导读:本文包含了膜融合抑制剂论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:上市标准,科创,创新药,艾滋病治疗,保荐人,销售收入,上交所,国家一类新药,退市,病毒携带者
膜融合抑制剂论文文献综述
傅苏颖[1]（2019）在《第五套上市标准又一家前沿生物冲刺科创板》一文中研究指出8月13日，上交所网站披露，前沿生物药业(南京)股份有限公司(简称“前沿生物”)申请科创板上市获受理。前沿生物是继百奥泰、天智航、泽璟制药之后，第四家拟采用第五套上市标准的科创板企业。公司此次拟募资20.01亿元投资1000万支注射用HIV融合抑制剂、艾(本文来源于《中国证券报》期刊2019-08-15）
王琛[2]（2019）在《PEG化HIV-1融合抑制剂的耐药性和作用机制研究》一文中研究指出研究目的与意义艾滋病是由人类免疫缺陷病毒引起的一种慢性传染病,目前尚未研制成功有效的艾滋病疫苗,抗HIV-1药物仍然是治疗艾滋病的主要手段。传统的抗HIV-1药物主要是针对病毒逆转录酶、蛋白酶或整合酶的小分子抑制剂,其发挥作用的靶点是病毒进入细胞后的阶段。随着HIV-1入侵宿主细胞分子机制的逐步阐明,阻止病毒进入细胞的HIV-1融合抑制剂逐渐成为艾滋病药物的研究热点。恩夫韦肽作为目前唯一被美国FDA批准的HIV-1融合抑制剂,因体内半衰期短和注射频繁等缺点严重制约了其临床应用。长效化HIV-1融合抑制剂具有更好的药代动力学特性,不仅可以降低药物的使用频率,减轻患者的痛苦和经济负担,还可以用于预防高危人群HIV-1的感染。但随着抗病毒治疗药物的广泛应用,HIV-1在药物选择压力下发生突变,导致耐药性的产生,致使病毒对药物敏感性下降或不敏感。聚乙二醇(PEG)修饰通过改善多肽药代动力学,从而延长药物半衰期,目前许多PEG化的多肽药物已用于临床。本课题与中科院微生物所合作合成了PEG化C34,以发现阻止HIV-1进入细胞的新一代长效化HIV-1融合抑制剂为最终目的,针对PEG化HIV-1融合抑制剂的耐药性这一科学问题,在全面分析其对我国HIV-1临床分离病毒株药物敏感性基础上,深入探讨PEG化HIV-1融合抑制剂的耐药突变位点及其引发耐药的机制,以期为今后药物设计提供新的思路。研究方法1.HIV-1病毒株的复制和制备采集自四川、广西、北京和安徽的47株中国主要流行亚型HIV-1临床分离株,两段法扩增HIV-1临床分离病毒株近全长基因序列,序列拼接、处理后构建进化树分析其亚型;分离外周血单个核细胞(PBMCs)用于47株临床分离病毒株的复制;pNL4-3转染HEK293T细胞获得实验室适应株NL4-3;在TZM-bl细胞上测定复制或转染所得病毒的半数组织细胞感染量(TCID50)和p24含量。2.基于TZM-bl细胞的HIV-1融合抑制剂的体外抑制实验与中科院微生物所合作完成了 PEG化HIV-1融合抑制剂的合成和制备。将T20、C34和PEG修饰的C34(PEG2kC34和PEG5kC34)倍比稀释后分别与HIV-1包膜蛋白、实验室适应株NL4-3以及47株中国主要流行亚型HIV-1临床分离株在TZM-bl细胞上共培养48 h,通过检测TZM-bl细胞相对荧光单位值计算PEG化C34对HIV-1包膜蛋白介导的细胞-细胞融合和HIV-1复制的抑制能力。3.PEG修饰前后C34对HIV-1 gp41六螺旋结构形成抑制实验通过圆二色谱检测PEG修饰前后C34与靶序列(N36)在195 nm到270 nm波长范围内以及在222 nm处从20℃到98℃温度范围内的摩尔椭圆率变化,通过计算α-螺旋的百分比和Tm值来确定两者之间的结合能力。将终浓度为100 μM的C34或PEG化C34与不同稀释度的N36在37℃孵育30 min,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳测定多肽与N36形成六螺旋结构的能力。4.大鼠体内PEG化C34半衰期测定选取12只7周龄SD大鼠,随机分为3组。单次皮下注射PEG修饰前后C34,在注射前和注射后不同时间点从尾静脉采血,将倍比稀释的血浆与NL4-3病毒于TZM-bl细胞上共培养48 h,通过检测荧光表达情况,计算PEG修饰前后C34抑制50%病毒感染的血浆稀释度。5.PEG化HIV-1融合抑制剂的体外药物压力实验和耐药位点的鉴定MT2细胞每3至4天传代,通过观察合胞体的形成情况监测病毒复制。在每个病毒突破点,抑制剂的浓度加倍。运用巢式聚合酶链反应扩增不同多肽浓度下病毒gp41序列,通过比对获得病毒逃逸突变位点。以质粒pNL4-3为骨架,利用分子克隆技术和定点突变试剂盒,构建包含突变位点的质粒,将测序鉴定正确质粒转染HEK293T细胞,测定病毒滴度和p24含量。通过病毒表型耐药实验,比较病毒突变前后对PEG化C34和T20的药物敏感性,确定耐药位点。6..深度测序检测体外HIV-1融合抑制剂压力下病毒的耐药位点收集体外药物压力下病毒培养上清,提取第8、9和10代病毒培养上清RNA,一步法巢式PCR扩增HIV-1 gp41基因,纯化回收后送北京地坛医院传染病研究所完成测序。7..