一、NCX-1000的新合成方法（论文文献综述）
孙莹[1]（2019）在《RGD-transTat抑制新生血管生成活性的初步研究》文中研究指明与血管生成相关的疾病如实体肿瘤、眼部血管增生类疾病是研究工作中一类热点疾病,抑制新生血管的生成是治疗此类疾病的首要选择。病理性新生血管的生成多与促血管生成因子和血管生成抑制因子的失衡有关。其中,促血管生成因子主要包括血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等,对新生血管的生成起着至关重要的的作用。Tat作为细胞穿膜肽已得到广泛应用,在Tat的帮助下蛋白质、核酸、脂质体等都能顺利穿透细胞膜,进入细胞。RGD可以与整合素αvβ3特异性结合,通常作为靶向肽应用于各类研究。碳端规则（C-end rule,CendR）是Ruoslahti团队利用噬菌体展示技术发现的一种位置效应。在碳端具有R/KXXR/K结构的肽链可以与靶细胞上的神经纤毛蛋白1（NRP1）受体结合,其中X表示除精氨酸与赖氨酸之外的任意氨基酸,R/KXXR/K结构需位于肽链碳端。Tat序列中存在RKKR元件,但其位于肽链的氮端而非碳端,逆序后的Tat即transTat严格符合CendR。因此,本课题以transTat作为研究对象,考察其穿膜性与抑制新生血管生成的活性。为使transTat具有更好的靶向作用,将RGD与transTat连接,考察RGD-transTat抑制新生血管生成活性,为治疗新生血管疾病的肽链提供多一种选择。本文的主要研究内容与结果如下:（1）TransTat和Tat穿膜性的对比研究本研究中首先对比研究了 transTat和Tat穿膜活性。通过细胞摄取实验与荧光倒置显微镜观察结合发现transTat的穿膜能力与Tat相当,将Tat序列逆转后得到的transTat对tat的穿膜能力没有影响。（2）TransTat、RGD-transTat抑制新生血管生成活性的初步研究通过细胞增殖实验、划痕实验、成管实验以及鸡胚尿囊膜模型评价了 Tat、transTat、RGD、RGDtransTat和transTatRGD 5种多肽抑制新生血管的生成活性。结果表明,Tat与transTat对于人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞增殖与成管没有显着性影响,对HUVEC的迁移有一定的抑制作用,但二者之间没有显着性差异,可以表明逆序后的Tat,即transTat,没有显示出更强的抑制新生血管生成的活性。RGD-transTat对HUVEC细胞增殖、迁移以及成管的抑制作用明显增强,且RGD位于肽链碳端与氮端对transTat活性没有显着影响。（3）Tat、transTat、RGD、RGDtransTat 和 transTatRGD 与 NRP1、整合素αvβ3的结合能力利用HUVEC细胞摄取实验以及通过共聚焦显微镜观察Tat、transTat、RGD、RGDtransTat 和 transTatRGD 5 种多肽在 HUVEC 细胞上与 NRP-1、整合素αvβ3的共定位,结合实验结果可以发现,除RGD外,Tat、transTat、RGDtransTat和transTatRGD 4种多肽对NRP1均具有一定的结合能力,transTatRGD稍弱一些。Tat与transTat对αvβ 3的特异性结合与RGDtransTat、transTatRGD相比较弱。本论文的创新点包括:（1）将Tat逆序后得到一种新的穿膜肽transTat,并对其抑制新生血管生成的活性进行了初步评价。（2）将 RGD 与 transTat 连接合成 RGDtransTat 和 transTatRGD,研究了它们抑制新生血管生成的活性以及初步的作用机制,并评价了 RGD位于碳端与氮端对transTat活性的影响。
肖士鹏[2]（2018）在《修饰玻璃酸钠组织工程软骨支架的制备及应用研究》文中研究说明研究背景:目前,受损的透明软骨是数百万年轻人和老年人经历的膝关节疼痛的罪魁祸首。由于急性创伤、日常磨损、衰老或疾病导致的软骨损伤可引起间歇性或慢性疼痛,并可伴有肿胀、关节交锁、周围肌肉减弱或运动范围减小等。玻璃酸（Hyaluronic acid,HA）是糖胺聚糖的一种,其由（1-β-4）D-葡糖醛酸和（1-β-3）N-乙酰基-D-葡糖胺的重复二糖单元组成。HA是皮肤、玻璃体、滑液和软骨等组织中细胞外基质的重要组成部分,具有独特的物理化学特性和生物学功能。HA作为软骨细胞生长的底物是软骨基质的重要组成部分,它可以促进软骨细胞的代谢,刺激软骨基质的形成,维持软骨细胞的表型。在构建软骨细胞支架时,它被认为是最合适的材料之一。具有吸湿性和高水溶性的天然HA是具有长直链的聚合物。它们易于通过身体组织中的固有酶或自由基分布和消化。当应用于身体的局部组织时,其天然形式的可注射HA仅持续1-2天。非交联HA的机械强度不能满足组织工程支架的要求。通过交联能够形成稳定的HA聚合物网络。可通过控制交联度和工艺参数修饰玻璃酸钠来制备可生物降解和多孔的材料,这将是软骨组织工程的潜在支架。使用交联 HA（Cross-linked sodium hyaluronate,CHA）与 1,4-丁二醇二缩水甘油醚（1,4-Butanedioldiglycidylether,BDDE）作为交联剂的可注射凝胶来治疗骨关节炎（Osteoarthritis,OA）、软组织缺损和填充真皮组织。这些产品的有效性和安全性己在临床试验中得到证实。然而,CHA在组织工程中的价值至今尚未阐明。最近的报道表明,人类干细胞,特别是间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）,在关节软骨疾病的治疗中产生了积极的结果。人类MSCs可以从多种成人组织中获得,易于扩增,随后分化为可产生基质的软骨细胞,最终促进透明关节软骨的形成。MSCs易于分离,其表型得以维持,因为它们与衰老无关。此外,它们具有优于其他软骨细胞的优异的初始增殖能力。由于多能干细胞（例如,诱导的多能干细胞或胚胎干细胞）具有潜在的畸胎瘤形成风险,与软骨组织工程中的MSC相比,它们并不适合用于软骨修复。然而,组织工程软骨尚未完全具有天然关节软骨的结构和功能特性,限制了其广泛应用于临床。因此,迄今为止,关节软骨修复尚无可靠的长期治疗策略。常规疗法（例如:微骨折、镶嵌成形术和软骨扩增移植术）或传统疗法（例如:关节外科手术）具有若干缺点。在关节外科手术中,进行假体装置的植入以替换软骨生物组织,其可以挽救部分关节功能,但仅仅可维持10-15年。该手术无法避免手术后并发症的风险,包括感染和炎症。因此,迫切需要有效治疗以成功修复或再生关节软骨组织。橙皮苷在许多疾病模型中表现出抗炎特性。例如,橙皮苷已经在啮齿动物模型中显示出通过抑制细胞因子产生,降低NF-κB活性和减轻氧化应激反应来减少炎症以及炎症疼痛。在应用橙皮苷的动物模型中,渗出物LPO减少,但SOD和GSH增加。这些影响表明橙皮苷具有抗过氧化作用。然而,在组织内的环境下,给予橙皮苷导致LPO、SOD、CAT和GSH降低,进一步表明其可抑制氧化应激反应的增加。有趣的是,在血清中它只能降低CAT和GSH,而对LPO和SOD没有任何显着影响。这些观察结果表明,橙皮苷可能不会在体内降低总体氧化应激,但只是逆转炎症变化,从而降低组织和渗出液中的LPO。然而,橙皮苷给药后降低了组织和血清中的亚硝酸盐浓度,表明橙皮苷通过·NO自由基发挥清除作用,抑制炎症通路,从而发挥抗炎作用。这些影响也与先前关于橙皮苷的报道一致。其余参数包括总白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞计数以及渗出物中TNF-α的浓度以及组织学特点没有发生明显变化。然而,目前关于橙皮苷对MSC的软骨形成过程中免疫应答的影响尚无研究报道。目的:在本研究中,通过两次冷冻干燥过程以BDDE作为交联剂的方法制备CHA支架,并测定了支架的物理化学性质,通过建立微骨折手术的全层软骨缺损小型猪模型,评估支架对促进软骨修复的影响;进一步通过分离出人类MSCs,研究橙皮苷对MSCs软骨组织修复过程中软骨形成的影响,探讨软骨修复过程中的可能机制。该研究将为CHA支架在软骨工程领域的应用奠定基础。方法:该研究包括三个连续的部分,实验过程如下:第一部分修饰玻璃酸钠制备组织工程软骨支架材料及其理化性质的实验研究1.1CHA支架的制备分别称量分子量（Mw）为1850kDa和350kDa的两种SH,并以1:1的比例混合。然后加入含有交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）的0.2%NaOH溶液并搅拌该溶液。将均匀的凝胶倒入具有光滑且不透水表面的模具中,加入量为0.2ml/cm2。将模具放入冷冻干燥机并冷冻干燥。将冷冻干燥的样品转移到培养箱中,加热4小时,然后浸入温度为70±2℃的蒸馏水中以促进肿胀。将溶胀的样品再次冻干,将最终的冻干样品在室温下保存在干燥器中进一步测试。1.2 CHA支架物理化学性质的检测在最佳条件下制备CHA支架样品进行形态学研究,使用SEM在5kV加速电压和10mm工作距离处表征CHA支架的表面和横截面形态。为了获得膨胀的样品,将CHA支架切成5mm×5mm的小片,在蒸馏水中浸泡24小时达到平衡,在-35℃下速冻并冻干。然后将样品喷涂并用金涂覆20秒,并装载在铝短棒上进行SEM成像。然后使用配备有彩色照像机的光学显微镜来研究溶胀样品的形态。将溶胀的支架的干燥样品置于清洁的载玻片上,分别在透射光和反射光下测量光学图像。检测CHA支架的其他物理化学性质:包括CHA支架的修饰程度;干燥样品和湿样品的抗压强度;吸水率;扩张率;和孔隙率。第二部分修饰玻璃酸钠组织工程软骨支架在猪软骨缺损动物模型的应用研究2.1建立全层软骨缺损的动物模型本研究使用的动物为12只普通小型猪,体重20±2 kg,年龄4～5个月,由上海南汇老港华兴特种动物饲养中心提供。将实验动物成功麻醉后,固定并常规消毒/铺无菌巾单。在左右肢膝盖上切开2至3厘米（cm）的皮肤切口以露出关节。在股骨髁上制作5.0mm直径的圆柱形软骨缺损。孔之间的距离约为2～3 mm,深度约为3～4 mm。在手术过程中,仔细清理软骨下骨,以避免出血,并确保每个缺损的大小基本相同。手术后,用CHA支架植入右膝,然后恢复关节的正常结构并闭合伤口。同时左膝关节充当对照,只通过外科手术恢复结构并闭合伤口。2.2 CHA支架植入覆盖动物的右膝关节处软骨缺损,在缺损底部和缺损软骨边缘周围涂上薄层纤维蛋白胶（参见产品使用说明）。然后将CHA支架植入缺损部位,用盐水滴润湿,同时用手术刀柄轻轻按压,完成粘合剂的固定。用软组织覆盖缺损部位,复位髌骨,屈曲膝关节将进一步压实植入物。然后打开软组织,脱位髌骨,检查种植体和缺损粘连的边缘,最后进行关节修复和缝合。允许动物自由活动后,使用标准动物饲料和清洁饮用水,室温保持在15-26℃,每日紫外线消毒和术后肌肉注射青霉素,每天早上和下午5万单位,以防止术后感染。2.3术后观察手术后7天内每天进行一次笼外观察,每周一次,详细记录体征、行为活动、流涎、呼吸状况、排尿和切口的局部反应情况。2.4血液学检查在手术后6个月和12个月从动物的静脉采集血样。以3500r/min离心15min,然后使用Hitachi 7180自动生化分析仪进行血清生化检测。2.5病理检查肉眼观察:术后6个月、12个月时,分别取3只动物经1%戊巴比妥钠溶液麻醉后,颈总动脉切开放血处死后取下整个后腿,露出膝关节,大体观察缺损修复情况,包括缺损修复程度,表面平整度,颜色改变;与周围正常软骨的整合情况,边界是否清楚,有无裂隙。关节滑膜是否增生。组织切片:切取以缺损为中心的1.5 cm的修复的软骨表面组织及软骨下骨,采用10%中性福尔马林固24 h以上,10%EDTA脱钙液脱钙30 d,隔日更换脱钙液,乙醇梯度脱水,二甲苯透明,浸蜡,纵向石蜡包埋。