山东力明科技职业学院山东济南250116
【摘要】本研究观CLO对人急性淋巴母细胞白血病细胞（MOLT-4）的增殖抑制作用并探讨其可能的作用机制。结果表明，CLO可浓度依赖性抑制MOLT-4细胞的增殖，并促进MOLT-4细胞的凋亡；CLO处理后MOLT-4细胞的T-type钙通道蛋白表达及功能均下降。结论：CLO可能通过降低MOLT-4细胞T-type钙通道表达及功能，促进细胞凋亡，从而抑制MOLT-4细胞的增殖。
【关键词】氯法拉滨；MOLT-4细胞；T-type钙通道
氯法拉滨（clofarabine，CLO）是第二代嘌呤核苷类似物，本实验通过观察CLO对人急性淋巴母细胞白血病细胞（MOLT-4）的增殖抑制作用及T-type电压依赖钙通道的影响，研究CLO诱导MOLT-4细胞凋亡的相关机制，为临床更好的理解CLO的药理作用提供实验基础。[1-3]
一、材料和方法
1、主要试剂与仪器
MOLT-4细胞来源于美国ATCC公司，氯法拉滨为山东齐鲁制药有限责任公司产品；Annexin-VFITC凋亡试剂盒为武汉博士德科技有限公司产品；小鼠抗人T-Type钙通道单克隆抗体购自SantaCruz公司；流式细胞分析仪购自Beckman公司，图象采集与分析系统为Bio-Rad公司产品；蛋白质电泳仪、转膜仪为Bio-Rad公司产品；DYY-2型稳压稳流电泳仪、DYY-Ⅲ40B电泳槽为北京六一仪器厂产品；膜片钳为德国HKEA公司EPC10双通道放大器，记录软件PatchMaster；数据统计分析软件Origin7.0。
2、统计学处理
数据用Origin7.0软件统计分析，计算所有数据以均数±标准误表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为具有统计学差异。
二、结果
1、CLO对MOLT-4细胞增殖的影响
用MTT比色法观察不同浓度CLO（0.01、0.03、0.06、0.1μM）对MOLT-4细胞增殖的影响，结果表明CLO浓度依赖性对MOLT-4细胞有增殖抑制作用（n=6，P<0.05，图1）。0.01和0.1μMCLO作用于MOLT-4细胞24h后，增殖抑制率分别为16.3±1.9%和59.6±4.7%。
Figure1.EffectofclofarabineonMOLT-4cellProliferation.
2、CLO对MOLT-4细胞凋亡率的影响
流式细胞仪检测结果显示，CLO可诱导MOLT-4细胞凋亡。0.03、0.06、0.1μMCLO作用MOLT-4细胞24h，凋亡率分别为10.2±2.9%，35.7±4.8%，59.6±7.9%，凋亡率呈浓度依赖性增加（n=5，图2）。与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。
Figure2.CellapoptosisrateinMOLT-4cellstreatedwithdifferentconcentrationsofclofarabinefor24hdetectedbyflowcytometry.
3、CLO对MOLT-4细胞T-type钙通道蛋白表达的影响
通过Westernblot的方法观察CLO对T-type钙通道蛋白的表达是否有影响。0.1μMCLO作用MOLT-4细胞24h后提取样本，观察T-type钙通道CaV3.2亚基的表达情况，结果显示，与对照组相比，经过CLO处理后的MOLT-4细胞CaV3.2亚基的表达出现下调（图3），对照组和CLO处理组CaV3.2蛋白条带灰度比值分别为100.0±19.7%和68.1±20.8%（n=3），差异具有统计学意义（P<0.05）。
Figure3.EffectofclofarabineontheexpressionofT-typecalciumchannelinMOLT-4cell.
4、CLO对MOLT-4细胞T-type钙通道电流的影响
利用全细胞膜片钳技术记录T-type钙通道电流，0.1μMCLO作用MOLT-4细胞24h后提取样本，记录MOLT-4细胞的T-type钙通道电流。结果显示，与对照组相比，经过CLO处理后MOLT-4细胞的T-type钙通道电流降低，对照组和CLO处理组T-type钙通道电流的电流密度分别为22.9±1.7pA/pF和10.5±1.2pA/pF（n=8，图4），差异具有统计学意义（P<0.05）。
Figure3.EffectofclofarabineonthefunctionofT-typecalciumchannelinMOLT-4cell.
三、讨论
本实验运用多种实验方法，研究了不同浓度CLO处理对MOLT-4细胞增殖及调亡的作用，以及对T-type钙通道表达及功能的影响。结果显示，CLO可浓度依赖性抑制MOLT-4细胞的增殖，并促进MOLT-4细胞的凋亡；CLO处理后MOLT-4细胞的T-type钙通道蛋白表达及功能均下降。[4]
总之，氯法拉滨治疗急性淋巴细胞性白血病的具体机制目前尚未完全阐明，本实验提示抑制T-type钙通道的表达和功能进而促进凋亡及抑制细胞增殖可能是氯法拉滨治疗急性淋巴细胞性白血病的一个重要机制。
参考文献：
[1].Graham，D.K.，etal.，Ectopicexpressionoftheproto-oncogeneMerinpediatricT-cellacutelymphoblasticleukemia.ClinCancerRes，2006.12（9）：p.2662-9.
[2].夏敏与蒋慧，儿童急性白血病治疗新药氯法拉滨.世界临床药物，2007（06）：第356-359页.
[3].Genini，D.，etal.，DeoxyadenosineanalogsinduceprogrammedcelldeathinchroniclymphocyticleukemiacellsbydamagingtheDNAandbydirectlyaffectingthemitochondria.Blood，2000.96（10）：p.3537-43.
[4].Kline，J.P.andR.A.Larson，Clofarabineinthetreatmentofacutemyeloidleukaemiaandacutelymphoblasticleukaemia：areview.ExpertOpinPharmacother，2005.6（15）：p.2711-8.