病毒适应性测定将含有PEG化C34耐药位点的病毒与野生毒株按1:11比例混合后定量感染PM1细胞,于感染的第3天至第6天收集半量培养液和细胞,用抗-Thy1.1和抗-Thy1.2抗体染色,经流式细胞仪检测感染细胞百分比,确定毒株的相对复制适应性。研究结果1.PEG化HIV-1融合抑制剂能够有效抑制我国主要流行亚型HIV-1临床分离病毒株的复制,呈现较好的广谱性。成功合成了两种PEG化HIV-1融合抑制剂,质谱分析其平均分子量分别为6,500 Da和9,300 Da,液相色谱分析其纯度均大于98%。敏感性实验表明PEG化HIV-1融合抑制剂可以有效抑制HIV-1包膜蛋白介导的细胞-细胞融合和实验室适应株NL4-3的复制,对我国主要流行亚型HIV-1临床分离病毒株特别是占比最高的CRF01 AE亚型毒株具有较好的抑制活性,PEG2kC34和PEG5kC34的EC50平均值分别为19.34 nM和19.64 nM;该类PEG化HIV-1融合抑制剂体外细胞毒性较低,其CC50均大于100μM。2.PEG化C34通过与NHR结合形成稳定的六螺旋结构抑制病毒包膜蛋白与细胞膜融合并呈现较长的半衰期圆二色谱结果显示两种PEG化C34均可与HIV-1 gp41相应序列结合,形成高α-螺旋复合物,PEG2kC34与N36形成93.90%α-螺旋,PEG5kC34与N36形成96.58%α-螺旋;复合物N36/PEG2kC34和N36/PEG5kC34的熔解温度分别为57.03 ℃和55.04 ℃。非变性凝胶电泳结果显示,与C34相似,PEG修饰后的C34同样可以与N36结合形成稳定的六螺旋结构,并且在一定范围内这种结合与N36具有剂量依赖关系。此外,PEG修饰使C34在SD大鼠体内半衰期显着延长。3.L44V和N126K位点同时出现增强了病毒对PEG化C34的耐药性压力实验中多肽C34、PEG2kC34和PEG5kC34的最终浓度分别为其起始浓度的4.096倍、1,024倍和512倍。经过7个月筛选,获得叁株HIV-1耐药株。其突变发生在gp41的第44、126和250位氨基酸。在C34压力下,第9代开始出现之前未报道的L44V突变位点,N126K突变位点则在更早期的第5代开始出现;在PEG2kC34压力下,L44V和N126K突变同时在第4代出现;在PEG5kC34压力下,本实验中未检测L44V或者N126K突变位点,但在第7代检测到R250Q突变位点。L44V或N126K突变可导致PEG2kC34和PEG5kC34的药物敏感性降低4.2倍和2.3倍或1.2倍和1.6倍,而L44V和N126K双位点突变后病毒的药物敏感性降低了 12.4倍或9.8倍。10E8抗体对含突变位点病毒株的中和实验结果表明,耐药位点对gp41结构产生了一定的影响。因此,我们推测PEG化C34的耐药性需要L44V和N126K共同维持。4.L33S和R271K位点同时出现增强了PEG化T20的耐药性Gp41区只出现L33S突变位点时,T20、PEG2kT20和PEG5kT20的EC50均有较大改变,但改变程度存在差异,其EC50分别变为原来的12倍、83倍以上和28倍;Gp120区只出现R271K突变位点时,抑制剂的EC50变化较小,且抑制剂间差异也较小,分别变为原来的1～3倍;L33S和R271K同时突变时抑制剂的EC50表现出较之前两位点单独突变时更大的差异,抑制剂的EC50均变为原来的83倍以上,即gp120区的R271K能够增强L33S的耐药性,之前我们未见相关报道。T20耐药株对PEG修饰T20的交叉耐药实验结果显示,T20耐药性与PEG2kT20或PEG5kT20存在差异,其中NL4-3-V38A、NL4-3-V38E-N42S、NL4-3-V38A-N42D和NL4-3-V38A-N42T对T20、PEG2kT20和PEG5kT20均表现出了不同程度的耐药;而NL4-3-N43K对T20和PEG5kT20表现出一定程度的耐药但本课题中未观察到其对PEG2kT20的耐药现象。HIV-1 gp41基因深度测序,检测到多个组内单核苷酸多态性位点,并且PEG化C34和T20的耐药性存在差异。5.N126K突变位点显着降低病毒的相对复制适应性流式细胞仪检测AT1和含耐药位点AT2病毒株的相对复制适应性。实验结果显示,L44V、N126K和R250Q均可以在不同程度上降低病毒的相对复制适应性,其中N126K突变可显着影响病毒的相对复制适应性,但该显着性在溶液中存在C34的情况下消失。结论PEG化HIV-1融合抑制剂可以有效抑制HIV-1 env介导的细胞-细胞融合和实验室适应株NL4-3的复制,对我国主要流行亚型HIV-1临床分离病毒株也具有较好的抑制广谱性,在SD大鼠体内的半衰期显着延长。N126K和L44V位点同时出现能够增强PEG化C34耐药性,N126K突变位点能够显着降低病毒的相对复制适应性;与PEG化C34不同,PEG化T20的主要耐药位点是L33S,L33S和R271K同时出现能增强其耐药性。本研究为长效化HIV-1融合抑制剂的耐药性及作用机制研究提供了一定的理论基础。(本文来源于《中国疾病预防控制中心》期刊2019-06-30）