5 um切片,按传统方法分别进行染色和番红-O染色,并根据文献进行O’ Driscoll关节软骨组织学评分。2.6生物力学测试将-80℃冷冻保存的缺损修复软骨及正常软骨样品取出,在常温下解冻后进行压痕测试,测量软骨组织的杨氏模量（MPa）,应力松弛时间（s）和蠕变时间（s）。2.7Ⅱ型胶原蛋白检测用直径6 mm的环钻将做完力学测试的软骨修复组织完全切下,同时切下等量的健康软骨组织,切取小部分组织用于Ⅱ型胶原定量测定,剩余部分用于糖氨多糖（GAG）含量的测定。将软骨样品称重,冻干后再确定干重,以确定每毫克组织湿重及干组织中胶原蛋白含量。然后,通过胃蛋白酶消化所获得的沉淀物,直到几乎所有组织碎片都溶解。之后,根据猪胶原蛋白Ⅱ（ColⅡ）Elisa试剂盒的程序,通过ELISA试验检测胶原蛋白含量。2.8糖氨多糖（GAG）含量测定取新鲜的软骨样品称湿重,样品冻干后,称取干重。然后将冻干组织切成小块,于95%酒精中浸泡2-3 h,再移入丙酮液中浸泡2 h,用滤纸包好,在索氏抽脂器中脱脂16 h。将脱脂的样品置80℃干燥4h,粉碎至细粉末状。经酶解沉淀冷冻干燥,即为GAG粗制品。根据猪GAG检测试剂盒Porcineglycosaminoglycan（GAG）Elisa Kit说明书描述的测定方法,测定样品GAG的含量。第三部分促进组织工程软骨支架进行软骨修复的方法和机制研究3.1人类MSC的分离和培养经山东大学第二医院委员会批准人体细胞使用方案,获得所有患者的书面同意书,从山东大学第二医院患者的术后废弃骨组织中采集骨髓细胞。3.2菌落形成试验将总共100个MSC接种到10cm培养皿中并连续培养长达21天。使用结晶紫（0.5%,SIGMA,MO,USA）将形成的菌落染色15分钟,然后在光学显微镜下计数。计数直径大于2mm的菌落。3.3增殖试验通过商业CCK-8试剂盒评估细胞增殖。简而言之,将MSC接种到6孔板中,然后进行各种处理。向每个孔中加入10μlCCK-8溶液,显色反应在37℃下进行15分钟。使用酶标仪记录450nm处的吸收并计算相对细胞存活率。3.4软骨形成测定将MSC在软骨诱导培养基（DMEM,0.2mM抗坏血酸2-磷酸,20%FBS和10mM甘油2-磷酸）中培养14天,每2天更换新鲜培养基。使用Alcian Blue（Millipore,Billerica,MA,USA）染色评估软骨形成。3.5 mRNA提取和实时PCR使用Trizol提取总mRNA,并按照制造商的说明书用SuperscriptII逆转录成互补cDNA,通过real-time PCR在以下条件下进行重复三次的PCR反应:95℃下15秒,60℃下1分钟40次。使用GAPDH作为内参计算相对表达水平。3.6 Western Blot蛋白质印迹在含有 150mMNaCl,50mMTris-HCl,1OmMHEPES,0.1%NP-40 替代物,0.5mMNaF,0.25%Na-脱氧胆酸盐,1mMNa3VO4,pH7.4（蛋白酶抑制剂混合物）的裂解缓冲液中制备细胞再悬浮液。使用BCA蛋白质测定法定量细胞裂解物,然后在SDS-PAGE上运行30μg总蛋白质,然后转移至PVDF膜。随后用1%BSA（牛血清白蛋白）封闭膜,并与一抗4℃孵育过夜。利用HRP缀合的二抗来显现基于ECL成像系统中的条带。3.7酶联免疫吸附试验（ELISA）通过离心完全除去MSC,收集透明培养基用于ELISA分析。使用市售ELISA试剂盒,按照制造商的说明书测量IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的水平。4统计分析使用SPSS22.0系统（IBM,Armonk,NY,USA）分析所有数据,并以平均值土标准偏差（SD）表示。组间差异由学生T检验和单因素方差分析（ANOVA）确定。P值小于0.05被认为具有统计学差异。结果1 CHA支架的物理化学性质物理化学性质的检测表明,CHA支架是一种多孔的海绵状外观,在SEM下孔径为80-150 μm（图1,图2）。如表2所示,CHA支架的修饰程度为（3.10±0.27）%。干燥样品的压缩强度为（14.80±4.06）kPas,湿样品的压缩强度为（0.5762±0.11）kPas（图 3）;吸水率为（58.6±3.5）%,膨胀率为（100.7±4.8）%,孔隙率为（96.5±2.6）%。2.1常规术后观察结果手术后3-5小时,动物基本上从麻醉中恢复。24小时后,动物可以站立,左后肢跛行,食物摄入量和饮用水基本正常。术后15天内,手术部位几乎完全恢复,皮毛发亮。同时,眼睛、鼻子和耳朵周围没有明显分泌物,亦并未发现其他身体部位的创伤和炎症。此外,他们的行为和步态几乎正常,未发现明显的临床不良反应。2.2术后血液学检查术后6个月和12个月评估血液学指标,以明确手术和CHA支架植入对动物机体的整体影响。结果发现,如表3所示,除了个别生化离子和脂质因子外,CHA支架植入组与对照组相比,常规血液检查、肝肾功能检查和生化离子检测以及凝血指标等的大部分结果两组间并无显着差异。更重要的是,在所有研究动物中测得的这些常规血液学因素均在正常的生理波动范围内。2.3病理特征动物膝关节的缺损软骨于术后6个月开始修复,在肉眼观察下可发现,修复逐渐从中央到周围展开。如图1所示,我们发现6个月后CHA支架植入组基本修复了软骨缺损,缺损区与修复区的交界处清晰而紧密,没有裂缝,但修复区域与正常软骨相比略显苍白。然而,对照组缺损区的修复表面是断断续续不规则状,缺损区与修复区域的连接处亦不清楚。于术后12个月时进一步观察发现,CHA支架植入组膝关节修复区软骨表面光滑,颜色与正常软骨相似。修复区域的边缘基本上与正常软骨合并。正常区域和修复区域之间没有明显的界限,与6个月相比,修复程度明显提高。而对照组手术后12个月的软骨表面和边缘与6个月时的观察结果没有显着改善。此外,对手术后6个月和12个月获得的组织进行HE染色,显微镜下进一步观察,结果显示在CHA植入组的动物的软骨表面上可见一些软骨细胞。同时,HE染色显示软骨周围有深蓝色细胞核和红色基质,提示修复了不同程度的纤维组织（图2）。通过番红O染色,我们发现植入组的修复软骨组织的浅层甚至深层在6个月后呈现出轻度、不均匀染色,而对照组的染色则更浅,更加不均匀。此外,植入组修复区域的基质在术后12个月时染色更深,但在对照组中,只有浅层软骨甚至中间层有轻微染色,而且染色呈现不均匀。（图2）根据O’Driscoll关节软骨组织学评分标准,进一步评估了软骨修复后的主要的组织学类型、结构特征、细胞变性和相邻软骨的退行性变化。左右膝关节软骨修复综合评分结果如表4所示,植入组细胞变性和邻近软骨退变均高于对照组,术后6个月和12个月结果一致,提示CHA支架可以减少损伤引起的软骨退变,并可能促进软骨缺损的修复能力。2.4修复软骨的生物力学特性通过杨氏模量、应力松弛时间和蠕变时间评估生物力学性能,其测试在手术后6个月和12个月进行。如表5所示,术后6个月和12个月的杨氏模量、应力松弛时间和蠕变时间所反映的生物力学性能组间存在显着差异。植入支架修复区域的测量值高于对照组修复区域（图3）,更接近正常区域软骨的测量值,表明CHA支架软骨的植入在修复软骨的生物力学性能方面优于手术组。用CHA支架基质植入有利于促进软骨修复并提高其压缩能力。2.5 Ⅱ型胶原蛋白表达如表6所示,组间修复的软骨中Ⅱ型胶原蛋白的表达存在差异。CHA支架植入组Ⅱ型胶原蛋白水平在6个月和12个月时均高于对照组,但两组在6个月时均显着低于正常软骨,而手术后12个月各组之间并未取得显着的统计学差异。我们的结果表明CHA有利于软骨组织中Ⅱ型胶原的积累。然而,软骨的修复在短时间内仍然与正常软骨不同。2.6糖胺聚糖表达为了明确修复的软骨水平,我们进一步评估了糖胺聚糖的表达情况。我们发现在术后6个月和12个月评估的GAG表达组间存在显着差异,GAG在修复的软骨中的表达低于正常软骨。此外,我们发现对照组软骨中GAG含量显着低于实验组（p<0.05）。此外,在手术后6个月和12个月评估CHA支架植入组的GAG表达与正常组间没有显着差异。换句话说,植入CHA支架后修复的软骨中GAG的含量几乎达到正常水平（表7）。这表明CHA有利于刺激修复部位GAG的积累,并且GAG的积累随时间增加。3.1橙皮苷可改善MSCs的自我更新能力橙皮苷的化学结构如图1A所示。在实验中用不同剂量的橙皮苷（0,1,5和10 μM）作用于MSC细胞,并通过集落形成和增殖测定方法评估细胞自我更新能力。经橙皮苷处理后,集落的相对数量和平均大小均显着增加至5μM（图1B,C）。类似地,使用CCK-8测定的细胞活性的方法清楚地证明橙皮苷显着刺激细胞增殖（图1D）。然而,高剂量的橙皮苷（在我们的系统中为10 μM）产生了对集落形成和细胞增殖的轻微抑制（图1B,C,D）。因此,选择5μM的橙皮苷作为本研究中后续实验的最佳剂量,并且据我们所知,这些发现提供了橙皮苷改善患者来源的MSC的干细胞特性,即高增殖、低分化和自我更新能力的第一证据。3.2橙皮苷增强MSC的软骨形成能力接下来,我们试图评估橙皮苷对MSCs软骨形成能力的可能影响。在橙皮苷处理后,在MSC中诱导软骨形成14天。如图2A所示,AlcianBlμe染色显示橙皮苷处理的MSC中的软骨形成显着增加。通过测量特异性软骨形成标记物Sox9在分子水平上进一步证实了这些表型观察,其中橙皮苷处理诱导了 Sox-9的明显上调（图2B）。我们的研究结果清楚地表明,除了自我更新能力,橙皮苷还能增强MSCs的软骨形成能力。3.3橙皮苷抑制促炎细胞因子的分泌促炎细胞因子是先天和后天免疫反应的重要参与者。因此,我们在不使用或使用5μM橙皮苷的情况下分别对MSC进行处理,然后使用ELISA测量培养基中促炎细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的水平。结果清楚地表明,与对照相比,橙皮苷处理抑制了所有上述细胞因子的分泌（图3）。3.4橙皮苷抑制核因子κB（NF-κB）亚基p65的表达为了确定炎症的程度,我们检查了炎症反应中生物标志物的表达,例如NF-κB亚基p65。我们在不使用或使用5μM橙皮苷的情况下分别处理MSC,然后检查对p65表达的影响。我们发现橙皮苷处理显着降低了p65的mRNA和蛋白水平（图4A和4B）,表明橙皮苷能够抑制NF-κB亚基p65的表达。3.5 p65是橙皮苷抑制细胞因子分泌和增强软骨形成所必需的然后我们进一步探讨橙皮苷对p65的抑制作用是否与先前观察到橙皮苷对细胞因子分泌的抑制作用相关。为此,我们在MSC中过表达p65,并证实p65的mRNA和蛋白质水平都大大提高（图5A和5B）。过表达p65能够逆转橙皮苷抑制促炎细胞因子IFN-y,IL-2,IL-4和IL-10的分泌（图6）,表明p65确实是抑制橙皮苷对MSC细胞因子分泌的必要条件。用针对NF-κB亚基p65的siRNA或空白对照转导MSC,然后评估mRNA和p65的蛋白质表达,基质中IFN-y、IL-2、IL-4和IL-10的水平。将转染p65siRNA或空白对照的MSC进行14天的分化诱导,然后评估软骨形成标记物Sox9的mRNA表达,和软骨形成程度。结果证实p65敲除可抑制IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的分泌,并增强MSC的软骨形成（图8）。接下来,我们进一步研究了p65对橙皮苷增强软骨形成的作用。在不存在（对照）或存在5 μM橙皮苷的情况下,在软骨形成诱导后第14天,用空载体对照或p65质粒转染MSC。p65的过表达能够逆转橙皮苷在阿尔新蓝染色（图7A）和Sox9表达（图7B）方面的增强作用,表明p65也是增强橙皮苷对MSC软骨形成所必需的。结论总而言之,CHA支架对软骨修复的影响表明它可能有助于促进缺损软骨的修复,CHA支架植入物可以促进软骨修复的关节修复。CHA支架的植入可以在一定程度上提高修复软骨的抗压缩能力。本研究初步证明了CHA支架在微骨折中的植入有利于软骨的修复和减少损伤引起的软骨退行性变化,但更多的动物仍需要进一步检测以验证其软骨修复效果。当应用于微骨折手术时,CHA支架可以促进软骨修复,并且有望用于软骨组织工程领域。我们目前的研究表明,橙皮苷可作为治疗剂,通过抑制炎症促进软骨组织修复,有效增强人MSCs的软骨形成。
