表达。接下来本研究探讨α-syn是否影响pSer396Tau和总Tau蛋白的表达,进一步评估α-syn在METH诱导pSer396 Tau和总Tau蛋白过表达中的作用。首先,本研究检测了SNCA基因敲除小鼠的前额叶皮层、中脑、海马和纹状体四个脑区中α-syn,pSer396 Tau和总Tau蛋白的表达水平。同样,免疫印迹分析表明,SNCA基因敲除显着降低METH作用后α-syn的过表达水平,相应的四个脑区中pSer396 Tau和总Tau蛋白的表达也随之下降至正常水平(P<0.05)。中脑和纹状体的免疫组织化学染色是用来辅助检测α-syn,pSer396 Tau和总Tau蛋白在多巴胺能神经元中的表达变化,结果与蛋白印迹法结果相同。为进一步确认α-syn体内敲除效果,本研究分别用针对SNCA基因的siRNA来减少SH-SY5Y细胞及C57胎鼠原代培养神经元中α-syn的表达。免疫印迹分析表明,METH作用后α-syn表达显着增加,然后siRNA预处理后,siRNA分别减少α-syn的表达～41%、～25%(P<0.05)。同时检测了pSer396 Tau和总Tau蛋白的表达,发现METH作用后pSer396 Tau和总Tau蛋白的表达明显增加(P<0.05)。与对照组相比,单独siRNA处理组影响较小。更重要的是,siRNA预处理后明显减少METH诱导的pSer396 Tau和总Tau蛋白过表达,SH-SY5Y细胞和原代培养神经元中两蛋白表达均分别下降～50%、～47%(P<0.05)。双色免疫荧光染色中也观察到类似的结果。4.MAPT基因敲除小鼠实验表明Tau蛋白调节α-syn的表达大量的研究报道,α-syn和Tau蛋白相互作用、相互影响,前期研究结果亦表明沉默α-syn的表达可以减轻体内外METH诱导的pSer396 Tau和总Tau蛋白过表达。为确定沉默Tau蛋白的表达是否也可以减轻METH诱导的α-syn过表达,我们使用MAPT基因敲除小鼠来检测前额叶皮层、中脑、海马和纹状体中α-syn的表达情况。同样,免疫印迹分析表明,METH作用后显着增加α-syn,pSer396 Tau和总Tau蛋白水平(P<0.05)。然而,MAPT基因敲除显着减少α-syn,pSer396 Tau和总Tau蛋白的表达(P<0.05)。此外,中脑和纹状体的免疫组织化学染色进一步检测α-syn,pSer396Tau和总Tau蛋白的表达变化。这些结果表明,小鼠体内敲除MAPT基因可以有效地抑制METH诱导的α-syn过表达。5.初步探讨P-GSK-3β在α-syn调节Tau蛋白表达及磷酸化中的作用本研究采用免疫共沉淀(CO-IP)方法验证了SH-SY5Y细胞及C57胎鼠原代培养神经元中α-syn与P-GSK-3β具有相互作用关系;采用前述已鉴定有α-syn沉默效果的siRNA片段,SH-SY5Y细胞及C57胎鼠原代培养神经元中GSK-3β及P-GSK-3β在METH作用后显着增加,但siRNA预处理后明显减少METH诱导的GSK-3β及P-GSK-3β蛋白过表达(P<0.05)。证明了P-GSK-3β参与α-syn调节Tau蛋白表达及磷酸化中的作用。结论:(1)METH吸食致死者纹状体标本中α-syn与pSer396 Tau蛋白表达显着增加,此两异常表达的蛋白共同存在同一脑区中;(2)体内外实验中,METH作用后,α-syn、pSer396 Tau和总Tau蛋白表达显着增加;(3)体内外实验中,下调α-syn的表达可以减少METH诱导的pSer396 Tau和总Tau蛋白过表达及积累;(4)敲除MAPT基因可以减少METH诱导的α-syn过表达及积累;(5)沉默α-syn表达可以减少METH诱导的GSK-3β及P-GSK-3β蛋白过表达。上述结果表明,METH作用下,在神经细胞中神经退行性病变相关蛋白质α-syn和Tau蛋白存在正反馈机制,相互促进过表达和积累,而P-GSK-3β蛋白在此过程发挥了一定的重要作用;采取针对SNCA或MAPT的基因沉默技术能有效缓解METH诱导的α-syn和Tau蛋白的过表达,打破正反馈机制,减少异常α-syn和Tau蛋白的积累,以此减少神经细胞的毒性作用。(本文来源于《南方医科大学》期刊2019-04-27）