韩泽业[3]（2019）在《新结构核酸螺旋类HIV-1融合抑制剂的设计与评价》一文中研究指出HIV-1融合抑制剂在病毒感染细胞初期发挥作用,由于作用靶点位于病毒表面,无需进入细胞,在抗HIV-1药物研究中备受关注。除了肽类HIV-1融合抑制剂,近年来,人们陆续发现一些基于核酸螺旋结构的分子,可作用于病毒表面包膜蛋白,具有HIV-1融合抑制活性。已报道的分子在结构上包括DNA双螺旋、叁螺旋、四螺旋、以及多价复合结构。这些分子为抗HIV-1药物研发提供了先导结构,在已报道的研究中,抗HIV-1融合抑制活性大多在几百nM甚至几μΜ水平,设计具有新结构、高活性的抑制剂是核酸螺旋类HIV-1融合抑制剂的发展方向。本研究以经典的Hotoda四螺旋抑制剂为先导分子,以提高活性为目标,进一步从分子整体构型和空间组合等角度,进行叁种新结构类型的分子设计,共包括:1.带有柔性末端的G四螺旋类结构;2.可交联的柔性末端四螺旋类结构;3.四螺旋末端缀合二肽MT钩子结构。1.带有柔性末端的G四螺旋类结构以Hotoda发现的G四螺旋为先导结构,大量的工作对芳香基团的种类和引入位点进行了各种探讨。在研究中,人们发现,这类分子的作用靶点与病毒表面包膜蛋白gp120和gp41相关。我们以Hotoda四螺旋为先导分子设计了一类带有柔性末端的G四螺旋结构,主要基于两点:1)gp120的V3 loop参与了与核酸螺旋抑制剂的相互作用,V3 loop带有正电荷,核酸带有负电荷,在G四螺旋末端增加柔性片段后,通过增加分子的电负性而增强其与V3 loop的电荷相互作用,提高分子与靶标之间亲和力;2)gp41的N末端重复序列(N-terminal heptad repeats,NHR)叁聚体疏水沟槽较浅,G四螺旋分子的刚性结构不可能采取完全契合并深入到口袋内部的构象,刚性结构所能发挥的空间占位效应有限,在G四螺旋末端增加柔性片段后,有可能增强抑制剂作用于疏水沟槽时的占位效应,从而增强对膜融合过程中关键结构即6股螺旋(6-helix bundle,6HB)形成的抑制能力。本部分工作,设计合成了多个带有不同长度柔性末端的G四螺旋分子。通过细胞-细胞融合实验证明,柔性末端的设计确实有效提高了活性,其中,一个优选分子IC_(50)值较经典的Hotoda四螺旋先导分子提高了10倍。采用了多个结构分析实验共同表征其结构,提示柔性末端没有显着影响其G四螺旋序列部分的分子间组装。通过表面等离子共振实验证明带有柔性末端的G四螺旋分子与靶蛋白gp120、gp41的相互作用较先导分子更强,通过抑制6HB形成实验证明带有柔性末端的G四螺旋分子较先导分子增强了对6股螺旋形成的抑制。与天然序列相比,新结构分子也显示出良好的代谢稳定性。2.可交联的柔性末端四螺旋类结构G四螺旋抑制剂的作用靶点gp120和gp41在空间分布上具有叁个特征:1)gp120和gp41之间存在非共价相互作用,呈聚集状态。2)同一病毒表面同时存在多个包膜蛋白。3)gp41的NHR叁聚体疏水口袋在空间上呈对称分布。基于前一部分设计的柔性末端四螺旋结构,我们进一步设计可交联的柔性末端四螺旋结构:在分子的柔性端增加可交联片段,即,在一条核酸序列上设计活性四螺旋组装区、连接区和交联区叁个区域。活性四螺旋组装区序列组成为DMT-TGGGAG,可以在四条相同链间形成活性四螺旋结构;交联区序列设计成回文结构,可通过两条相同序列间反平行互补配对形成双螺旋结构,从而实现多个活性G四螺旋分子的交联。本部分工作,通过非变性凝胶电泳证明了交联结构的形成,但是在细胞-细胞融合实验中活性与相同长度的不能交联的柔性末端四螺旋对照组相当,这一结果可能是由于双螺旋序列部分的组装竞争性干扰了活性四螺旋序列部分的组装,降低了形成活性四螺旋的有效比例所致,也可能是由于这种交联的结构在空间上未能有效匹配靶点的空间结构所致。在后续工作中,我们将会对序列进行优化,以期获得高活性的交联结构。3.四螺旋末端缀合二肽MT钩子结构据报道,甲硫氨酸酰-苏氨酸酰(MT)二肽片段可以将C肽类融合抑制剂“锚定”在NHR疏水口袋区,增强对形成内源性6HB的抑制,被称为MT钩子结构。而G四螺旋抑制剂同样可以作用于HIV-1 gp41的NHR疏水口袋区,并抑制6HB的形成。在核酸螺旋抑制剂结构中缀合二肽MT钩子,或许能够进一步增强与结合区的空间契合度,发挥MT与靶标的“锚定”即氢键相互作用,提高核酸抑制剂与靶相互作用能力,增强抑制活性。在本部分工作中,通过氨基己醇连接臂将二肽MT钩子缀合在核酸序列磷酸骨架的5'末端。细胞-细胞融合实验显示,缀合二肽MT钩子的活性四螺旋分子相比没有MT钩子的四螺旋分子活性提高约3倍。通过非变性凝胶电泳、圆二色谱等实验,证明了缀合MT钩子不影响G四螺旋结构的形成。通过抑制6股螺旋形成实验证明缀合MT钩子的分子可以抑制内源性6HB的形成。本研究从分子构型和空间组合的思路进行理性设计,发现全新的先导结构,丰富了抗HIV-1核酸螺旋类抑制剂先导分子的种类。本研究设计的新核酸结构,也可为研究核酸高级结构和组装规律提供有价值的参考。(本文来源于《军事科学院》期刊2019-05-27）