曹婷[3]（2018）在《熊去氧胆酸（UDCA）衍生物的合成及抗肝癌活性研究》文中进行了进一步梳理肝癌是一种在肝脏上形成的恶性肿瘤。我国肝癌的发病率与死亡率占全球总数的一半以上。严峻的形势给我国的社会和医疗带来了沉重的负担。熊去氧胆酸（UDCA）是治疗慢性肝炎,高脂血症,体质性胆管炎,体质性肝硬化和诱发性胆管炎的主要药物。本课题组前期研究发现UDCA的衍生物U12在体内及体外实验中均表现出显着的抗肝癌作用。然而,U12由于其低水溶性,溶血作用及用药剂量大等缺点限制了其成药性。因此,本课题在前期研究的基础上,以UDCA为原料,对U12开展进一步的结构修饰和优化,并探讨构效关系,以期获得更加高效低毒的抗肝癌药物。本课题通过取代反应、酯化反应及酰胺化反应等合成方法,合成A、B两个系列共25个UDCA衍生物,A系列为含有卤素取代的衍生物,B系列为24位酰胺化引入不同基团的衍生物,并对其进行了细胞毒活性的筛选,MTT结果显示:当给药浓度为25μM时,Ua2,Uc1,Uc2和Ue1能够有效抑制肝癌细胞株SMMC-7721和HepG2的生长,抑制率高于U12组的4-8倍。其中,Ua2对正常肝细胞（HL-7702）的细胞毒性低于其他三种化合物。初步构效关系研究表明,羧基α位氢（23位）被卤素取代的衍生物抗肝癌活性提高的同时对正常肝细胞表现出明显的杀伤作用;7位羟基乙酰化后,抗肿瘤活性增强;24位引入含有哌嗪环的基团,对肝癌细胞杀伤活性增强的同时,对正常细胞的杀伤同样增强;当哌嗪环上连有含苯环的取代基时,对肝癌细胞及正常肝细胞细胞的细胞毒性降低;哌嗪环与苯环之间碳链增长,对肝癌细胞及正常肝细胞的杀伤作用降低。因此,24位哌嗪环是重要的活性基团,哌嗪环与苯环之间碳链的长度也是影响抗肝癌活性的重要因素。作用机制研究表明,Ua2可以通过激活caspase信号通路诱导细胞凋亡。Western Blotting蛋白印迹分析表明,Ua2能够以时间和浓度依赖的方式诱导HepG2细胞PARP切割。此外,流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法证实了 Ua2可诱导肝癌细胞（HepG-2）的凋亡。Caspase酶活力检测结果表明:25μmol/LUa2给药处理6h,可激活caspase信号通路。综上所述,Ua2可以通过激活caspase信号通路诱导肿瘤细胞凋亡,且抗肝癌作用强于U12。因此,Ua2有希望成为治疗肝癌的候选先导化合物。
张文政[4]（2018）在《阿德福韦单L-硫代氨基酸酯，单胆酸酯衍生物的设计、合成与生物活性研究》文中研究说明目的针对阿德福韦酯存在剂量依赖性肾毒性、生物利用度低等缺点,依据前药设计理念,结合肠肝循环特性,采用生物电子等排、结构骈合原理,以阿德福韦为先导化合物,设计合成阿德福韦单L-硫代氨基酸酯,单胆酸酯衍生物,拟提高药物在肝细胞中的富集浓度和生物利用度。方法（1）目标化合物的合成:将带有N-Boc-保护的L-氨基酸于-25℃在N-甲基吗啉（NMM）和氯甲酸异丁酯（IBCF）存在条件下通入硫化氢气体,制备N-Boc-L-硫代氨基酸,再将其与1,2-二溴乙烷或1,3-二溴丙烷反应得到N-Boc-L-硫代氨基酸-2-溴乙酯或N-Boc-L-硫代氨基酸-3-溴-1-丙酯。以熊去氧胆酸/去氧胆酸为反应底物,通过与3-溴-1-丙醇在DCC/DMAP存在条件下发生缩合反应,制备熊去氧胆酸-3-溴-1-丙基酯/去氧胆酸-3-溴-1-丙基酯。将上述制备的产物,在N,N’-二环己基-4-吗啉基脒（DCMC）条件下,与阿德福韦通过“一锅合成法”缩合,产物经柱色谱分离纯化得阿德福韦N-Boc-单L-硫代氨基酸酯,单胆酸酯衍生物,经85%磷酸/氯仿体系进行脱Boc处理,得最终化合物阿德福韦单L-硫代氨基酸酯,单胆酸酯衍生物;（2）利用UPLC-MS/MS方法考察了目标化合物在人工胃液、人工肠液、大鼠空白血浆、肝微粒体中的稳定性及代谢规律;（3）采用稳定表达HBV-DNA的HepG 2.2.15细胞系,评价合成的目标化合物体外对HBV-DNA的抑制作用;（4）采用钠离子-牛磺胆酸共转运多肽（Na+/taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP）转染Hek 293细胞考察抗病毒活性较好的化合物在转染细胞中的摄取机制;结果（1）合成阿德福韦单L-硫代氨基酸酯,单胆酸酯衍生物共计16个,总产率为12.6-25.2%,所得目标化合物结构经1H-NMR、13C-NMR、ESI-MS和ESI-HRMS鉴定确证;（2）对受试化合物进行体外稳定性及代谢规律研究,结果显示,受试化合物在人工胃液中稳定性良好,在大鼠空白血浆、大鼠肝微粒体中的稳定性较阿德福韦酯好,半衰期长于阿德福韦酯,在人工肠液中稳定性较阿德福韦酯差,半衰期短于阿德福韦酯,其中化合物6d在肝微粒体中的裂解规律经初步分析,首先经过肝微粒体水解生成阿德福韦单去氧胆酸丙酯衍生物,再进一步水解成为原药阿德福韦;（3）体外抗HBV活性实验结果显示,8个受试化合物（6d,6e,6f,6g,6i,6l,6m,6n）均具有抗HBV活性,其中化合物6d,6i,6l,6m,6n的抗病毒活性及作用选择性指数(EC50 3.9529.41μmol·L-1,SI 89.50454.07)与阳性对照阿德福韦酯(EC50 3.09μmol·L-1,SI 142.04)相当,化合物6l的抗病毒活性最强、作用选择性指数最高(EC50 3.95μmol·L-1,SI 454.07)。（4）通过NTCP转染Hek-293细胞考察了其摄取机制,结果表明所有受试化合物（ADV,6d,6l,6m,6n）在稳定转染HEK 293细胞与未稳定转染HEK 293细胞中的摄取量均随着浓度的增加而增加,在同一浓度下受试化合物（6d,6l,6m,6n）在稳定转染NTCP的HEK293细胞中的摄取量显着高于未转染的HEK 293细胞（P<0.05）;且摄取率为6l>6m>6n>6d;而阳性对照阿德福韦酯在稳定转染HEK 293细胞与未稳定转染HEK 293细胞其摄取率随着浓度的增加未见明显正相线性关系增加;在稳定转染HEK 293细胞与未稳定转染HEK 293细胞中摄取率在统计学上未见明显差异（P≥0.05）;结论首次合成16个未见文献报道的目标化合物,稳定性与代谢机制研究发现目标化合物在酸性条件下稳定性较好,在富含酶的中性、碱性等环境中稳定性较差,其在在肝微粒体酶的作用下先后断裂得阿德福韦,进而发挥抗病毒活性;抗病毒活性测试显示部分化合物具有较高抗HBV活性,其中化合物6l活性最好;摄取机制研究表明目标化合物能够借助于肝细胞膜特异性表达的NTCP实现其肝靶向性富集的特性。
陈何嵩[5]（2017）在《基孔肯雅病毒样颗粒的制备及其特异性IgM检测方法的初步建立》文中认为【背景】基孔肯雅病毒（Chikungunya Virus,CHIKV）属于披膜病毒科甲病毒属,其基因组为单股正链RNA,共编码4种非结构蛋白（Non-structural protein,NSP1-4）和5种结构蛋白:C、E3、E2、6K、E1蛋白,其中E2蛋白是中和抗体的主要靶标。CHIKV是一种蚊媒（埃及伊蚊和白纹伊蚊）传播的病毒,主要引起以发热、皮疹和关节疼痛为主要症状的基孔肯雅热（Chikungunya fever,CHIKF）。最初CHIKV主要流行于非洲和东南亚地区,自2004年以来它在印度洋地区造成了数百万人感染,并逐渐传播到了多个地区,包括欧洲、中东和太平洋等地区。2013年10月CHIKV在西半球首次出现,在短短9个月内,它就已经扩散到中美洲和南美洲的22个国家,造成100多万人感染。CHIKF为自愈性疾病,一般不会造成患者死亡,但由于其对关节的损伤能够导致患者高度虚弱,且通过蚊媒传播易导致该病大流行,使得CHIKV感染已经成为当前最重要的全球性公共卫生问题之一。近年来,我国尚未出现CHIKF的爆发流行,但输入性病例时有发生,同时由于我国广泛分布着白纹伊蚊和埃及伊蚊这两种传播媒介,使得该病在我国爆发流行的可能性较大。因此,关于CHIKF的防治研究有着重要意义。在CHIKV感染的诊断方面,由于病毒血症期短,病毒特异性IgM是早期感染的主要指标。目前,最为准确和常用的方法是利用IgM捕捉酶联免疫吸附法（IgM antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay,Mac-ELISA）检测CHIKV感染早期产生的IgM,此法不受血清标本中IgG、类风湿因子（Rheumatoid factor,RF）及抗核抗体（Antinuclear antibody,ANA）等的干扰。国际上已有利用Mac-ELISA法检测CHIKV感染的商品化试剂盒,但大多使用灭活病毒作为抗原,品质参差不齐,而且存在一定的生物安全风险。而在我国,目前尚未报道有针对CHIKV IgM检测商品化的试剂盒。本研究利用杆状病毒表达系统（Baculovirus expression vector system,BEVS）表达CHIKV病毒样颗粒（Virus like particle,VLP）,然后基于CHIKV VLP初步建立一种Mac-ELISA检测法,为今后研制CHIKV感染的早期诊断试剂盒奠定基础。【方法】设计引物并扩增CHIKV BNI-CHIKV899株的结构蛋白编码基因及E2蛋白编码基因,分别克隆到pFastBac?-Dual转移载体和pFastBac?-His A转移载体中,构建重组转移载体（pFastBac?-Dual-CHIKV和p FastBac?-HisA-E2）并进行酶切鉴定和序列测定;将构建正确的两种重组转移载体转化DH10Bac感受态细胞,进行蓝白斑筛选并提取两种重组杆粒（rBacmid-CHIKV和rBacmid-E2）,利用通用引物M13和特异性引物进行鉴定;将鉴定正确的两种重组杆粒分别转染Sf9（Spodoptera frugiperda 9,Sf9）昆虫细胞制备两种重组杆状病毒（Recombinant baculovirus,rBv）（rBV-CHIKV和rBV-E2）,传代、测定滴度并利用免疫荧光法（Indirect immunefluorescence assay,IFA）鉴定病毒感染后目的蛋白的表达。将rBV-CHIKV感染Sf9细胞,待细胞发生明显的细胞病变效应（Cytopathic effect,CPE）后,通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope,TEM）观察细胞内VLP的形成情况;并通过反复冻融致细胞裂解的方法大量收集胞内的CHIKV VLP,采用蔗糖密度梯度离心法纯化VLP,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western-blot,WB）鉴定CHIKV VLP。将rBV-E2感染Sf9细胞,待细胞发生明显的CPE后,大量收集细胞上清并通过Nickel磁珠吸附方法纯化E2蛋白,利用SDS-PAGE和WB鉴定E2蛋白。将纯化的E2蛋白免疫BALB/c小鼠三次后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤Sp2/0细胞经过PEG1500促进细胞融合后进行杂交瘤细胞的选择性培养,而后利用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）筛选阳性杂交瘤细胞,采用有限稀释法对ELISA筛选出来的阳性杂交瘤细胞进行克隆化,确认得到单克隆的杂交瘤细胞后建系扩大培养。