谭璇[5]（2019）在《α-突触核蛋白在锰诱导小鼠神经细胞内质网应激中的作用》一文中研究指出目的:锰是人类必需的微量元素之一,在大脑生理功能及自稳态中扮演重要作用,锰可以通过不同的机制被转运并贯穿血-脑屏障到达大脑。长期过度暴露于锰,对大脑产生有害作用,导致锰中毒的状态。锰中毒主要来源是职业暴露,如熔炼、锰矿合金工业的暴露,锰也可能由于应用燃料添加剂(MMT),其增加了空气中锰水平导致更广泛的非职业性锰暴露。在锰的神经毒作用中,过度表达的α-突触核蛋白起着非常重要的作用。锰可以诱导内质网应激从而引起脑损伤,但是其具体机制尚不清楚。那么,α-Syn蛋白与锰诱导内质网应激之间的关系是怎样的呢?我们采用野生型及α-Syn基因敲除型小鼠进行实验,观察小鼠行为改变、检测纹状体中锰含量、细胞凋亡率以及内质网应激叁条信号通路PERK通路、IRE1通路和ATF6通路相关分子表达情况,探讨α-Syn蛋白在锰诱导神经细胞内质网应激中的作用,进一步了解内质网应激发生机制。方法:本研究选取野生型小鼠(α-Syn~(+/+))40只和α-Syn基因敲除型(α-Syn~(-/-))小鼠40只,各分4组进行实验,α-Syn~(+/+)对照组(野生型小鼠腹腔注射生理盐水)、α-Syn~(-/-)对照组(α-Syn~(-/-)型小鼠腹腔注射生理盐水)、α-Syn~(+/+)低锰组(野生型小鼠腹腔注射50μmol/kg MnCl_2)、α-Syn~(-/-)低锰组(α-Syn~(-/-)型小鼠腹腔注射50μmol/kg MnCl_2)、α-Syn~(+/+)中锰组(野生型小鼠腹腔注射100μmol/kg MnCl_2)、α-Syn~(-/-)中锰组(α-Syn~(-/-)型小鼠腹腔注射100μmol/kg MnCl_2)、α-Syn~(+/+)高锰组(野生型小鼠腹腔注射200μmol/kg MnCl_2)、α-Syn~(-/-)高锰组(α-Syn~(-/-)型小鼠腹腔注射200μmol/kg MnCl_2)。持续染毒4周,每周测量小鼠体重并观察行为改变,实验结束后进行行为学检测,尽快进行杀鼠取脑,取小鼠纹状体,并检测纹状体中锰含量、细胞凋亡率,以及内质网应激和凋亡相关信号分子表达情况。结果:1、随着锰暴露剂量的增加,野生型及α-Syn基因敲除型小鼠各组纹状体锰含量均不断升高,差异有统计学意义;2、随着锰暴露剂量的增加,野生型及α-Syn基因敲除型各组细胞凋亡率均不断升高,差异有统计学意义;3随着锰暴露剂量的增加,α-Syn~(+/+)高锰组α-Syn蛋白表达和基因表达量均显着升高,差异有统计学意义;4、随着锰暴露剂量的增加,与对照组相比,野生型及α-Syn基因敲除型小鼠高剂量各实验组中PERK、ATF4和eIF2a蛋白表达水平较对照组均升高,野生型小鼠磷酸化的PERK和eIF2a、ATF4基因表达水平升高,而敲除型则较对照组下降,且低于野生型小鼠,差异有统计学意义;5、随着锰暴露剂量的增加,与对照组相比,野生型及α-Syn基因敲除型各组IRE1和p-IRE1蛋白表达均升高,总XBP-1及割裂的XBP-1基因表达升高,敲除型高剂量组中总XBP-1及割裂的XBP-1基因的表达分别较野生型升高,差异有统计学意义;6、随着锰暴露剂量的增加,与对照组相比,野生型及α-Syn基因敲除型高剂量组小鼠神经系统的ATF6蛋白表达水平均升高,差异有统计学意义;CHOP、Cleaved Caspase12蛋白表达水平升高,且α-Syn基因敲除型CHOP、Cleaved Caspase12蛋白表达水平较野生型升高,差异有统计学意义。结论:1.锰可以诱导内质网应激叁条信号通路:PERK-eIF2a通路、IRE1通路以及ATF6通路发生活化;2.α-syn蛋白参与了锰诱导内质网应激PERK通路的活化;3.具有一定生理功能的α-syn蛋白在一定程度上缓解了锰诱导的神经细胞损伤。(本文来源于《中国医科大学》期刊2019-03-01）
韩燕银,刘承伟[6]（2019）在《神经酰胺影响α-突触核蛋白聚集作用的研究进展》一文中研究指出帕金森病(PD)的发生发展与alpha-突触核蛋白(α-syn)的异常聚集息息相关。丝氨酸129位点(S-129)磷酸化的α-syn易聚集形成可溶性的寡聚化α-突触核蛋白(O-α-syn),O-α-syn对神经元具有毒性作用。神经酰胺(Ceramide)是维持细胞膜结构的重要组分,同时作为第二信使,参与细胞分化、增殖、凋亡和衰老等生命活动的调节。近年来发现神经酰胺与蛋白磷酸酶2A,polo样激酶2及葡糖脑苷脂酶的相互作用对α-突触核蛋白寡聚化的形成与否具有重要的作用。笔者将神经酰胺影响α-突触核蛋白聚集的作用进行综述。(本文来源于《华夏医学》期刊2019年01期）