张秀娟[4]（2018）在《HIV膜融合抑制剂的结构生物学研究》一文中研究指出人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)是获得性免疫缺陷综合征的病原体,截止到2017年,全球已有约7100多万人感染,其中已死亡人数高达3500多万,存活感染者3690万人。传统的高效联合抗逆转录病毒疗法(highly active antiretroviral therapy,HAART)利用 2-3 种逆转录酶抑制剂和至少 1种蛋白酶抑制剂切断HIV的复制过程,达到抗病毒的作用。这种酶类抑制剂是在病毒进入细胞后发挥作用,而HIV膜融合抑制剂是在病毒尚未进入细胞时发挥其抗病毒作用,因而具有独特的抗病毒优势。T20是目前唯一获得美国FDA批准用于临床的HIV膜融合抑制剂,具有划时代的意义。尽管T20已问世20余年,它的抗病毒机制仍未明确。第二代膜融合抑制剂T1249具有高效且广谱的抗病毒活性,但是由于试剂配方问题,停止了临床实验,它的抗病毒作用机制也亟待研究。在第叁代膜融合抑制剂中,短肽类膜融合抑制剂HP23L具有强大的抗病毒效能,因此对其抗病毒机制的研究意义重大。本文采用晶体结构生物学的方法,解析了叁代膜融合抑制剂中的典型代表及其衍生物的晶体结构,为HIV膜融合抑制剂的作用机制和耐药机理的研究提供了重要的理论基础,对研发抗病毒活性高且广谱的HIV膜融合抑制剂具有指导价值。本文取得的创新性成果主要有:(1)成功解析了第一代HIV膜融合抑制剂T20及其衍生物LP-40分别与靶肽复合物的晶体结构,结果表明,第一,位于T20 C端的富含色氨酸基序(tryptophan-rich motif,TRM)上的两个氨基酸与N39N端的融合肽近端区(fusion peptide proximal region,FPPR)上的氨基酸存在疏水相互作用;第二,与之前关于T20与gp41上的口袋区没有相互作用的观点不同,T20N端的氨基酸与口袋区中的两个重要的氨基酸存在相互作用,明确了带有L57R突变的HIV-1突变体对T20和LP-40敏感的原因;第叁,LP-40C端的Leu-152与靶肽的相互作用是抑制剂DP-C16比LP-40的结合力和抑制活性低的原因;第四,阐明了 9个由T20诱导的gp41上的耐药位点的分子结构基础。(2)成功解析了第二代HIV膜融合抑制剂的衍生物LP-46与其靶肽复合物的晶体结构。发现LP-46N端的口袋结合区(pocket binding domain,PBD)未插入口袋区,而是靠近口袋区,与口袋区中两个重要的氨基酸存在相互作用。(3)成功解析了短肽类抑制剂HP23L及其衍生物LP-11分别与不同靶肽N36、N36KR和N44复合物的晶体结构。结果显示,首先,HP23LN端的谷氨酸和L-T钩子具有稳定构象和提高抑制剂结合力的作用;其次,LP-11C端的脂肪酸不影响抑制剂和靶肽相互作用;最后,阐明了短肽类抑制剂诱导的gp41上的耐药位点E49K和L57R的分子结构基础。综上所述,我们获得了六个HIV膜融合抑制剂与其靶肽复合物的晶体,收集了晶体数据,对数据进行了解析、修正及分析,阐明了这些膜融合抑制剂抗病毒作用的关键位点及耐药突变的分子结构基础。本研究中的成果将对新一代HIV膜融合抑制剂的设计与研发起到重要的指导作用。(本文来源于《北京交通大学》期刊2018-09-19）
刘紫轩[5]（2018）在《Asn-145位点在HIV膜融合抑制剂设计中的作用与机制研究》一文中研究指出HIV膜融合抑制剂是一种多肽类药物,它通过特异靶向HIV gp41NHR区域,抑制融合过程中核心六螺旋束的形成,从而阻断病毒入侵,在感染的初始阶段切断HIV病毒的传播。2003年,美国FDA批准了临床使用的唯一基于HIV表面融合蛋白gp41靶点的抑制剂恩夫韦肽,即T20。该多肽对逆转录酶抑制剂和蛋白酶抑制剂耐药及不耐药病人均具有很好的治疗效果,且副作用低,然而T20多肽存在着半衰期短,容易耐药等问题。理想的膜融合抑制剂应具有水溶性好,活性高,稳定,价格低廉等特点,因此亟需设计出一种具有高抗病毒活性,高广谱活性、高抗耐药性和较短片段的膜融合抑制多肽药物。Naito等设计的SC29EK是一个含有E-K模体(X-EE-XX-KK)的29个氨基酸多肽,其活性和抗耐药性较T20均明显提升,为了进一步探究SC29EK作用机制,我们将SC29EK进行逐个截短,结果发现SC29EK与SC28EK之间,仅相差一个氨基酸Asn但是抗病毒活性存在显着差异,这是否提示SC29EK的最后一个氨基酸Asn(位于病毒的gp41-145位点)对多肽与病毒结合有重要作用,据此我们开展了一系列实验。本次研究主要是针对gp41Asn-145位点的重要作用进行探究。首先通过抗病毒实验发现了 SC29EK与其截短的多肽抗病毒活性存在的显着差异。随后,选取代表性多肽T20与C34将其Asn-145位点替换为Ala,通过抗病毒和抑制细胞融合实验检测多肽活性差异;通过圆二色谱实验,评价了 HIV六螺旋束稳定性;通过ITC等温滴定量热实验,检测多肽与NHR反应时热量变化差异。同时,病毒自身CHR上同样含有Asn-145位点,将该位点突变后检测病毒的入侵和融合能力变化。