利用rBV-CHIKV感染的Sf9细胞抗原片进行IFA鉴定获得的各单克隆抗体（Monoclonal antibody,mAb）与CHIKV VLP的结合活性,选取活性较好的细胞株进行后续实验。最后将杂交瘤细胞注射入BALB/c小鼠腹腔内进行抗体的大量制备,收集小鼠腹水并利用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化,以得到纯化的抗E2蛋白mAb。通过SDS-PAGE检测抗体纯度,同时以汉滩病毒（Hantaan virus,HTNV）、登革病毒（Dengue virus,DENV）、乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）、Ⅰ型疱疹病毒（Herpes simplex virusⅠ,HSV-1）、Ⅱ型疱疹病毒（Herpes simplex virusⅡ,HSV-2）五种病毒的抗原片进行IFA鉴定抗体的特异性,并利用WB和间接ELISA检测其与CHIKV VLP的结合活性。在上述工作的基础上,初步建立基于CHIKV VLP的IgM捕捉法ELISA（Mac-ELISA）。首先利用抗人IgM抗体（μ链特异性抗体）包被固相载体,作为“捕捉抗体”吸附待检血清中的IgM,再加入CHIKV VLP与“捕捉”到的相应IgM抗体结合,最终利用前面制备的mAb与VLP结合,加入酶标二抗及TMB于450nm波长处测定吸光值。通过VLP与抗体梯度稀释配对的方法对同一阳性血清进行检验,确定VLP及抗体的最适工作浓度;以CHIKF患者血清、肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS）患者血清、乙型脑炎患者血清、正常人血清进行Mac-ELISA检测以检验该法的特异性;连续对两份高OD值阳性血清和低OD值阳性血清重复检测4次以检验该法的重复性。最后以核酸检测确诊的阳性患者和正常人血清为对象,同时利用建立的基于VLP的Mac-ELISA法和商品化的Chikungunya IgM检测试剂盒进行检测,并对两组检测结果进行统计学比较分析。【结果】1.CHIKV VLP及E2蛋白的制备、纯化及鉴定将CHIKV C-E3-E2-6K-E1结构蛋白编码基因及E2蛋白编码基因分别克隆入pFastBac?-Dual-CHIKV及pFastBac?-His A-E2后,利用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切重组转移载体,电泳结果显示,两种载体都切出与目的条带大小相符的条带,测序比对结果显示无核酸突变,表明两种重组转移载体构建成功。对两种重组杆粒的PCR结果显示,均扩增出与预期大小相一致的条带,表明重组杆粒rBacmid-CHIKV及rBacmid-E2构建成功。将两种重组杆粒转染Sf9昆虫细胞后获得了两种rBV（rBV-CHIKV和r BV-E2）,IFA结果显示,两种rBV感染的细胞中均可观察到特异的绿色荧光,而正常Sf9细胞中未观察到特异性荧光,表明两种rBV构建成功。将rBV-CHIKV感染Sf9细胞后,电镜结果显示细胞内可见直径大小约为60-90nm左右的小球形颗粒,直径大小与CHIKV VLP一致。裂解细胞收集的VLP经过蔗糖密度梯度离心后,测得其浓度为1 mg/ml。SDS-PAGE及WB结果显示,检测到与目的蛋白大小相符的特异性条带。将rBV-E2感染Sf9细胞后,收集的上清经过Nickel磁珠纯化,SDS-PAGE和WB检测结果显示,检测到与目的蛋白大小相符的特异性条带。2.抗CHIKV E2蛋白单抗的制备、鉴定纯化后的E2蛋白经过免疫、细胞融合、选择性培养、阳性杂交瘤细胞鉴定及3次亚克隆后,共鉴定得到6株能稳定分泌抗E2蛋白mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为3B1、2B8、4A4、3G9、2H4、2D2。利用rBV-CHIKV感染的Sf9细胞抗原片对各杂交瘤细胞株上清进行IFA筛选,结果提示2H4细胞株分泌的抗体活性较好。收集2H4杂交瘤细胞制备小鼠腹水,纯化后的抗体测得蛋白浓度为10 mg/ml。SDS-PAGE结果显示,纯化的抗体在55 KD和25 KD左右出现两条明显条带,其他杂带较少,证实获得了较高纯度的mAb。IFA鉴定抗体特异性结果显示,除了用rBV-CHIKV感染的Sf9细胞可观察到特异的绿色荧光外,HTNV、DENV、JEV、HSV-1、HSV-2感染细胞的抗原片均未观察到特异荧光,表明该mAb具有较好的特异性。WB检测结果显示,纯化2H4 mAb组在47 KD左右可见明显条带,与E2蛋白大小一致,而阴性对照组无条带,说明2H4 mAb能特异识别CHIKV VLP。间接ELISA结果显示纯化的2H4抗体效价为1:100,000。3.基于VLP的特异性IgM检测方法的初步建立基于上述基础建立Mac-ELISA检测法并优化条件,进行方法评价,结果显示,该检测法在检测按常规的1:100稀释CHIKF患者血清时,当CHIKV VLP的使用浓度为5μg/ml,mAb 2H4使用浓度为20μg/ml时,P/N值高于2.1,区分度最高。进一步以该工作浓度进行特异性和重复性检测,结果显示,利用该法检测HFRS、乙型脑炎患者血清时无交叉反应,证实该方法的特异性较好;连续4次对高OD与低OD值的阳性血清检测结果基本稳定,证实该方法的重复性亦较好。在与商品化试剂盒的对比实验中,当VLP和抗体以最适浓度工作时,利用该法检测10份核酸检测结果为阳性的患者血清,结果有9份血清检测为阳性,检测10份正常人血清的结果均为阴性;商品化的Chikungunya IgM试剂盒检测10份核酸确诊血清的结果均为阳性,检测10份正常人血清结果有9份血清为阴性、1份为弱阳性。统计学对比分析表明两组检测结果并无显着差异,本研究所建立的检测方法的敏感性和特异性与商品化试剂盒基本一致。【结论】本研究通过BEVS表达获得了CHIKV VLP及E2蛋白,并利用纯化的E2蛋白制备筛选了E2蛋白特异性抗体2H4,最终通过CHIKV VLP和2H4抗体初步建立了一种Mac-ELISA检测法,并证实了该法的特异性及重复性均较好,与商品化试剂盒的对比实验也证实该方法的敏感性和特异性与商品化试剂盒基本一致。本研究为CHIKV早期感染的快速诊断提供了一种检测方法,同时为进一步研制CHIKV感染早期快速诊断试剂盒奠定了基础。
李真[6]（2016）在《Hsa-miR-506-3p靶向ERK-2/ETS-1抑制胃癌血管新生及侵袭转移的功能及机制研究》文中研究说明研究背景胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一。尽管近年来,欧美等发达国家胃癌发病率及死亡率显着降低,然而在我国,胃癌仍是发病率高居第四位的常见恶性肿瘤。现中国胃癌年新发病例数已超过四十万,居全球首位,年化死亡率约为恶性肿瘤患者死亡原因的20%。因此,胃癌仍是严重危害我国居民生命健康的重大疾病。侵袭与转移是恶性肿瘤不同于良性肿瘤的主要生物学特征,也是胃癌患者复发及死亡的主要原因。肿瘤细胞侵袭转移是一个多阶段多步骤的发展过程,可经历早期原位癌的生长,肿瘤血管形成,肿瘤细胞变形脱落侵入基质,进入脉管系统,形成微小癌栓,在继发组织器官定位生长并继续转移扩散等。而在肿瘤细胞侵袭转移的过程中,两方面的改变是必需的,一是肿瘤微环境的改变,如肿瘤周围毛细血管新生（Angiogenesis）及细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）的降解与破坏等；另一个则是肿瘤细胞自身的变化,如肿瘤细胞上皮-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）。肿瘤周围毛细血管新生有别于胚胎时期由早期内皮细胞分化形成新血管的过程,是活体组织在已存在的微血管床上以芽生的方式生出新的以毛细血管为主的血管系统的过程。而肿瘤细胞上皮-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）则是肿瘤上皮细胞在多种诱导因素的作用下,失去极性,获得间充质细胞表型,运动及迁移能力增强,易侵入肿瘤周围脉管系统,并逃脱失巢凋亡而发生远处转移。肿瘤周围血管新生与细胞外基质降解为肿瘤细胞营养供给及侵袭转移提供了微环境条件,而肿瘤细胞EMT则为细胞侵袭转移过程中的变形和运动提供了形态学基础。因此,肿瘤周围新生血管形成和肿瘤细胞EMT在肿瘤侵袭转移过程中至关重要。令人关注的是,近期大量研究指出,microRNA在肿瘤细胞侵袭转移进程中发挥不可忽视的调控作用。MicroRNA（微小RNA, miRNA）是长度约18-25bp的内源性非编码小分子RNA。miRNA经大小约70-90个碱基,具有发夹结构的前体pre-miRNA,经Dicer酶切割加工后成熟,可通过与靶mRNA分子的3’非编码区域（3’UTR）完全（植物中常见）或不完全（动物中常见）互补配对,降解mRNA或抑制其蛋白的翻译,进而参与个体发育、细胞增殖、凋亡及转移等多种生命活动的调控。miRNA以其高度的组织特异性、高敏感性、不易降解和易于检测的特征成为肿瘤早期诊断,预后标志物和分子治疗靶标筛选的热点。尤为重要的是,大量研究证实,单个miRNA可通过与多个mRNA的3’UTR结合,在转录后水平调节多个mRNA编码蛋白的表达,同时单个靶蛋白也可被多个miRNAs共同调控,由此形成复杂而精细的调控网络,发挥多种生物学功能。因此,miRNA在胃癌血管形成以及EMT中的作用引起我们的关注。在本研究中,我们发现hsa-miR-506-3p在高侵袭胃癌细胞株中低表达,且低表达hsa-miR-506-3p的胃癌患者预后较差,提示hsa-miR-506-3p具有作为评估胃癌预后的生物标记物的潜能。更为重要的是,差异表达hsa-miR-506-3p可显着改变胃癌细胞诱导血管形成的能力及胃癌细胞侵袭转移。进一步利用在线数据库Targetscan预测分析,我们研究发现：MAP激酶（Mitogen-activated protein kinase, MAPK）通路中的两个关键分子：胞外信号调节激酶2（Extracellular signal-regulated kinase 2, ERK-2）及其下游转录因子ETS-1的mRNA的3’UTR区同时存在hsa-miR-506-3p的结合位点,提示,hsa-miR-506-3p可能靶向作用于ERK-2/ETS-1信号轴,进而抑制其下游相关功能信号转导,在胃癌细胞微环境血管形成及侵袭转移过程中发挥重要的调节作用。值得关注的是,作为与细胞生长关系最为密切的信号转导通路,MAPK通路参与了包含肿瘤细胞在内的多种细胞的病理生理过程的调控,如细胞生长、发育、运动和凋亡等。MAPK是一个庞大的激酶家族,现已知其亚家族成员至少有6个,如ERK、JNK和P38等。其中,胞外信号调节激酶（Extracellular signal-regulated kinase,ERK）是MAPK家族中最为重要的成员之一,是发现于80年代末期的一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。ERK蛋白主要定位于胞浆,是细胞内丝裂原信号传递的关键信号转导蛋白。ERK的活化需一类双向激酶的激活,即其本身的丝氨酸／苏氨酸和酪氨酸同时磷酸化,激活ERK的激酶即MEK（MAPK/ERK kinase, MAPK/ERK激酶）。ERK被激活后,立即发生核移位,继而活化下游信号分子,如转录因子ETS家族蛋白的活性,从而产生相应的生物学效应。ERK-1和ERK-2是ERK家族最为关键的肿瘤细胞生物学行为调节分子。