谭璇,徐斌,王璨,闫冬莹,刘畅[7]（2018）在《α-突触核蛋白在锰诱导神经细胞内质网应激中的作用》一文中研究指出目的探讨α-突触核蛋白(α-Syn)在锰诱导神经细胞内质网应激中的作用。方法将野生型和α-Syn基因敲除(α-Syn~(-/-))型C57小鼠各24只,均随机分成4组(每组6只),即对照组(腹腔注射0.9%氯化钠)和低、中、高剂量染锰组(分别腹腔注射50、100和200μmol/kg氯化锰),注射容量为5 ml/kg,每周5次,共4周。而后处死小鼠,切取脑纹状体组织,检测锰含量、细胞凋亡率以及内质网应激和细胞凋亡相关信号分子表达情况。结果随着锰暴露剂量的增加,野生型和α-Syn~(-/-)型小鼠纹状体锰含量及细胞凋亡率均不断升高;高剂量染锰组α-Syn~(-/-)型小鼠细胞凋亡率明显高于野生型小鼠;与对照组比较,中、高剂量染锰组野生型小鼠PERK和eIF2α的磷酸化水平均明显升高,ATF4基因和蛋白表达均明显升高,IRE1磷酸化水平明显升高;中、高剂量染锰组,α-Syn~(-/-)型小鼠PERK和eIF2α蛋白表达升高,而磷酸化水平相对下降,IRE1磷酸化水平明显升高;高剂量组的总XBP-1及割裂的XBP-1基因表达升高,ATF6蛋白表达升高,野生型和α-Syn~(-/-)型小鼠CHOP和割裂的Caspase12蛋白表达均明显高于对照组,细胞凋亡率、IRE1磷酸化水平、CHOP和割裂的Caspase12蛋白表达则均明显高于野生型。结论α-Syn与锰诱导内质网应激PERK-eIF2α信号通路的活化有关,而且α-Syn对锰诱导的细胞凋亡在一定程度上有保护作用。(本文来源于《中国工业医学杂志》期刊2018年04期）
高荧苒[8]（2018）在《核蛋白PCNP对人神经母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响》一文中研究指出背景神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)为一种肾上腺起源的肿瘤,是新生儿发病率较高的癌症。有大约50%的NB的发生是在2岁以内的婴幼儿时期,NB占儿童肿瘤的比例约为6-10%,致死率约为15%。NB是一种神经源性恶性肿瘤,NB细胞在体内和体外培养中,都出现了分化成神经细胞和神经胶质细胞的现象,因此将NB细胞作为一种细胞模型研究肿瘤分化和凋亡及其机制具有重要意义。目前国内外采用较多的用于研究肿瘤的生长、分化、凋亡等机制的NB细胞系主要有SH-SY5Y、SK-N-SH、SK-SN-BE2、LA-N-5等。而我们实验采用的NB细胞SH-SY5Y、SK-N-SH能够支持质粒的复制,使克隆的基因片段得到高效的表达,可表达神经元标志性物质,其细胞形态及其某些生理功能与正常神经元有相似之处,是目前国际上研究神经细胞功能比较理想的细胞模型。PCNP(PEST-containing nuclear protein)是一种新近发现的含有PEST序列的核蛋白,PCNP作为泛素连接酶NIRF(Np95/ICBP90-like RING figer protein)的底物首次于2004年由日本科学家侧面报道,PCNP和NIRF一起构成一种新的信号转导通路,与细胞周期的调控和增殖有着紧密的联系。PCNP是一种指环状的蛋白,它主要定位于细胞核中,它作为一种蛋白连接酶,具有泛素化能力,可以在蛋白降解中起作用。目前关于PCNP的相关报道较少,但关于PEST结构域的研究相对较多,PEST是一种富含脯氨酸(Proline,P)、谷氨酸(Glutamic acid,E)、丝氨酸(Serine,S)和苏氨酸(Threonine,T)的肽序列,PEST domin对于细胞周期和增殖具有调控作用,并且和染色体的稳定、肿瘤的发生以及免疫系统疾病有关。因此我们猜想并验证PCNP也与细胞生长和凋亡有关,本课题对PCNP对于人神经母细胞瘤细胞生长及凋亡的影响做了初步探讨。目的探讨PCNP基因过表达及沉默对人NB细胞增殖、迁移、侵袭和成瘤的影响,并寻找可能导致这些变化的机制。