MT钩子是位于多肽N端的特殊结构,而Asn-145位点位于C端,我们随后通过抗病毒实验探究了二者之间的关系。陆路教授等人报道的IDL是含有29个氨基酸的多肽,其C末端氨基酸IDL通过形成钩子样特殊结构与NHR特殊区域结合,我们对比了同为29个氨基酸的多肽间的活性差异。为进一步研究Asn-145位点的空间构象,我们运用晶体学方法,对含有SC29EK多肽的HIV六聚体进行结晶并成功解析了其结构。本次研究得到了以下结论:(1)Asn-145位点对于多肽抗病毒活性与抑制细胞融合活性十分重要,并且对于病毒的入侵与融合能力也起着重要作用。(2)研究发现位于C端的Asn-145位点与位于N端的MT-hook之间存在着调控关系。(3)SC29EK在多肽复合物的晶体结构中,我们发现Asn-145位点通过形成氢键与NHR互作,稳定六螺旋束。该构象十分保守稳定,能起到提高多肽活性的作用。此外,利用解析到的结构,我们进一步分析了 SC29EK多肽的作用机制以及SC29EK多肽的耐药病毒株耐药机制。本次研究通过多肽与病毒抗病毒活性的差异推断多肽与病毒结合的机制,为病毒进入机制的研究提供新思路。另外,以往的研究更关注多肽的N端氨基酸的作用机制,例如MT-hook,而本次研究则聚焦于多肽C端氨基酸的作用方式,并且进一步分析了两端氨基酸之间的作用关系,为多肽序列改造以及新多肽的设计提供思路。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2018-06-01）
丁晓慧[6]（2018）在《新型HIV膜融合抑制剂的设计及作用机制研究》一文中研究指出自首例艾滋病(获得性免疫缺陷综合征,acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)患者在美国被检测发现以来,AIDS已成为一种严重危害人类健康的疾病。作为唯一一个被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准用于AIDS患者临床治疗的多肽膜融合抑制剂,恩夫韦肽(Enfuvirtide,T20,又称DP178)的发现开辟了利用多肽类药物控制HIV感染的新领域,在一定程度上改善了患者的生命质量,可作为“鸡尾酒疗法”高效抗逆转录病毒治疗失败的补救措施。但在随后的治疗研究过程中暴露的一些弊端,比如多次用药易产生耐药性、生物利用度低、对HIV-2抗病毒活性弱等,限制了 T20进一步的临床应用。T1249是继T20之后开发设计的第二代多肽膜融合抑制剂,弥补了 T20抗病毒过程中出现的不足,对HIV-1各亚型、HIV-2/SIV及T20耐药病毒株均具有较高的抗病毒活性。但随后由于制剂、分子量大等问题限制了 T1249进一步的研究应用。因此,更具临床应用价值的多肽膜融合抑制剂亟待研发设计。本课题聚焦T20多肽膜融合抑制剂,探讨其具体抗病毒作用机制,同时指导新型膜融合抑制剂的设计。首先,我们通过病毒单次侵染抑制实验及圆二色谱(circular dichroism,CD)实验证明了色氨酸富集区(tryptophan-rich motif,TRM)在 T20抗病毒活性及其与相应NHR结合形成六螺旋体(six-helixbundle,6-HB)结构的重要性;为了进一步探讨TRM在T20抗病毒活性中的作用,并研发设计更具潜在临床应用价值的膜融合抑制剂,我们随后用同样具有高度疏水特性且能与靶细胞膜发生相互作用的脂肪酸(软脂酸,C16)取代T20羧基端的TRM,从而获得新的脂肽LP-40。相比T20及早期报道的以T20序列为模板设计的脂肽DP-C16,LP-40无论是与NHR结合能力,亦或抗病毒活性都有明显提高。研究发现,不同于早期设计合成的作用于gp41 NHR疏水口袋“pocket”区的脂肽LP-11,在多肽序列与脂肪酸之间Linker的添加不仅没有因为增强多肽的灵活性而使其抗病毒能力增强,反而严重削弱,这表明,LP-40与LP-11可能以完全不同的模式同gp41 NHR发生相互作用。有趣的是,随后的研究发现,尽管LP-40抗病毒活性低于LP-11,但在HIV-1各亚型包膜蛋白介导的膜融合过程中却表现出强有力的抑制活性,而且两种多肽联合使用具有中等程度的协同作用,这一方面进一步表明两种多肽作用机制的不同,另一方面也表明,对于HIV-1来说,病毒进入靶细胞的机制与由其包膜蛋白介导的膜融合机制之间可能存在一定的差异,在患者体内,或许这两个过程并不是以完全相同的模式在介导病毒传播。此外,尽管LP-40在很多方面的特性优于其模板多肽T20,但其对T20耐药株及HIV-2病毒株依旧表现较弱的抗病毒活性。因此,受LP-40脂肽设计的启发,也为了克服T20、T1249及LP-40在抗病毒活性中的不足,我们以T1249序列为模板,同样用脂肪酸C16取代其羧基端的TRM序列,合成一新的脂肽LP-46。随后的实验结果表明,相比T20、T1249及LP-40,LP-46对HIV-1的抗病毒活性IC50值接近皮摩尔浓度,对HIV-2/SIV及T20耐药株也表现出极高的抗病毒活性。总之,我们的研究结果不仅提供了更具潜在临床应用价值的多肽膜融合抑制剂,而且以T20/LP-40为探针从新的角度进一步揭示了 HIV膜融合的分子作用机制。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2018-04-01）