ERK-1与ERK-2具有相似的结构与功能,常以ERK-1/2并称。令人感兴趣的是,新近研究表明,尽管ERK-1与ERK-2具有高度的同源性,但二者的结构与功能仍具有一定的差异。研究显示,ERK-2而非ERK-1参与肿瘤细胞EMT相关过程的调控。ETS-1是ERK-2下游关键的转录因子之一,是最早发现的高度保守的ETS家族成员。ETS-1在处于血管发育期间的分化或迁移的内皮细胞、神经嵴细胞和侵袭性肿瘤细胞中表达丰富,参与血管内皮细胞迁移能力的调控。并且,在高表达ETS-1的肿瘤组织中,肿瘤微血管密度显着增加,提示ETS-1是肿瘤新生血管形成的重要调节因素。深入研究显示,ETS-1可在转录水平调控血管内皮生长因子受体VEGFR的表达,进而调节VEGFR介导的血管内皮细胞的增殖、募集以及血管通透性等。因此,ETS-1是血管内皮细胞生长、迁移的关键调控因子。另一方面,在肿瘤细胞血管新生及侵袭转移过程中,细胞外基质（Extracellular ma-trix, ECM）的降解与破坏,是肿瘤细胞侵入脉管系统的必要条件,基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase, MMP）在其过程中发挥关键性作用。研究显示,当新的毛细血管网围成环状及新合成的细胞外基质成分沉积、铺垫后,血管环前段新合成的基膜就开始了MMPs所介导的蛋白水解过程,内皮细胞迁徙将开始于局部水解,形成一个新的毛细血管芽,随后又经历了一系列细胞外蛋白水解酶的活化与抑制的动态循环。现已知的基质金属蛋白酶家族包括26种蛋白亚型,编号MMP1～MMP29。其中,MMP-9为MMP家族的最为重要的成员之一,由结缔组织细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞等以前酶原形式表达和分泌,其氨基酸序列具有活性前区、催化基团、与细胞外基质同源序列区域和C-末端区,转录调节是MMP-9表达最主要的调节方式。新近研究发现,MMP-9启动子区存在ETS-1结合位点,提示ETS-1参与MMP-9转录调控。更为重要的是,MMP-9介导的细胞外基质降解不仅可以促进肿瘤血管形成,还可通过分解和释放生物活化分子刺激肿瘤细胞浸润,妨碍免疫监视,诱导肿瘤细胞侵袭转移相关过程。MMP-9可通过降解细胞外间质和基底膜而促进肿瘤周围血管形成,同时促进肿瘤侵袭和转移。以上研究提示：ETS-1/MMP-9在肿瘤血管形成和细胞EMT过程中发挥至关重要的作用。综合上述研究进展,我们推测,ERK-2/ETS-1/MMP-9相关信号通路在肿瘤血管形成及肿瘤细胞侵袭转移过程中具有重要的调控作用。因此,靶向抑制ERK-2与ETS-1是抑制肿瘤细胞侵袭转移的关键措施。如前所述,miRNA具有高度的组织特异性和敏感性,且不易降解和易于检测,是肿瘤标志物与靶向治疗的最佳候选分子,重要的是,单个miRNA可同时与多个靶mRNA的3’UTR区结合,在转录后水平调节多种靶蛋白的表达,全面地调控肿瘤细胞生物学功能。因此,同时靶向ERK-2和ETS-1的miRNA引起我们的关注。利用在线数据库Targetscan预测分析,我们研究发现：胞外信号调节激酶2（ERK-2）及其下游转录因子ETS-1的mRNA的3’UTR区均存在hsa-miR-506-3p的结合位点,提示,hsa-miR-506-3p可能靶向作用于ERK-2/ETS-1信号轴,更大程度地调节其下游相关功能信号转导。更为重要的是,hsa-miR-506-3p在晚期胃癌患者组织中低表达,提示hsa-miR-506-3p具有作为评估胃癌预后的生物标记物的潜能。因此我们推测hsa-miR-506-3p可能通过靶向作用于ERK-2/ETS-1相关信号转导通路,抑制MMP-9的表达,进而调控胃癌周围血管形成以及肿瘤细胞EMT,在胃癌细胞的侵袭转移过程中发挥重要的调节作用。研究目的1、在临床组织水平,以良性胃肿瘤病变组织远端正常组织为对照,探究hsa-miR-506-3p在各期临床胃癌患者组织样本中的表达情况及与患者预后的关系,为研究hsa-miR-506-3p在胃癌中的作用机制提供临床证据；2、在细胞水平明确hsa-miR-506-3p在胃癌周围血管新生及肿瘤细胞EMT中的生物学功能,为进一步探讨hsa-miR-506在胃癌中的作用及机制提供实验依据；3、分析并验证hsa-miR-506-3p下游直接作用靶点,探讨hsa-miR-506-3p在胃癌侵袭转移中的作用机制。方法与结果第一章Hsa-miR-506-3p在晚期胃癌患者中表达降低且与患者预后显着相关方法1、收集胃腺癌组织标本及良性胃肿瘤远端10cm以外的正常胃组织样本。因胃癌组织学分型复杂,WHO（2000年）分类法将其分为：腺癌（肠型和弥漫型）、乳头状腺癌、管状腺癌、粘膜腺癌、印戒细胞癌、腺鳞癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、未分化癌和其他,其中,腺癌是胃癌最常见的病理组织类型。因此,我们选择胃腺癌患者为研究对象。2、利用Real-time PCR技术,对比检测hsa-miR-506-3p在正常胃组织及各期胃癌患者组织中的表达情况,并统计分析各组表达差异。3、结合亚组分析及生存期随访,在临床水平上验证hsa-miR-506-3p在胃癌分期及患者预后中的作用。4、利用Real-time PCR检测hsa-miR-506-3p在7株胃癌细胞系（BGC-823、 AGS、HGC-27、KatoⅢ、SGC-7901、MKN45及MGC-803）中的基础表达量,并检测各细胞系基本侵袭能力,以选择细胞进行后续生物学功能实验。结果1、为了检测hsa-miR-506-3p在临床各期胃腺癌患者中的表达水平,我们利用Real-time PCR技术对109例胃癌组织标本中hsa-miR-506-3p的表达情况进行检查,以8例良性胃部病变的远端正常组织标本为对照,以U6为内参,检测发现,hsa-miR-506-3p在胃癌组织中的表达显着低于胃正常组织,差异具有统计学意义（p<0.001）。2、结合临床亚组统计分析发现,hsa-miR-506-3p在胃癌组织中的表达情况随着患者AJCC临床分期的进展逐步降低,且差异具有显着性（p<0.001）,同时,hsa-miR-506-3p的表达同胃癌患者TNM分期中T分期（p=0.041）及N分期（p=0.024）显着相关,提示hsa-miR-506-3p可能参与胃癌的恶性进展与淋巴结转移的调控。3、更为重要的是,生存期随访结果显示,hsa-miR-506-3p高表达（hsa-miR-506-3p表达量高于均值）的胃癌患者生存期显着优于hsa-miR-506-3p低表达（hsa-miR-506-3p表达量高于均值）的患者,差异具有统计学意义（p<0.05）,提示hsa-miR-506-3p是评价胃腺癌患者预后的候选分子标志物。4、Hsa-miR-506-3p在胃癌细胞系BGC-823、AGS、HGC-27、KatoⅢ、SGC-7901、MKN45及MGC-803中表达均显着低于正常胃组织细胞（p<0.001）,且与细胞侵袭能力密切相关。Hsa-miR-506-3p在BGC-823细胞中相对高表达,在SGC-7901细胞中相对低表达,因此选择BGC-823细胞进行hsa-miR-506-3p敲减功能实验,选择SGC-7901细胞进行Hsa-miR-506-3p过表达功能实验。第二章Hsa-miR-506-3p抑制胃癌细胞周围血管新生及胃癌细胞侵袭转移方法1、利用hsa-miR-506-3p mimics质粒,转染低表达hsa-miR-506-3p的胃腺癌细胞SGC-7901；利用hsa-miR-506-3p inhibitor质粒,转染高表达hsa-miR-506-3p的胃腺癌细胞BGC-823。2、通过鸡胚尿囊绒毛膜血管形成实验及体外小管形成试验研究hsa-miR-506-3p在肿瘤血管新生中的作用。3、明胶酶谱法分别检测过表达或抑制hsa-miR-506-3p后,胃癌细胞中,基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达情况。4、利用Boyden侵袭实验,划痕实验及3D细胞培养技术,探究hsa-miR-506-3p对胃癌细胞中的侵袭转移能力,及伪足形成能力等的作用。5、Western blot法分别检测过表达或抑制hsa-miR-506-3p后,胃癌细胞中上皮相关标记蛋白E-cadherin、α-catenin,以及间质标记蛋白N-cadherin、Vimentin表达情况。结果1、在相对低表达hsa-miR-506-3p的胃腺癌细胞SGC-7901中,导入hsa-miR-506-3p mimics质粒,建立过表达hsa-miR-506-3p的瞬转细胞（SGC-7901-miR506OE）;在相对高表达hsa-miR-506-3p的胃腺癌细胞中BGC-823中,转染hsa-miR-506 inhibitor质粒,建立低表达hsa-miR-506-3p的瞬转细胞（BGC-823-miR506KD）.2、肿瘤周围血管形成是肿瘤细胞恶性进展重要的微环境基础,通过鸡胚尿囊绒毛膜血管形成实验及体外小管形成实验发现,导入hsa-miR-506-3p后,胃腺癌细胞SGC-7901-miR506OE在鸡胚尿囊绒毛膜中诱导新生血管量显着减少,且诱导内皮细胞成管率显着降低,差异具有统计学意义（p<0.001）；敲减hsa-miR-506-3p的胃腺癌细胞BGC-823-miR506KD在鸡胚尿囊绒毛膜中诱导新生血管量增加,且诱导内皮细胞成管率显着提高,差异具有统计学意义（p<0.001）。提示,内源性hsa-miR-506-3p可抑制胃腺癌细胞诱导的周围血管新生。3、通过明胶酶谱法检测发现,过表达hsa-miR-506-3p后,胃腺癌细胞SGC-7901-miR506OE中,基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的表达量降低；而抑制hsa-miR-506-3p后,胃癌细胞BGC-823-miR506KD中,基质金属蛋白酶MMP2、 MMP9的升高,提示hsa-miR-506-3p可通过抑制MMP2与MMP9蛋白活性参与肿瘤细胞微环境的调节。4、通过Boyden侵袭实验,划痕实验及3D细胞培养技术实验发现,导入hsa-miR-506-3p的胃腺癌细胞SGC-7901-miR506OE伪足形成率显着降低,细胞侵袭及转移能力显着下降,差异具有统计学意义（p<0.001）；而敲减hsa-miR-506-3p的胃腺癌细胞BGC-823-miR506KD,细胞伪足形成率显着提高,侵袭转移能力增强,差异具有统计学意义（p<0.001）。5、通过Western blot检测发现,过表达hsa-miR-506-3p后,胃癌细胞SGC-7901-miR506OE中,上皮相关标记蛋白E-cadherin、α-catenin表达上调,间质标记蛋白N-cadherin、Vimentin表达下调；而抑制hsa-miR-506-3p表达后,胃癌细胞BGC-823-miR506KD中,上皮相关标记蛋白E-cadhern、α-catenin表达降低,间质标记蛋白N-cadherin、Vimentin表达升高。提示,hsa-miR-506-3p可通过抑制肿瘤细胞EMT,抑制细胞侵袭与转移。第三章Hsa-miR-506-3p靶向调节ERK-2/ETS-1相关信号转导抑制胃癌细胞侵袭与转移方法1、利用Targetscan数据库（http://www.targetscan.org, last accessed May 20, 2015）分析,结合功能学实验,寻找hsa-miR-506-3p作用靶点及相关信号通路。2、利用荧光素酶报道基因系统、Western blot进一步检测hsa-miR-506-3p调控的靶基因及相关信息通路。