本文主要研究内容
作者王健（2019）在《小西葫芦黄花叶病毒遗传多样性及致病力分析》一文中研究指出：小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus）,是侵染葫芦科作物的主要病毒之一,可引起严重花叶、皱缩、果实畸形等症状,给葫芦科作物的生产造成极为严重的损失。建立准确的ZYMV检测体系和种植抗病品种是目前最为有效的防治措施。本研究制备了ZYMV外壳蛋白特异性抗血清,分析了危害山东葫芦科作物的ZYMV分离物的分类地位,构建了ZYMV侵染性克隆并研究了HCpro WxxxG基序在ZYMV致病过程中的作用,筛选了抗ZYMV的葫芦科作物品种,为有效防治ZYMV提供了基础。主要研究结果如下:（1）ZYMV CP特异性多克隆抗体的制备及应用。利用ZYMV特异性引物扩增CP基因编码序列,并克隆到原核表达载体pEHISTEV上。通过对宿主菌种类、IPTG诱导时间及浓度等因素进行筛选,获得最佳表达条件:Rosetta菌株,利用0.2 mmol·L-1 IPTG诱导4 h。通过原核表达方法成功诱导表达出37 kDa左右的融合蛋白,将融合蛋白免疫健康新西兰长耳兔获得效价为1:32768的ZYMV CP特异性抗血清。与RT-PCR对比发现,制备的抗血清具有高度的准确性。利用该抗血清对西葫芦（绿源冬宝）和甜瓜（火银瓜）种子检测发现,种子带毒率分别为39.8%、15.1%,幼苗带毒率为2.56%和5.13%,对种子进行热处理可有效降低幼苗带毒率。（2）ZYMV两个山东分离物（CN:Cm:17、CN:Lc:17）全基因组序列的克隆及分析。在山东泰安采集到的有明显黄花叶症状的丝瓜和南瓜样品中检测到ZYMV,利用RT-PCR和5′末端序列扩增技术（RACE）获得了两个分离物的全基因组序列,分别命名为CN:Cm:17（南瓜分离物）和CN:Lc:17（丝瓜分离物）。序列分析结果表明,CN:Cm:17和CN:Lc:17基因组除Poly（A）尾巴外分别含有9,593和9,591个核苷酸（Nucleotides,nt）,编码一个含3 080氨基酸的多聚蛋白。在多聚蛋白氨基酸水平上,CN:Cm:17与CN:Lc:17一致率为96.7%,与NCBI数据库中48个ZYMV分离物一致率分别为90.3%97.8%、90.5%98.4%。重组分析发现,CN:Lc:17分离物内具有显著重组事件,为KR:KR-PA:05和CN:Cm:17两个分离物的重组体。基于多聚蛋白编码序列的系统进化聚类结果显示分组与分离物的地理起源存在密切相关性,中国分离物分别聚集在A-V和A-VI亚组。（3）ZYMV CN:Cm:17分离物全长侵染性cDNA克隆的构建。利用同源重组的方法将CN:Cm:17全基因组克隆到含35S启动子的农杆菌双元载体pCam35S上,命名为pCamZYMV。将含有pCamZYMV的利用农杆菌浸润接种到西葫芦（Cucurbita pepo）、南瓜（Cucurbita moschata）等寄主上,接种14天后表现与野生型ZYMV类似症状,侵染效率为100%,表明构建的pCamZYMV具有较好的侵染性。将带绿色荧光蛋白gfp基因序列插入到pCamZYMV侵染性克隆NIb和CP之间,获得pCamZYMV-GFP。将其通过农杆菌浸润方法接种西葫芦、南瓜,5天后接种叶上可观察到绿色荧光,14天后系统叶片表现花叶症状,并在发病部位观察到明显绿色荧光。（4）WxxxG保守基序影响ZYMV致病力并参与HCpro抑制RNA沉默功能。在pCamZYMV-GFP侵染性克隆的HCpro编码区域WxxxG基序保守位点引入突变,获得单突变体W207A、G211A及双突变体WG。将突变体接种至西葫芦品种绿源冬宝发现,突变W207位点或WG位点均减轻症状,显著降低病毒积累水平;突变G211位点对病毒症状和积累水平无明显影响。RNA沉默试验分析发现,突变W207位点对HCpro抑制RNA沉默能力无明显影响,但突变G211位点能够显著降低ZYMV HCpro抑制RNA沉默能力。（5）40个葫芦科品种对ZYMV的抗性鉴定。结果发现,精选唐山秋瓜和青丰长瓠子瓜为高抗品种;雪峰小玉五号和金福为抗病品种;津研四号、中农28号、耐热王中王、泰国中绿丝瓜、蟋蟀牌肉多多、高抗巨龙、盈克二号、浙蒲6号和佳丽蒲瓜9个为中抗品种。
Abstract
xiao xi hu lu huang hua xie bing du （Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV）shu yu ma ling shu Ybing du shu （Potyvirus）,shi qin ran hu lu ke zuo wu de zhu yao bing du zhi yi ,ke yin qi yan chong hua xie 、zhou su 、guo shi ji xing deng zheng zhuang ,gei hu lu ke zuo wu de sheng chan zao cheng ji wei yan chong de sun shi 。jian li zhun que de ZYMVjian ce ti ji he chong zhi kang bing pin chong shi mu qian zui wei you xiao de fang zhi cuo shi 。ben yan jiu zhi bei le ZYMVwai ke dan bai te yi xing kang xie qing ,fen xi le wei hai shan dong hu lu ke zuo wu de ZYMVfen li wu de fen lei de wei ,gou jian le ZYMVqin ran xing ke long bing yan jiu le HCpro WxxxGji xu zai ZYMVzhi bing guo cheng zhong de zuo yong ,shai shua le kang ZYMVde hu lu ke zuo wu pin chong ,wei you xiao fang zhi ZYMVdi gong le ji chu 。zhu yao yan jiu jie guo ru xia :（1）ZYMV CPte yi xing duo ke long kang ti de zhi bei ji ying yong 。li yong ZYMVte yi xing yin wu kuo zeng CPji yin bian ma xu lie ,bing ke long dao yuan he biao da zai ti pEHISTEVshang 。tong guo dui su zhu jun chong lei 、IPTGyou dao shi jian ji nong du deng yin su jin hang shai shua ,huo de zui jia biao da tiao jian :Rosettajun zhu ,li yong 0.2 mmol·L-1 IPTGyou dao 4 h。