郭叶,傅莉莉,范晓文,史宣玲[7]（2018）在《构象锁定HIV-1融合抑制剂的合成及抗HIV-1活性研究》一文中研究指出西夫韦肽(SFT)是一种有效抗HIV-1(Human Immunodeficiency Virus-1)融合抑制剂,它比已上市融合抑制药物T20拥有更高的药效及药代稳定性,目前已完成了IIb临床实验.以西夫韦肽为模板,通过构象锁定策略将多肽中原有的盐桥替换为共价键合成了SFT订书肽SFT-1和SFT-2.产物结构经圆二光谱确认形成了α-螺旋.对所有合成多肽进行了抗HIV-1活性检测,结果表明SFT订书肽对7个HIV-1假病毒株抑制活性均高于SFT,其中SFT-1对B'亚型和B'C重组亚型病毒株抑制活性最高,SFT-2对B、CRF01_AE和CRF08_BC亚型病毒株抑制活性最高.(本文来源于《有机化学》期刊2018年05期）
郭叶,王天玉,范晓文,张红丽[8]（2017）在《HIV-1多肽类融合抑制剂的发展现状及研究进展》一文中研究指出HIV(human immunodeficiency virus)是一种可以感染人体免疫系统细胞并造成免疫系统缺陷的病毒,它可以分为两个亚型HIV-1和HIV-2,其中HIV-1较常见。由HIV感染而引发的传染性疾病统称为艾滋病(AIDS)。据联合国艾滋病规划署(UNAIDS)报道,截止2015年全球已有约3 690万人感染了HIV,其中新发HIV感染者约210万,同年死于艾滋病相关病(本文来源于《包头医学院学报》期刊2017年12期）
王小利,杨怡姝,沈思嗣,王先良,冯甜[9]（2018）在《基于包膜蛋白和Tat蛋白筛选HIV-1细胞融合抑制剂的高效方法》一文中研究指出旨在建立一个细胞-细胞融合系统,高效筛选对HIV-1病毒细胞-细胞间传播有抑制作用的药物。构建了p EGFP-Tat质粒,将p EGFP-Tat质粒和HIV-1包膜质粒共转染HEK-293T细胞,成为表达Tat蛋白和包膜蛋白的效应细胞,然后与表达CD4及辅助受体和β-半乳糖苷酶、荧光素酶双报告基因的靶细胞TZM-bl融合,建立了细胞-细胞融合系统,并进行条件优化,确定了最佳的融合体系。用阳性融合抑制剂maraviroc以及没有融合抑制作用的AZT和raltegravir作用于该体系,证明该系统可以特异性有效筛选具有细胞融合抑制作用的药物。用该系统测试了8个样本,发现两种样品对融合有一定的抑制作用。该方法背景值低,特异性强,可用来高效筛选具有切断HIV-1病毒细胞-细胞间传播作用的抗病毒药物。(本文来源于《生物工程学报》期刊2018年03期）
伍熙源[10]（2017）在《HIV-1膜融合抑制剂SC29EK和SFT耐药机制研究》一文中研究指出在HIV-1侵入细胞的过程中,包膜蛋白(Env)发挥了关键作用,介导了病毒与宿主细胞受体、共受体的结合以及病毒包膜与宿主细胞细胞膜的融合。在膜融合过程中,6-HB结构的形成是必需的步骤,因此其成为膜融合抑制药物作用的关键靶点。SC29EK与SFT同属于通过抑制病毒6-HB形成来阻断病毒与细胞膜融合过程的第叁代HIV-1膜融合抑制剂,都具有螺旋内盐桥的设计,相比前代抑制剂其拥有更好的结构稳定性和抗病毒效果。我们前期利用SC29EK筛选出了耐药株gp41蛋白保守序列上发生的氨基酸突变位点(Gln39、Asn43、Glu49),分别简称Q39R、N43K、E49A,利用SFT筛选出了耐药株gp41蛋白保守序列上发生的氨基酸突变位点(Val38、Ala47、Gln52),分别简称V38A、A47I、Q52R。本课题以能够表达HIV-1病毒Env包膜蛋白的质粒作为模板进行定点突变,获得了 15份突变质粒,分别对应筛选出来的点突变及点突变组合。利用capture ELISA技术检测证实了这些点突变或者点突变组合不会影响Env蛋白的表达。利用转染表达的包含点突变或者点突变组合的假病毒,我们分析了突变对病毒入侵能力、膜融合能力以及对膜融合抑制剂SC29EK与SFT耐药性的影响。利用以病毒NHR多肽N36为模板合成的包含有待研究点突变以及点突变组合的12种多肽,我们分析了突变对6-HB结构稳定性的影响,对N36与膜融合抑制剂之间结合力的影响。利用ELISA技术和6-HB构象特异性抗体,我们还探索了突变对6-HB构象的影响。综合来说,本课题主要从发现的点突变以及点突变组合对病毒耐药性、病毒Env功能、病毒6-HB结构稳定性、病毒N肽与膜融合抑制剂结合能力的影响这几个方面,来探讨SC29EK、SFT耐药株的耐药机制。通过对实验结果的分析,本课题研究得出以下结论:(1)N43K使得突变毒株对SC29EK高度耐药,当N43K与Q39R或者E49A组合,其对SC29EK耐药性会进一步提升,Q52R使得突变毒株对SFT高度耐药,Q52R与V38A、A47I结合会使其对SFT耐药性大幅提升;(2)这些突变同时使得毒株获得对T20、C34、2P23等不同膜融合抑制剂的交叉耐药能力;(3)部分突变能降低N肽与抑制剂的结合能力,部分突变能增强N肽与内源性C肽的结合能力,点突的组合还能发挥协同作用,从而产生更强的耐药性;(4)突变使病毒获得耐药性的同时,会使病毒Env蛋白的功能部分丧失;(5)点突变会改变病毒6-HB的构象。本课题研究为理解HIV-1耐药株的耐药机制提供了新的视角,加深了对gp41蛋白结构与功能关系的理解。(本文来源于《北京协和医学院》期刊2017-05-01）