3、利用免疫组织化学及临床参数分析,检测hsa-miR-506-3p下游关键靶基因ETS-1在胃癌组织中的表达情况及与临床各参数间的相关性,并进一步探讨ETS-1与MMP9在胃癌临床病理样本中表达的相关性。结果1、利用Targetscan数据库预测分析,MAPK通路中的关键信号转导蛋白ERK-2及其下游转录因子ETS-1的mRNA的3’UTR区均存在hsa-miR-506-3p结合位点。2、Western blot验证发现,敲减hsa-miR-506-3p后,胃腺癌细胞BGC-823-miR506KD中ERK-2及ETS-1表达均上调,而导入hsa-miR-506-3p,胃腺癌细胞SGC-7901-miR506OE中ERK-2及ETS-1表达降低。3.荧光素酶活性检测发现,在胃腺癌细胞BGC-823中,利用inhibitor抑制hsa-miR-506-3p表达,ERK-2与ETS-1的3’UTR区荧光素酶的活性显着增强,差异具有统计学意义（P<0.05）；在胃腺癌细胞SGC-7901中导入hsa-miR-506-3p mimics后,ERK-2与ETS-1的3’UTR区荧光素酶的活性同阴性对照组相比显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）；更重要的是,将hsa-miR-506-3p与ERK-2与ETS-1的3’UTR区结合位点进行突变,即导入hsa-miR-506-3p mut后,ERK-2与ETS-1的3’UTR区荧光素酶的活性与阴性对照均无显着差异（P>0.05）。以上数据提示,hsa-miR-506-3p与ERK-2和ETS-1的3’UTR区均存在特异性结合。4、因ETS-1为已知的ERK-2下游信号因子,且与ERK-2同为hsa-miR-506-3p的功能靶点,因此,其在胃癌组织中的表达情况引起我们的关注。同时,前期研究表明,基质金属蛋白酶MMP9为ETS-1的靶基因,因此,ETS-1及MMP9在胃癌组织中的表达情况及其相关性同样值得探究。利用免疫组织化学检测方法,通过对173例胃癌组织标本检测发现,ETS-1在胃癌组织中的广泛高表达,阳性率为71.10%。结合统计学分析发现,在胃癌组织中ETS-1的表达与MMP9的具有高度的相关性（r=0.459,P<0.001）,提示,在胃癌组织中ETS-1可能通过调节MMP9促进胃癌细胞侵袭转移。结论1.Hsa-miR-506-3p可作为候选生物标记物,预测胃腺癌患者预后。2.Hsa-miR-506-3p可通过靶向调控ERK-2及ETS-1相关信号转导通路,抑制基质金属蛋白酶MMP9的表达,抑制胃癌肿瘤新生血管形成及胃癌细胞EMT,进而抑制胃癌细胞的侵袭与转移。
付晓磊[7]（2015）在《脱氧胆酸衍生物的合成、表征及其抗癌活性研究》文中研究指明脱氧胆酸又名去氧胆酸,属于三萜类有机化合物,在自然界中分布广泛,并显示出多种生物活性,如:治疗肝病和胆结石、抑菌、抗疟、抗血管生成等,尤以其防癌、抗癌作用受到重视。目前大多数抗癌药物都对肝脏有不同程度的损伤。癌症的化学治疗尚缺少一种即能够抗癌、又能够保护正常肝细胞的药物,而脱氧胆酸则有望弥补这一缺陷。科学工作者在药物筛选中获得了不少活性较好的胆酸类化合物及其衍生物,但对脱氧胆酸的关注较少。因此,我们在脱氧胆酸的结构中引入氨基酸和部分杂环化合物,以期得到抗癌活性好、生物利用度高、副作用少的脱氧胆酸衍生物。本论文的研究主要分为三部分:第一部分:对脱氧胆酸等胆酸类化合物及其衍生物进行了综述,列举了其药理作用及在分子识别和高分子材料化学方面的应用,并展望了发展前景;第二部分:脱氧胆酸氨基酸、部分杂环化合物衍生物的设计、合成与表征,共设计合成了40种新化合物,具体如下:1.对脱氧胆酸C-24位羧基进行甲酯化,然后将脱氧胆酸C-3位羟基与氨基被N-芴甲氧羰基（Fmoc）保护的7种氨基酸的羧基偶联,去掉Fmoc保护基,得到14种氨基酸衍生物（DA-2（ag）、DA-3（ag））;2.将脱氧胆酸甲酯C-3位羟基进行保护,再将酯基还原成醇,然后与氨基被Fmoc保护的7种氨基酸的羧基偶联,去掉Fmoc保护基,得到16种氨基酸衍生物（DA-45、DA-6（ag）、DA-7（ag））;3.在脱氧胆酸甲酯C-3位羟基引入丁二酸连接片段,与N-叔丁氧羰基哌嗪和吗啉偶联,去掉哌嗪的Boc保护基,得到4种杂环化合物衍生物（DA-8、9（ab）、10）;4.将脱氧胆酸甲酯C-3位羟基转化为甲磺酰氧基后再转化为叠氮基,得到2种脱氧胆酸衍生物（DA-1112）;5.在将脱氧胆酸甲酯C-3位羟基进行保护后,使其酯基还原为羧基,或使其C-12位羟基氧化为羰基,然后将羰基化产物的酯基还原为羧基,或直接去掉C-3位羟基保护基,得到4种脱氧胆酸衍生物（DA-1316）;采用IR、1H NMR及13C NMR等波谱技术对合成的40种新化合物进行了结构表征。第三部分:对所合成的所有目标化合物进行了抗癌活性研究。结果发现:化合物DA-3a、DA-3g、DA-12对MCF-7和Hela细胞株均表现出抑制作用,化合物DA-7a、DA-8、DA-16显示出对Hela细胞的抑制活性。
刘天宇[8]（2014）在《喜树碱-20（s）-O-甘氨酸酯-[N-（3’α,12’α-二羟基-24’-羰基-5’β-胆酸）]进入肝癌细胞SMMC-7721的运输机制及致死机制的研究》文中研究表明本文首先利用MTT实验方法对本课题组已经合成的喜树碱—去氧胆酸偶联物进行体外抗肿瘤活性的筛选。实验结果表明喜树碱-20（s）-O-甘氨酸酯-[N-（3’α,12’α-二羟基-24’-羰基-5’β-胆酸）]（本文中简称A2）对人肝癌细胞系SMMC-7721表现出很强的体外致死能力,但是与对SMMC-7721细胞相比,A2对人结肠癌细胞系HCT-116和人乳腺癌细胞系MCF-7的体外致死能力明显降低,尤其对MCF-7的致死能力非常弱。10-（3’α,12’α-二羟基-5’β-胆酸-24’-羰基）-（20s）-喜树碱（本文中简称C2）对上述三种肿瘤细胞的体外致死能力都比较低,尤其是对SMMC-7721细胞的致死能力最弱。10-O-（3-O-（3’α,12’α-二羟基-24’-羰基-5’β胆酸）—丙烷基）-（20s）-喜树碱（本文中简称D2）对三种肿瘤细胞都有非常强的体外致死能力。由此可见A2是唯一一个有选择性的致死肝癌细胞SMMC-7721 的喜树碱—去氧胆酸偶联物,暗示 A2 可能具有良好的肝癌靶向应用方面的潜力。本研究首先通过激光共聚焦显微镜观察经吖啶橙（AO）染色的细胞,发现被A2作用的SMMC-7721细胞出现了明显的凋亡形态特征。用流式细胞仪检测Annexin V-FITC/PI染色的细胞,发现凋亡细胞的数量随着A2浓度的升高而增多。由此可见A2诱导SMMC-7721细胞凋亡并且表现出浓度依赖性。为研究A2进入SMMC-7721细胞的运输机制,本实验首先通过qRT-PCR技术检测A2对SMMC-7721细胞中有机阴离子转运多肽（OATPs）表达的影响,发现A2可以明显的选择性上调OATP1B3的表达量,说明A2与OATP1B3的关系紧密,OATP1B3可能参与A2的运输。随后利用药物摄取实验发现A2进入SMMC-7721细胞内的过程是依靠主动运输,协助扩散和自由扩散方式共同完成的。并且通过加入利福平和去氧胆酸等运输抑制剂证明A2的运输方式与去氧胆酸相似,并且A2通过载体的运输主要是依靠OATP1B3介导的。通过流式细胞仪对A2处理的SMMC-7721细胞进行周期分布检测发现A2使细胞周期明显的阻滞在S期和G2/M期。因此A2阻止了 SMMC-7721细胞的正常有丝分裂增殖。通过Western Blot实验发现A2使SMMC-7721细胞内的许多凋亡相关因子的蛋白表达量发生明显变化。Bak明显的被A2上调,procaspase9和procaspase3表达量被A2下调,但是不明显。AIF前体蛋白表达量被上调,并且出现了释放到细胞质中的57KD的AIF。以上结果表明A2诱导SMMC-7721细胞凋亡通过线粒体凋亡途径。
杨声坪[9]（2014）在《深低温冻存大鼠同种异体皮肤移植中转化生长因子-β1的表达》文中认为背景：皮肤移植和创面覆盖是创伤、烧伤治疗的重要措施。自体皮肤移植须以牺牲部分正常组织造成二次伤害为代价,而异体皮肤的应用却存在着免疫排斥反应和皮肤的长期保存的局限性。深低温冻存有望对这些局限性进行改进。目的：通过检测转化生长因子β1在深低温冻存后的大鼠同种异体皮肤移植术后的表达,研究大鼠同种异体预处理皮肤移植的相容性,评估深低温冻存同种异体皮在创面上的应用可行性。方法：以随机数字表法将42只SD大鼠随机分为低温（-20℃）保存组（N=18）、深低温（-80℃）保存组（N=18）及自体移植组（N=6）,实验组分别分为3个亚组（n=6）,取异体皮肤分别冻存1周、1个月、2个月,分别移植于同种大鼠背部进行实验。对照组行自体皮片回植。于不同时间点（3天、7天、10天及20天）取移植皮标本进行检测。结果：不同组间具有基线可比性。相比低温组,深低温冻存组大鼠皮肤排斥反应出现时间延迟、皮肤存活时间较长、排斥反应程度较轻,TGF-β1表达水平较低。说明深低温冻存可减轻免疫排斥反应。结论：深低温冻存的异体皮作为一种创面临时覆盖物,可降低免疫排斥反应,在存在皮肤组织缺失或皮源不足的情况下具有广阔的应用前景。
曹立颖,丁轩玺,杨声坪,王冠,姜明静,张玉兰,王建民[10]（2013）在《深低温冻存同种异体皮肤移植中转化生长因子β1的表达》文中研究指明背景:皮肤移植和创面覆盖是创伤、烧伤治疗的重要措施。目前,同种异体皮仍然是可利用的最佳创面覆盖物。目的:通过检测转化生长因子β1在深低温冻存后的大鼠同种异体皮肤移植后的表达,评估深低温贮存同种异体皮在创面上的应用。方法:取大鼠皮肤保存于低温-20℃（低温保存组）及-80℃深低温（深低温保存组）,冻存1周、1,2个月后,皮片分组移植于同种大鼠背部进行实验,并以自体移植大鼠作为对照组。结果与结论:同低温保存组相比,深低温保存组转化生长因子β1的表达被抑制,移植皮肤排斥反应出现时间延迟及存活时间延长,排斥反应评分也较低。同低温冻存相比,深低温冷冻保存能使同种异体移植物的转化生长因子β1抗原表达降低。提示深低温冻存的异体皮作为一种创面临时覆盖物,在存在皮肤组织缺失或皮源不足的情况下具有广阔的应用前景。
二、NCX-1000的新合成方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、NCX-1000的新合成方法（论文提纲范文）
（1）RGD-transTat抑制新生血管生成活性的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一章 前言 |
| 1 血管生成 |
| 1.1 病理性血管生成的的过程 |
| 1.2 血管生成的分子机制 |
| 1.2.1 促血管生成因子 |
| 1.2.2 血管生成抑制因子 |
| 2 Tat |
| 2.1 Tat的发现及其介导细胞内转运的机制 |
| 2.2 Tat的应用 |
| 2.2.1 蛋白质转运 |
| 2.2.2 抗体转运 |
| 2.2.3 小分子的转运 |
| 2.2.4 脂质体的转运 |
| 2.2.5 其它应用 |
| 3 RGD |
| 3.1 整合素 |
| 3.2 RGD |
| 3.2.1 RGD在抗肿瘤治疗中的应用 |
| 4 碳端规则(C-end rule,CendR) |
| 4.1 神经纤毛蛋白1(neuropilin1,NRP1) |
| 4.1.1 NRP-1作为抑制新生血管生成靶点 |
| 4.2 CendR |
| 4.3 NRP1与CendR |
| 4 本课题的研究内容、研究目的和设计思路 |
| 5 本课题拟解决的关键问题 |