方法将PCNP过表达及干扰质粒转染人NB细胞SH-SY5Y和SK-N-SH,并分别采用G418和嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株,将得到的稳定株采用MTS、EDU法检测细胞增殖;采用TUNEL染色法检测细胞凋亡水平变化;采用划痕、transwell、invasion、soft agar实验检测细胞迁移和侵袭能力;并通过蛋白免疫印迹法Western blot检测MAPK及PI3K/AKT/mTOR通路相关分子表达的变化;将PCNP过表达及沉默的人NB细胞注射入裸鼠腋下检测PCNP对人NB细胞成瘤能力的影响。结果(1)成功构建PCNP过表达及沉默稳定株;(2)MTS、EDU检测SH-SY5Y细胞和SK-N-SH细胞增殖情况,结果显示PCNP过表达抑制细胞增殖,沉默促进细胞增殖;(3)Tunel染色法检测细胞凋亡,结果显示PCNP过表达促进NB细胞凋亡,沉默抑制凋亡;(4)划痕和transwell法检测PCNP对NB细胞迁移能力的影响,结果表明PCNP过表达后细胞迁移能力减弱,沉默后增强;(5)invasion和soft agar实验检测细胞侵袭能力,结果表明PCNP过表达减弱NB细胞侵袭能力,而PCNP沉默侵袭增强;(6)Western blot结果显示PCNP过表达后Cleaved Caspase3、Cleaved Caspase8、Cleaved Caspase9表达增多,而PCNP沉默后表达减少;PCNP过表达导致SH-SY5Y细胞bax表达增多,bcl-2表达减少;相反PCNP沉默导致细胞bax表达减少,bcl-2表达增加,与凋亡实验结果一致;因此PCNP可能通过调控细胞凋亡而影响生长;(7)Western blot检测MAPK及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关分子表达的变化,结果显示PCNP过表达后p-JNK、p-P38和p-Erk表达增多,而磷酸化的PI3K、AKT、mTOR与对照相比表达减少;而PCNP沉默后磷酸化的JNK、P38和Erk表达减少,磷酸化的PI3K、AKT、mTOR表达增多,因此PCNP可能通过MAPK信号转导通路调控NB细胞凋亡,通过PI3K/AKT/mTOR通路调控NB增殖;(8)注射PCNP过表达细胞的裸鼠腋下肿瘤较对照组减小,注射PCNP沉默细胞的裸鼠腋下形成的肿瘤较对照组增大。结论1、PCNP抑制人NB细胞SH-SY5Y和SK-N-SH增殖;2、PCNP促进人NB细胞凋亡;3、PCNP抑制人NB细胞迁移和侵袭;4、PCNP可能通过MAPK信号转导通路和PI3K/AKT/mTOR通路调控细胞凋亡及增殖;5、PCNP抑制人NB细胞移植瘤形成。(本文来源于《河南大学》期刊2018-06-01）
朱林楠[9]（2018）在《甲基苯丙胺诱导α-突触核蛋白类泛素化在其异常聚集和神经毒性作用中的研究》一文中研究指出研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)属于苯丙胺类神经兴奋剂(Amphetamine-Typed Stimulant,ATS),当前全球 METH 滥用形势日益严峻,呈现出区域不断扩大、滥用率急剧增长、年龄结构低龄化等特点因此对METH的毒性及防治的研究已成为世界面临的重大课题。大量研究表明,METH主要作用于中枢神经系统,主要表现为多巴胺等单胺类神经末梢的损伤,METH可导致大脑出现与阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease AD)和帕金森病(Parkinson's disease,PD)等神经退行性病变类似的病理学改变。本实验室多年来致力于METH神经毒性相关分子机制方面的研究,前期研究已经发现在体内外实验中αα-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)在METH所导致的多巴胺能神经元损伤、氧化应激系统失衡和线粒体功能障碍等机制中发挥重要作用。α-Syn是由140个氨基酸组成的可溶性非折迭蛋白,是PD特征性病理结构——路易氏小体(Lewy's body)的主要组成部分。