膜融合抑制剂论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
研究目的与意义艾滋病是由人类免疫缺陷病毒引起的一种慢性传染病,目前尚未研制成功有效的艾滋病疫苗,抗HIV-1药物仍然是治疗艾滋病的主要手段。传统的抗HIV-1药物主要是针对病毒逆转录酶、蛋白酶或整合酶的小分子抑制剂,其发挥作用的靶点是病毒进入细胞后的阶段。随着HIV-1入侵宿主细胞分子机制的逐步阐明,阻止病毒进入细胞的HIV-1融合抑制剂逐渐成为艾滋病药物的研究热点。恩夫韦肽作为目前唯一被美国FDA批准的HIV-1融合抑制剂,因体内半衰期短和注射频繁等缺点严重制约了其临床应用。长效化HIV-1融合抑制剂具有更好的药代动力学特性,不仅可以降低药物的使用频率,减轻患者的痛苦和经济负担,还可以用于预防高危人群HIV-1的感染。但随着抗病毒治疗药物的广泛应用,HIV-1在药物选择压力下发生突变,导致耐药性的产生,致使病毒对药物敏感性下降或不敏感。聚乙二醇(PEG)修饰通过改善多肽药代动力学,从而延长药物半衰期,目前许多PEG化的多肽药物已用于临床。本课题与中科院微生物所合作合成了PEG化C34,以发现阻止HIV-1进入细胞的新一代长效化HIV-1融合抑制剂为最终目的,针对PEG化HIV-1融合抑制剂的耐药性这一科学问题,在全面分析其对我国HIV-1临床分离病毒株药物敏感性基础上,深入探讨PEG化HIV-1融合抑制剂的耐药突变位点及其引发耐药的机制,以期为今后药物设计提供新的思路。研究方法1.HIV-1病毒株的复制和制备采集自四川、广西、北京和安徽的47株中国主要流行亚型HIV-1临床分离株,两段法扩增HIV-1临床分离病毒株近全长基因序列,序列拼接、处理后构建进化树分析其亚型;分离外周血单个核细胞(PBMCs)用于47株临床分离病毒株的复制;pNL4-3转染HEK293T细胞获得实验室适应株NL4-3;在TZM-bl细胞上测定复制或转染所得病毒的半数组织细胞感染量(TCID50)和p24含量。2.基于TZM-bl细胞的HIV-1融合抑制剂的体外抑制实验与中科院微生物所合作完成了 PEG化HIV-1融合抑制剂的合成和制备。将T20、C34和PEG修饰的C34(PEG2kC34和PEG5kC34)倍比稀释后分别与HIV-1包膜蛋白、实验室适应株NL4-3以及47株中国主要流行亚型HIV-1临床分离株在TZM-bl细胞上共培养48 h,通过检测TZM-bl细胞相对荧光单位值计算PEG化C34对HIV-1包膜蛋白介导的细胞-细胞融合和HIV-1复制的抑制能力。3.PEG修饰前后C34对HIV-1 gp41六螺旋结构形成抑制实验通过圆二色谱检测PEG修饰前后C34与靶序列(N36)在195 nm到270 nm波长范围内以及在222 nm处从20℃到98℃温度范围内的摩尔椭圆率变化,通过计算α-螺旋的百分比和Tm值来确定两者之间的结合能力。将终浓度为100 μM的C34或PEG化C34与不同稀释度的N36在37℃孵育30 min,通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳测定多肽与N36形成六螺旋结构的能力。4.大鼠体内PEG化C34半衰期测定选取12只7周龄SD大鼠,随机分为3组。单次皮下注射PEG修饰前后C34,在注射前和注射后不同时间点从尾静脉采血,将倍比稀释的血浆与NL4-3病毒于TZM-bl细胞上共培养48 h,通过检测荧光表达情况,计算PEG修饰前后C34抑制50%病毒感染的血浆稀释度。5.PEG化HIV-1融合抑制剂的体外药物压力实验和耐药位点的鉴定MT2细胞每3至4天传代,通过观察合胞体的形成情况监测病毒复制。在每个病毒突破点,抑制剂的浓度加倍。运用巢式聚合酶链反应扩增不同多肽浓度下病毒gp41序列,通过比对获得病毒逃逸突变位点。以质粒pNL4-3为骨架,利用分子克隆技术和定点突变试剂盒,构建包含突变位点的质粒,将测序鉴定正确质粒转染HEK293T细胞,测定病毒滴度和p24含量。通过病毒表型耐药实验,比较病毒突变前后对PEG化C34和T20的药物敏感性,确定耐药位点。6..深度测序检测体外HIV-1融合抑制剂压力下病毒的耐药位点收集体外药物压力下病毒培养上清,提取第8、9和10代病毒培养上清RNA,一步法巢式PCR扩增HIV-1 gp41基因,纯化回收后送北京地坛医院传染病研究所完成测序。7..病毒适应性测定将含有PEG化C34耐药位点的病毒与野生毒株按1:11比例混合后定量感染PM1细胞,于感染的第3天至第6天收集半量培养液和细胞,用抗-Thy1.1和抗-Thy1.2抗体染色,经流式细胞仪检测感染细胞百分比,确定毒株的相对复制适应性。