| 第二章 TransTat与Tat穿膜能力的对比探究 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 试剂与材料 |
| 1.3 培养基及常用溶液的配制方法 |
| 1.4 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 FITC-transTat、FITC-Tat的固相合成 |
| 2.2 TransTat和Tat的穿膜能力的测定 |
| 2.3 流式细胞术检测HUVEC对TransTat、Tat的摄取率 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 FITC-transTat、FITC-Tat的固相合成与表征 |
| 3.2 TransTat和Tat的穿膜能力 |
| 3.3 HUVEC对TransTat、Tat的摄取率 |
| 4 结论与讨论 |
| 第三章 RGDtransTat、transTatRGD抑制新生血管生成活性评价 |
| 1 材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 试剂与材料 |
| 1.3 常用溶液的配制方法 |
| 1.4 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 Tat、transTat、RGD、RGDtransTat和transTatRGD的固相合成 |
| 2.2 CCK-8法测定RGDtransTat、transTatRGD对HUVEC细胞增殖的影响 |
| 2.3 RGDtransTat、transTatRGD对HUVEC迁移的影响 |
| 2.4 RGDtransTat、transTatRGD对HUVEC体外成管的影响 |
| 2.5 鸡胚尿囊膜模型测定RGDtransTat、transTatRGD抑制新生血管生成的活性研究 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Tat、transTat、RGD、RGDtransTat和transTatRGD的固相合成与表征 |
| 3.2 CCK-8法测定RGDtransTat、transTatRGD对HUVEC细胞增殖的影响 |
| 3.3 划痕实验测定RGDtransTat、transTatRGD对HUVEC迁移的影响 |
| 3.4 RGDtransTat、transTatRGD对HUVEC体外成管的影响 |
| 3.5 鸡胚尿囊膜模型测定RGDtransTat、transTatRGD抑制新生血管生成的活性研究 |
| 4 结论与讨论 |
| 第四章 RGDtransTat、transTatRGD与NRP1、整合素αvβ3的结合能力 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂与材料 |
| 1.2 常用溶液配制 |
| 1.3 仪器设备 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 FITC-RGD、FITC-RGDtransTat和FITC-transTatRGD的固相合成与表征 |
| 2.2 HUVEC对Tat、transTat、RGD、RGDtransTat和TransTatRGD的摄取率 |
| 2.3 激光共聚焦检测RGDtransTat、transTatRGD与NRP-1、整合素αvβ3在HUVEC细胞上的共定位 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 FITC-RGD、FITC-RGDtransTat和FITC-TransTatRGD的固相合成与表征 |
| 3.2 HUVEC对Tat、transTat、RGD、RGDtransTat和transTatRGD的摄取率 |
| 3.3 激光共聚焦显微镜检测RGDtransTat、transTatRGD与NRP-1、整合素αvβ3在HUVEC细胞上的共定位 |
| 4 结论与讨论 |
| 总结与展望 |
| 1 全文结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）修饰玻璃酸钠组织工程软骨支架的制备及应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分: 修饰玻璃酸钠制备组织工程软骨支架材料及其理化性质的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第二部分: 修饰玻璃酸钠组织工程软骨支架在猪软骨缺损动物模型的应用研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附表 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第三部分: 促进组织工程软骨支架进行软骨修复的方法和机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 限制性 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的学术成果 |
| 外文论着一 |
| Abstracts |
| Introduction |
| Methods |
| Results |
| Discussion |
| Conclusion |
| Figure legends |
| References |
| 外文论着二 |
| Abstract |
| Introduction |
| Materials and methods |
| Results |
| Discusson |
| Conclusion |
| Reference： |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（3）熊去氧胆酸（UDCA）衍生物的合成及抗肝癌活性研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章、前言 |
| 1.1 肝癌的研究现状 |
| 1.1.1 肝癌的现状 |
| 1.1.2 肝癌的治疗策略 |
| 1.2 熊去氧胆酸及其衍生物在治疗肝病领域的研究 |
| 1.2.1 熊去氧胆酸研究概况 |
| 1.2.2 熊去氧胆酸衍生物药理活性研究概况 |
| 1.3 立题依据 |
| 第二章、熊去氧胆酸衍生物的合成研究 |
| 2.1 仪器及试剂 |
| 2.1.1 实验仪器 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.2 熊去氧胆酸衍生物的设计 |
| 2.3 实验部分 |
| 2.3.1 中间体U-I的合成 |
| 2.3.2 化合物A系列的合成 |
| 2.3.3 化合物B系列的合成 |
| 2.3.4 化合物名称、分子式及结构 |
| 2.4 本章总结 |
| 第三章、熊去氧胆酸衍生物抗肝癌活性筛选与初步作用机制研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 主要溶液 |
| 3.1.4 细胞株 |
| 3.2 熊去氧胆酸衍生物对正常肝细胞及肝癌细胞的细胞毒性研究 |
| 3.2.1 实验方法 |
| 3.2.3 实验结果 |
| 3.3. Ua2激活凋亡信号通路 |
| 3.3.1 流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 3.3.2 蛋白印迹法(Western Bloting)检测PARP蛋白 |
| 3.3.3 Ua2激活caspase信号通路诱导凋亡 |
| 3.4 动物实验——Ua2安全性初步评价 |
| 3.4.1 实验方法 |
| 3.4.2 实验结果 |
| 第四章 总结与讨论 |
| 4.1 小结与讨论 |
| 4.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）阿德福韦单L-硫代氨基酸酯，单胆酸酯衍生物的设计、合成与生物活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文对照缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 目标化合物的设计 |
| 1 前药设计策略 |
| 2 前期工作基础 |
| 3 阿德福韦单L-硫代氨基酸酯,单胆酸酯的设计 |
| 第二章 目标化合物的合成研究 |
| 1 仪器与试剂 |
| 2 中间体产物的合成 |
| 3 阿德福韦单L-硫代氨基酸酯,单胆酸酯的合成 |
| 4 结果与讨论 |
| 第三章 目标化合物体外稳定性及代谢研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 目标化合物抗HBV活性研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第五章 目标化合物NTCP细胞转染摄取机制体研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第六章 论文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 学位论文数据集 |
（5）基孔肯雅病毒样颗粒的制备及其特异性IgM检测方法的初步建立（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献回顾 |
| 第一部分 CHIKV VLP及E2蛋白的制备、纯化及鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌种、载体 |
| 1.2 细胞 |
| 1.3 试剂 |
| 1.4 抗体 |
| 1.5 培养基与缓冲液 |
| 1.6 实验仪器与器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 含CHIKV C-E3-E2-6K-E1结构蛋白及E2蛋白编码基因的rBV的制备 |
| 2.2 CHIKV VLP及E2蛋白的制备、纯化及鉴定 |
| 3 结果 |
| 3.1 含CHIKV C-E3-E2-6K-E1结构蛋白及E2蛋白编码基因的rBV的制备结果 |
| 3.2 CHIKV VLP及E2蛋白的制备、纯化及鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 抗CHIKV E2蛋白单克隆抗体的制备、鉴定以及基于VLP的特异性IgM检测方法的初步建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物和细胞 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 血清和抗体 |
| 1.4 培养基与缓冲液 |
| 1.5 实验仪器与器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 抗CHIKV E2蛋白mAb的制备、鉴定 |
| 2.2 基于VLP的特异性IgM检测方法的初步建立 |
| 3 结果 |
| 3.1 抗CHIKV E2蛋白mAb制备的结果 |
| 3.2 基于VLP的特异性IgM检测方法的建立结果 |
| 4 讨论 |
| 小结 |
| 1.CHIKV VLP及E2蛋白的表达、纯化及鉴定 |
| 2.CHIKV E2蛋白单克隆抗体的制备以及基于VLP的特异性IgM检测法的建立 |
| 参考文献 |