目前研究证明,α-Syn的蛋白翻译后修饰包括磷酸化、硝基化都在α-Syn的聚集和神经毒性中发挥了重要作用,而类泛素化修饰与α-Syn的作用机制尚不明确。类泛素化蛋白(small ubiquitin-like modifier)是泛素蛋白家族成员之一,类泛素化蛋白通过E1活化酶、E2结合酶和E3连接酶的级联反应,以共价键结合到靶蛋白的赖氨酸残基上,从而调节靶蛋白的定位以及靶蛋白与其他大分子的相互作用。据报道称,在神经退行性疾病患者大脑组织中检测出类泛素化蛋白,并且SUMO-1与患者大脑内病理性包涵体共定位,说明类泛素化蛋白在神经退行性疾病中的重要性。α-Syn是类泛素化的重要底物蛋白之一,研究报道α-Syn主要通过赖氨酸96和102位点发生类泛素化,但是,关于α-Syn类泛素化在METH的神经毒性中的作用机制尚未明确。目的:本实验旨在阐明α-Syn类泛素化水平变化与METH诱导的α-Syn高表达、异常聚集及神经毒性之间的关系,探究METH对α-Syn类泛素化及其关键酶的作用,证实METH不仅诱导α-Syn表达增加,也促使α-Syn蛋白异常聚集,通过调节α-Syn类泛素化水平变化能够影响METH诱导的α-Syn高表达和异常聚集情况,影响α-Syn通过泛素蛋白酶体途径和自噬溶酶体途径的降解机制,从而证明调控α-Syn类泛素化能够减轻METH导致的α-Syn高表达、异常聚集及多巴胺能神经元损伤,为METH神经毒性分子靶向治疗提供一定的理论基础和研究方向。方法:1、检测METH处理SH-SY5Y细胞、C57小鼠原代神经元细胞以及C57小鼠METH亚急性中毒模型中SUMO-1表达、α-Syn表达和聚集情况;2、免疫共沉淀检测METH处理SH-SY5Y细胞、原代神经元细胞以及C57小鼠METH亚急性中毒模型中α-Syn类泛素化水平;3、检测METH诱导SH-SY5Y细胞、原代神经元细胞中E1、E2、E3关键酶表达变化;4、前期研究发现E2酶UBC9在METH诱导的α-Syn类泛素化水平下降中起关键作用,检测在SH-SY5Y细胞和原代神经元细胞中过表达UBC9对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达和异常聚集的影响;5、检测在SH-SY5Y细胞和原代神经元细胞中沉默SUMO-1对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达和异常聚集的影响;6、在SH-SY5Y细胞中转染慢病毒并筛选稳定表达细胞株,检测定点突变α-Syn类泛素化位点K96/102R对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达、异常聚集和降解障碍的影响;7、检测在C57小鼠METH亚急性中毒模型中定点突变α-Syn类泛素化位点K96/102R对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达、异常聚集和降解障碍的影响。结果:1、METH诱导体内外实验中SUMO-1表达、α-Syn表达和聚集情况:(1)以浓度梯度METH处理SH-SY5Y细胞24h,随着浓度升高SUMO-1、α-Syn表达量呈上升趋势,α-Syn聚集水平也呈上升趋势,当给药浓度达到2.5mmol/L 时达到顶峰,2.5mmol/L METH 处理 SH-SY5Y 细胞 24h,SUMO-1 和α-Syn表达量分别上升了 1.77倍和1.73倍,α-Syn聚集水平上升1.76倍,具有显着差异。以2.0mmol/LMETH按照时间梯度处理SH-SY5Y细胞,随着处理时间延长,SUMO-1、α-Syn表达量和α-Syn聚集水平均呈上升趋势,具有显着差异。(2)以浓度梯度METH处理原代神经元细胞24h随着浓度升高SUMO-1、α-Syn表达量呈上升趋势,当给药浓度达到1.Ommol/L时达到顶峰,1.Ommol/L METH处理原代神经元细胞24h SUMO-1和α-Syn表达量分别上升了 2.23倍和2.71倍,具有显着差异。以1.0mmol/L METH按照时间梯度处理原代神经元细胞,随着处理时间延长,SUMO-1、α-Syn表达量均呈上升趋势,具有显着差异。(3)C57小鼠METH亚急性中毒模型大脑额叶SUMO-1、α-Syn表达量相较于对照组,分别上升了 1.69倍和2.06倍,具有显着差异;纹状体区SUMO-1、α-Syn表达量相较于对照组,分别上升了 2.14倍和1.56倍,具有显着差异。