研究结果1.PEG化HIV-1融合抑制剂能够有效抑制我国主要流行亚型HIV-1临床分离病毒株的复制,呈现较好的广谱性。成功合成了两种PEG化HIV-1融合抑制剂,质谱分析其平均分子量分别为6,500 Da和9,300 Da,液相色谱分析其纯度均大于98%。敏感性实验表明PEG化HIV-1融合抑制剂可以有效抑制HIV-1包膜蛋白介导的细胞-细胞融合和实验室适应株NL4-3的复制,对我国主要流行亚型HIV-1临床分离病毒株特别是占比最高的CRF01 AE亚型毒株具有较好的抑制活性,PEG2kC34和PEG5kC34的EC50平均值分别为19.34 nM和19.64 nM;该类PEG化HIV-1融合抑制剂体外细胞毒性较低,其CC50均大于100μM。2.PEG化C34通过与NHR结合形成稳定的六螺旋结构抑制病毒包膜蛋白与细胞膜融合并呈现较长的半衰期圆二色谱结果显示两种PEG化C34均可与HIV-1 gp41相应序列结合,形成高α-螺旋复合物,PEG2kC34与N36形成93.90%α-螺旋,PEG5kC34与N36形成96.58%α-螺旋;复合物N36/PEG2kC34和N36/PEG5kC34的熔解温度分别为57.03 ℃和55.04 ℃。非变性凝胶电泳结果显示,与C34相似,PEG修饰后的C34同样可以与N36结合形成稳定的六螺旋结构,并且在一定范围内这种结合与N36具有剂量依赖关系。此外,PEG修饰使C34在SD大鼠体内半衰期显着延长。3.L44V和N126K位点同时出现增强了病毒对PEG化C34的耐药性压力实验中多肽C34、PEG2kC34和PEG5kC34的最终浓度分别为其起始浓度的4.096倍、1,024倍和512倍。经过7个月筛选,获得叁株HIV-1耐药株。其突变发生在gp41的第44、126和250位氨基酸。在C34压力下,第9代开始出现之前未报道的L44V突变位点,N126K突变位点则在更早期的第5代开始出现;在PEG2kC34压力下,L44V和N126K突变同时在第4代出现;在PEG5kC34压力下,本实验中未检测L44V或者N126K突变位点,但在第7代检测到R250Q突变位点。L44V或N126K突变可导致PEG2kC34和PEG5kC34的药物敏感性降低4.2倍和2.3倍或1.2倍和1.6倍,而L44V和N126K双位点突变后病毒的药物敏感性降低了 12.4倍或9.8倍。10E8抗体对含突变位点病毒株的中和实验结果表明,耐药位点对gp41结构产生了一定的影响。因此,我们推测PEG化C34的耐药性需要L44V和N126K共同维持。4.L33S和R271K位点同时出现增强了PEG化T20的耐药性Gp41区只出现L33S突变位点时,T20、PEG2kT20和PEG5kT20的EC50均有较大改变,但改变程度存在差异,其EC50分别变为原来的12倍、83倍以上和28倍;Gp120区只出现R271K突变位点时,抑制剂的EC50变化较小,且抑制剂间差异也较小,分别变为原来的1～3倍;L33S和R271K同时突变时抑制剂的EC50表现出较之前两位点单独突变时更大的差异,抑制剂的EC50均变为原来的83倍以上,即gp120区的R271K能够增强L33S的耐药性,之前我们未见相关报道。T20耐药株对PEG修饰T20的交叉耐药实验结果显示,T20耐药性与PEG2kT20或PEG5kT20存在差异,其中NL4-3-V38A、NL4-3-V38E-N42S、NL4-3-V38A-N42D和NL4-3-V38A-N42T对T20、PEG2kT20和PEG5kT20均表现出了不同程度的耐药;而NL4-3-N43K对T20和PEG5kT20表现出一定程度的耐药但本课题中未观察到其对PEG2kT20的耐药现象。HIV-1 gp41基因深度测序,检测到多个组内单核苷酸多态性位点,并且PEG化C34和T20的耐药性存在差异。5.N126K突变位点显着降低病毒的相对复制适应性流式细胞仪检测AT1和含耐药位点AT2病毒株的相对复制适应性。实验结果显示,L44V、N126K和R250Q均可以在不同程度上降低病毒的相对复制适应性,其中N126K突变可显着影响病毒的相对复制适应性,但该显着性在溶液中存在C34的情况下消失。结论PEG化HIV-1融合抑制剂可以有效抑制HIV-1 env介导的细胞-细胞融合和实验室适应株NL4-3的复制,对我国主要流行亚型HIV-1临床分离病毒株也具有较好的抑制广谱性,在SD大鼠体内的半衰期显着延长。N126K和L44V位点同时出现能够增强PEG化C34耐药性,N126K突变位点能够显着降低病毒的相对复制适应性;与PEG化C34不同,PEG化T20的主要耐药位点是L33S,L33S和R271K同时出现能增强其耐药性。本研究为长效化HIV-1融合抑制剂的耐药性及作用机制研究提供了一定的理论基础。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
膜融合抑制剂论文参考文献
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