| 个人简历和研究成果 |
| 致谢 |
（6）Hsa-miR-506-3p靶向ERK-2/ETS-1抑制胃癌血管新生及侵袭转移的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 Hsa-miR-506-3p在晚期胃癌患者中表达降低且与患者预后显着相关 |
| 研究背景 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 Hsa-miR-506-3p通过抑制胃癌细胞周围血管新生及胃癌细胞EMT抑制胃癌侵袭与转移 |
| 研究背景 |
| 第一节 Hsa-miR-506-3p抑制胃癌细胞诱导的周围血管新生 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 第二节 Hsa-miR-506-3p通过抑制胃癌细胞上皮-间充质转化(EMT)抑制胃癌细胞侵袭与转移 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 Hsa-miR-506-3p靶向抑制ERK-2/ETS-1调控MMP9抑制胃癌细胞侵袭与转移 |
| 研究背景 |
| 一、材料与方法 |
| 二、实验结果 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 中英文缩略词表 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（7）脱氧胆酸衍生物的合成、表征及其抗癌活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 胆酸类化合物及其衍生物的概述 |
| 1.2 胆酸类化合物及其衍生物的药理活性 |
| 1.2.1 预防及治疗胆结石 |
| 1.2.2 治疗肝病 |
| 1.2.3 抑菌活性 |
| 1.2.4 抗疟活性 |
| 1.2.5 抗血管生成活性 |
| 1.2.6 抗癌活性 |
| 1.2.7 其他 |
| 1.3 胆酸类化合物及其衍生物在分子识别领域的应用 |
| 1.4 胆酸类化合物及其衍生物在高分子材料的应用 |
| 1.5 胆酸类化合物及其衍生物的应用前景 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 实验设计 |
| 2.1.1 Scheme 1 和Scheme 2 的立题依据 |
| 2.1.2 Scheme 3 的立题依据 |
| 2.1.3 Scheme 4 的立题依据 |
| 2.1.4 Scheme 5 的立题依据 |
| 2.2 实验仪器及试剂 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂及药品 |
| 2.3 单体的合成与表征 |
| 2.3.1 DA-1 的合成与表征 |
| 2.3.2 DA-2a的合成与表征 |
| 2.3.3 DA-2b的合成与表征 |
| 2.3.4 DA-2c的合成与表征 |
| 2.3.6 DA-2e的合成与表征 |
| 2.3.7 DA-2f的合成与表征 |
| 2.3.8 DA-2g的合成与表征 |
| 2.3.9 DA-3a的合成与表征 |
| 2.3.10 DA-3b的合成与表征 |
| 2.3.11 DA-3c的合成与表征 |
| 2.3.12 DA-3d的合成与表征 |
| 2.3.13 DA-3e的合成与表征 |
| 2.3.14 DA-3f的合成与表征 |
| 2.3.15 DA-3g的合成与表征 |
| 2.3.16 DA-4 的合成与表征 |
| 2.3.17 DA-5 的合成与表征 |
| 2.3.18 DA-6a的合成与表征 |
| 2.3.19 DA-6b的合成与表征 |
| 2.3.20 DA-6c的合成与表征 |
| 2.3.21 DA-6d的合成与表征 |
| 2.3.22 DA-6e的合成与表征 |
| 2.3.23 DA-6f的合成与表征 |
| 2.3.24 DA-6g的合成与表征 |
| 2.3.25 DA-7a的合成与表征 |
| 2.3.26 DA-7b的合成与表征 |
| 2.3.27 DA-7c的合成与表征 |
| 2.3.28 DA-7d的合成与表征 |
| 2.3.29 DA-7e的合成与表征 |
| 2.3.30 DA-7f的合成与表征 |
| 2.3.31 DA-7g的合成与表征 |
| 2.3.32 DA-8 的合成与表征 |
| 2.3.33 DA-9a的合成与表征 |
| 2.3.34 DA-9b的合成与表征 |
| 2.3.35 DA-10 的合成与表征 |
| 2.3.36 DA-11 的合成与表征 |
| 2.3.37 DA-12 的合成与表征 |
| 2.3.38 DA-13 的合成与表征 |
| 2.3.39 DA-14 的合成与表征 |
| 2.3.40 DA-15 的合成与表征 |
| 2.3.41 DA-16 的合成与表征 |
| 3 脱氧胆酸衍生物的抗癌活性研究 |
| 3.1 实验方法 |
| 3.1.1 细胞培养 |
| 3.1.2 细胞毒性检测 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 4 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 化合物的谱图 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（8）喜树碱-20（s）-O-甘氨酸酯-[N-（3’α,12’α-二羟基-24’-羰基-5’β-胆酸）]进入肝癌细胞SMMC-7721的运输机制及致死机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 课题背景 |
| 1.1.1 癌症的介绍 |
| 1.1.2 靶向给药系统介绍 |
| 1.1.3 胆酸作为靶向载体的介绍 |
| 1.1.4 喜树碱的介绍 |
| 1.1.5 药物运输载体的介绍 |
| 1.2 立题依据 |
| 2 A2,C2和D2的体外抗肿瘤活性的研究 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 仪器 |
| 2.1.3 实验前准备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 MTT法检测喜树碱及其衍生物(A2,C2和D2)体外抑制肿瘤细胞生长的能力 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 A2诱导SMMC-7721细胞凋亡 |
| 3.1 实验材料和仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 形态学观察 |
| 3.2.2 流式细胞仪检测凋亡 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 A2进入SMMC-7721细胞的运输机制 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 实验前准备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 A2对OATPs的mRNA表达水平的影响 |
| 4.2.2 A2进入SMMC-7721细胞运输方式的研究 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 A2对OATPs的mRNA表达水平的影响 |
| 4.3.2 A2进入SMMC-7721细胞运输方式的研究 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 A2诱导SMMC-7721细胞凋亡的机制 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 试剂的配制 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 细胞周期分布检测 |
| 5.2.2 Western Blot检测凋亡相关蛋白的表达 |
| 5.3 实验结果与讨论 |
| 5.3.1 A2对SMMC-7721细胞周期分布的影响 |
| 5.3.2 A2诱导SMMC-7721细胞中凋亡相关蛋白表达的变化 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）深低温冻存大鼠同种异体皮肤移植中转化生长因子-β1的表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.1 实验设计及材料 |
| 1.2 实验步骤 |
| 1.3 观测指标 |
| 1.4 统计学分析 |
| 结果 |
| 2.1 实验动物数量分析 |
| 2.2 实验动物基线情况 |
| 2.3 免疫排斥反应出现时间和存活时间 |
| 2.4 免疫排斥反应程度 |
| 2.5 TGF-B1的表达水平 |
| 讨论 |
| 3.1 实验概况 |
| 3.2 实验结果分析 |
| 3.3 实验结果的适用性 |
| 3.4 证据的质量分级 |
| 3.5 TGF-B1在其他领域的研究 |
| 3.6 皮肤替代材料的发展前景 |
| 3.7 局限性 |
| 结论 |
| 利益冲突 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）深低温冻存同种异体皮肤移植中转化生长因子β1的表达（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 实验动物数量分析 |
| 2.2 低温保存和深低温保存对移植皮肤排斥反应出现及存活时间的影响 |
| 2.3 低温保存和深低温保存对移植皮肤排斥反应程度的影响 |
| 2.4 低温保存和深低温保存对移植皮肤中转化生长因子β1表达水平的影响 |
| 3 讨论 |
四、NCX-1000的新合成方法（论文参考文献）
- [1]RGD-transTat抑制新生血管生成活性的初步研究[D]. 孙莹. 山东大学, 2019(02)
- [2]修饰玻璃酸钠组织工程软骨支架的制备及应用研究[D]. 肖士鹏. 山东大学, 2018(02)
- [3]熊去氧胆酸（UDCA）衍生物的合成及抗肝癌活性研究[D]. 曹婷. 厦门大学, 2018(07)
- [4]阿德福韦单L-硫代氨基酸酯，单胆酸酯衍生物的设计、合成与生物活性研究[D]. 张文政. 贵州医科大学, 2018(09)
- [5]基孔肯雅病毒样颗粒的制备及其特异性IgM检测方法的初步建立[D]. 陈何嵩. 第四军医大学, 2017(03)
- [6]Hsa-miR-506-3p靶向ERK-2/ETS-1抑制胃癌血管新生及侵袭转移的功能及机制研究[D]. 李真. 南方医科大学, 2016(02)
- [7]脱氧胆酸衍生物的合成、表征及其抗癌活性研究[D]. 付晓磊. 辽宁师范大学, 2015(06)
- [8]喜树碱-20（s）-O-甘氨酸酯-[N-（3’α,12’α-二羟基-24’-羰基-5’β-胆酸）]进入肝癌细胞SMMC-7721的运输机制及致死机制的研究[D]. 刘天宇. 东北林业大学, 2014(07)
- [9]深低温冻存大鼠同种异体皮肤移植中转化生长因子-β1的表达[D]. 杨声坪. 兰州大学, 2014(10)
- [10]深低温冻存同种异体皮肤移植中转化生长因子β1的表达[J]. 曹立颖,丁轩玺,杨声坪,王冠,姜明静,张玉兰,王建民. 中国组织工程研究, 2013(18)