2、METH诱导体内外实验中α-Syn类泛素化水平变化:(1)以浓度梯度METH处理SH-SY5Y细胞24h,随着浓度升高,α-Syn类泛素化水平呈下降趋势,2.5mmol/L METH处理SH-SY5Y细胞24h,α-Syn类泛素化水平下降了 59.6%,具有显着差异;(2)以浓度梯度METH处理原代神经元细胞24h,随着浓度升高,α-Syn类泛素化水平呈下降趋势,1.Ommol/L METH处理原代神经元细胞24h,α-Syn类泛素化水平下降了 64.9%,具有显着差异;(3)C57小鼠METH亚急性中毒模型大脑额叶与纹状体区α-Syn类泛素化水平分别下降了 60.7%和54.6%,具有显着差异。3、METH诱导体外实验中关键酶变化情况:以浓度梯度METH处理SH-SY5Y细胞和原代神经元细胞24h,随着浓度升高,E1酶SAE1、E3酶PIAS1和去类泛素化酶SENP-1表达无明显变化,而E2酶UBC9表达则呈下降趋势,具有显着差异;4、在体外实验中过表达UBC9对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达和异常聚集的影响:(1)在SH-SY5Y细胞中过表达UBC9,相较于对照组,过表达组UBC9水平上升1.8倍,α-Syn类泛素化水平上升了 1.49倍,METH+UBC9组相较于METH组α-Syn水平降低了 27.2%、α-Syn聚集水平降低了 33.1%,具有显着差异;(2)在原代神经元细胞中过表达UBC9,相较于对照组,过表达组UBC9水平上升1.44倍,α-Syn类泛素化水平上升了 1.57倍,METH+UBC9组相较于METH组α-Syn水平降低了 37.4%,具有显着差异。5、在体外实验中沉默SUMO-1对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达和异常聚集的影响;(1)在SH-SY5Y细胞中沉默SUMO-1,相较于阴性对照组,α-Syn类泛素化水平下降38.8%,当METH与siSUMO-1共同处理细胞时,α-Syn类泛素化水平则下降66.1%,METH+siSUMO-1组相较于METH组α-Syn表达水平升高了1.7倍,α-Syn聚集水平升高了 1.5倍,具有显着差异;(2)在原代神经元细胞中沉默SUMO-1,相较于阴性对照组,α-Syn类泛素化水平下降了 70.1%,当METH与LV-SUMO-1-iRNA共同处理细胞时,α-Syn类泛素化水平则下降85.7%,METH+LV-SUMO-1-iRNA组相较于METH组α-Syn水平上升了 1.23倍,具有显着差异。6、在SH-SY5Y细胞中定点突变α-Syn类泛素化位点对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达、异常聚集和降解障碍的影响:(1)相较于阴性对照组,LV-WT-α-syn组和LV-α-syn-2KR组α-Syn表达水平分别为 1.74 倍和 1.57 倍;相较于 LV-WT-α-syn 组,LV-α-syn-2KR 组 α-Syn 类泛素化水平降低61.6%,具有显着差异;LV-GFP+METH组与LV-WT-α-syn+METH组α-Syn表达和聚集水平无明显差异,但LV-α-syn-2KR组Ω-Syn表达和聚集水平则分别比LV-WT-α-syn+METH组高1.21倍和1.25倍,具有显着差异;(2)分别在稳定表达LV-WT-α-syn和LV-α-syn-2KR的细胞株给予METH处理的同时过表达UBC9,相较于WTα-syn+METH组,WTα-syn+METH+UBC9组α-Syn类泛素化水平上升1.71倍,α-Syn表达水平降低了 22.7%,具有显着差异。而相较于 α-syn-2KR+METH 组,α-syn-2KR+METH+UBC9 组 α-Syn 类泛素化和α-Syn表达水平均无明显变化。(3)相较于对照组,随着METH处理浓度增加,泛素蛋白酶体降解途径相关蛋白UbE1呈下降趋势而Ub呈上升趋势,自噬溶酶体降解途径相关蛋白LC3-II,P-62 和 LAMP2A 均呈上升趋势。相较于 WTα-syn+METH 组,α-syn-2KR+METH组 UbE1 与 UbE1/Ub 分别下降了 45.3%与 74.5%,LC3-II,P-62 和 LAMP2A 则分别上升了 2.01倍,1.62倍与2.53倍,具有显着差异。7、C57小鼠METH亚急性中毒模型中定点突变α-Syn类泛素化位点对α-Syn类泛素化水平、METH诱导的α-Syn高表达、异常聚集和降解障碍的影响。(1)相较于阴性对照组,AAV2-WT α-syn 组和 AAV2-α-syn-2KR 组 α-Syn表达水平分别上升2.02倍和2.81倍,具有显着差异;(2)相较于 AAV2-WT α-syn 组,AAV2-α-syn-2KR 组 α-Syn 类泛素化水平下降44.2%,具有显着差异;相较于AAV2-WT α-syn+METH组,AAV2-α-syn-2KR+METH组α-Syn类泛素化水平下降62.8%,具有显着差异;(3)AAV2-α-syn-2KR+METH 组相较于 AAV2-WT α-syn+METH 组,α-Syn表达水平上升1.79倍,具有显着差异;(4)相较于对照组,在小鼠METH亚急性中毒模型的大脑纹状体区,UbE1呈下降趋势而Ub呈上升趋势,同时LC3-II,P-62和LAMP2A均呈上升趋势,具有显着差异;AAV2-α-Syn-2KR+METH 组相较于 AAV2-WT α-Syn+METH 组,UbE1 与 UbE1/Ub 分别下降了 55.0%与 71.7%,LC3-II,P-62 和 LAMP2A 则分别上升了 2.22倍、1.40倍与1.30倍,具有显着差异,进一步验证体外实验中的结果。结论:体内外模型中,METH导致SUMO-1表达、α-Syn表达和聚集水平上升,并且通过下调UBC9,降低α-Syn类泛素化水平而发挥神经毒性作用。过表达UBC9升高α-Syn类泛素化水平,缓解METH导致的α-Syn高表达和异常聚集;沉默SUMO-1降低α-Syn类泛素化水平,加剧METH导致的α-Syn高表达和异常聚集。体内外模型中特异性突变α-Syn类泛素化位点K96/102R降低α-Syn类泛素化水平,加剧METH导致的α-Syn高表达和异常聚集,加剧METH导致的α-Syn通过自噬溶酶体途径和泛素蛋白酶体途径降解障碍。因此,α-Syn类泛素化在METH的神经毒性机制中起到保护作用,通过调控α-Syn类泛素化,能够缓解METH相关神经毒性作用。(本文来源于《南方医科大学》期刊2018-05-19）
陈少花,范余娟,李文怡,徐红,陈泓[10]（2017）在《γ-神经突触核蛋白基因沉默对子宫内膜癌HEC-1A细胞周期的影响》一文中研究指出目的观察γ-神经突触核蛋白(SNCG)基因稳定沉默后人子宫内膜癌HEC-1A细胞生长周期的变化。方法采用流式细胞术检测SNCG基因沉默后HEC-1A细胞周期变化;通过激光扫描共聚焦显微镜观察吖啶橙染色后G2/M期百分比变化。结果流式细胞术结果显示,SNCG基因沉默后HEC-1A细胞处于G_1和G_2/M期增多,处于S期减少,差异有统计学意义(P<0.05);共聚焦显微镜观察结果显示,SNCG基因沉默后HEC-1A细胞处于G_2/M期百分比增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论两个方法共同验证了慢病毒质粒载体shRNA干扰后SNCG基因稳定沉默的HEC-1A细胞周期阻滞于G_2/M期,提示SNCG基因与子宫内膜癌细胞生长周期密切相关。(本文来源于《实用医学杂志》期刊2017年22期）
神经核蛋白论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
背景突触核蛋白病包括不同种类的神经退行性蛋白病理相关的疾病,常见的突触核蛋白病包括帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)、路易体痴呆(Lewy Body Dementia,LBD)、多系统萎缩(Multiple System Atrophy,MSA)等,它们通常伴有中枢神经系统神经元或少突胶质细胞丢失,有的还伴有周围神经的损害,它们都具有由α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)聚集形成的病理改变,有的分布在神经元中,有的分布在神经胶质细胞中。有研究表明在PD、LBD等以神经元内α-syn阳性包涵体形成为主要特征的疾病,其脑、脊髓的α-syn可以在神经元之间通过突触传递,从而造成广泛的病理改变。而对于MSA这一疾病,α-syn包涵体主要在少突胶质细胞里形成,造成少突胶质细胞死亡、神经元髓鞘脱失等病理改变及相应的临床表现。另外神经元亦发生退行性改变,但是其本身发生病变造成的,还是受少突胶质细胞的影响,原因尚未阐明。根据既往文献,正常施万细胞内能够表达一定量的α-syn,而且MSA患者周围神经施万细胞存在过量α-syn阳性包涵体沉积,另外有数据统计表明10%-40%临床诊断为MSA的病人存在周围神经症状且经过电生理检查发现确实有周围神经病理改变,表明施万细胞的病变可能参与了MSA的发病过程。腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)作为一种理想的载体,它与反转录病毒、慢病毒、腺病毒相比有不同的特点,具有无致病性、能够感染许多不同的组织、不但能感染分裂期细胞而且能感染非分裂期细胞,还能够长期稳定在体内或体外表达其所携带的基因的特征。因此我们选用携带含有施万细胞特异性启动子及人全长α-syn基因的AAV载体8型介导α-syn在小鼠坐骨神经中过表达。先前有研究表明仅使用AAV介导α-syn的过表达或仅注射外源性α-syn纤维体来模仿PD的发病过程会存在有进展慢、表达数量不足、不能完全模拟疾病的发病过程等缺陷,因此在本实验中试图将以上两种方式结合,期望加速并较好的模拟出疾病的发展过程。目的本研究拟通过应用AAV介导小鼠坐骨神经过表达α-syn并结合外源α-syn纤维体注射建立突触核蛋白病小鼠模型探讨α-syn是否能在施万细胞内形成阳性包涵体,且施万细胞内阳性包涵体的形成是否能导致小鼠运动功能的损伤及周围神经电生理的改变,从而进一步探讨突触核蛋白病的发病机制。方法1.用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)标记不同衣壳类型AAV空白载体,观察其对施万细胞的亲和力,从而选择合适的AAV载体。2.构建携带有蛋白脂质蛋白启动子(proteolipid protein promoter,PLP)及人全长α-syn基因的AAV8型载体(AAV8-PLP-SYN)。3.制备α-syn纤维体。4.以仅注射AAV(AAV组)和仅注射α-syn纤维体(α-syn组)的C57BL/6小鼠作为对照组,AAV与α-syn纤维体序贯注射(AAV+α-syn组)的C57BL/6小鼠作为实验组。分别于注射前,注射后1、2、3、4个月时对小鼠进行行为学测试和坐骨神经电生理检测,每隔2周进行免疫荧光染色并观察包涵体的形成情况。5.进行行为学、电生理相关数据的统计。结果1.使用GFP标记AAV2、AAV5、AAV8型载体,转染小鼠坐骨神经,发现AAV8型载体可在小鼠坐骨神经施万细胞内大量分布。2.透射电镜下可观察到制备成功的α-syn纤维体的存在。3.实验组小鼠可在短时间内观察到坐骨神经施万细胞内α-syn阳性包涵体的形成,2个月后病理改变显着。而对照小鼠则无明显的病理异常。4.免疫荧光显微镜观察可见施万细胞中α-syn阳性包涵体与施万细胞特异标志物环核苷酸-3'磷酸水解酶(cyclic nucleotide 3'phosphohydrolase,CNPase)存在共定位。5.小鼠坐骨神经电生理检测显示注射药物4个月后,实验组小鼠坐骨神经传导速度明显下降且神经电生理检测结果异常的小鼠数量占比约为85%,对照组无明显异常(P<0.05)。6.小鼠行为学测试结果显示实验组小鼠在4月龄时运动功能明显受损,对照组无明显改变(P<0.05)。结论α-syn过表达于小鼠坐骨神经施万细胞结合外源α-syn纤维体注射共同诱导了小鼠坐骨神经α-syn阳性包涵体形成,并产生运动功能障碍及周围神经电生理异常,提示神经胶质细胞中α-syn阳性包涵体的形成可能参与了突触核蛋白病。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
神经核蛋白论文参考文献
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标签：细胞焦亡; α-突触核蛋白; 炎性小体; Gasdermin-D;