tong guo yuan he biao da fang fa cheng gong you dao biao da chu 37 kDazuo you de rong ge dan bai ,jiang rong ge dan bai mian yi jian kang xin xi lan chang er tu huo de xiao jia wei 1:32768de ZYMV CPte yi xing kang xie qing 。yu RT-PCRdui bi fa xian ,zhi bei de kang xie qing ju you gao du de zhun que xing 。li yong gai kang xie qing dui xi hu lu （lu yuan dong bao ）he tian gua （huo yin gua ）chong zi jian ce fa xian ,chong zi dai du lv fen bie wei 39.8%、15.1%,you miao dai du lv wei 2.56%he 5.13%,dui chong zi jin hang re chu li ke you xiao jiang di you miao dai du lv 。（2）ZYMVliang ge shan dong fen li wu （CN:Cm:17、CN:Lc:17）quan ji yin zu xu lie de ke long ji fen xi 。zai shan dong tai an cai ji dao de you ming xian huang hua xie zheng zhuang de si gua he na gua yang pin zhong jian ce dao ZYMV,li yong RT-PCRhe 5′mo duan xu lie kuo zeng ji shu （RACE）huo de le liang ge fen li wu de quan ji yin zu xu lie ,fen bie ming ming wei CN:Cm:17（na gua fen li wu ）he CN:Lc:17（si gua fen li wu ）。xu lie fen xi jie guo biao ming ,CN:Cm:17he CN:Lc:17ji yin zu chu Poly（A）wei ba wai fen bie han you 9,593he 9,591ge he gan suan （Nucleotides,nt）,bian ma yi ge han 3 080an ji suan de duo ju dan bai 。zai duo ju dan bai an ji suan shui ping shang ,CN:Cm:17yu CN:Lc:17yi zhi lv wei 96.7%,yu NCBIshu ju ku zhong 48ge ZYMVfen li wu yi zhi lv fen bie wei 90.3%97.8%、90.5%98.4%。chong zu fen xi fa xian ,CN:Lc:17fen li wu nei ju you xian zhe chong zu shi jian ,wei KR:KR-PA:05he CN:Cm:17liang ge fen li wu de chong zu ti 。ji yu duo ju dan bai bian ma xu lie de ji tong jin hua ju lei jie guo xian shi fen zu yu fen li wu de de li qi yuan cun zai mi qie xiang guan xing ,zhong guo fen li wu fen bie ju ji zai A-Vhe A-VIya zu 。（3）ZYMV CN:Cm:17fen li wu quan chang qin ran xing cDNAke long de gou jian 。li yong tong yuan chong zu de fang fa jiang CN:Cm:17quan ji yin zu ke long dao han 35Sqi dong zi de nong gan jun shuang yuan zai ti pCam35Sshang ,ming ming wei pCamZYMV。jiang han you pCamZYMVde li yong nong gan jun jin run jie chong dao xi hu lu （Cucurbita pepo）、na gua （Cucurbita moschata）deng ji zhu shang ,jie chong 14tian hou biao xian yu ye sheng xing ZYMVlei shi zheng zhuang ,qin ran xiao lv wei 100%,biao ming gou jian de pCamZYMVju you jiao hao de qin ran xing 。jiang dai lu se ying guang dan bai gfpji yin xu lie cha ru dao pCamZYMVqin ran xing ke long NIbhe CPzhi jian ,huo de pCamZYMV-GFP。jiang ji tong guo nong gan jun jin run fang fa jie chong xi hu lu 、na gua ,5tian hou jie chong xie shang ke guan cha dao lu se ying guang ,14tian hou ji tong xie pian biao xian hua xie zheng zhuang ,bing zai fa bing bu wei guan cha dao ming xian lu se ying guang 。（4）WxxxGbao shou ji xu ying xiang ZYMVzhi bing li bing can yu HCproyi zhi RNAchen mo gong neng 。zai pCamZYMV-GFPqin ran xing ke long de HCprobian ma ou yu WxxxGji xu bao shou wei dian yin ru tu bian ,huo de chan tu bian ti W207A、G211Aji shuang tu bian ti WG。jiang tu bian ti jie chong zhi xi hu lu pin chong lu yuan dong bao fa xian ,tu bian W207wei dian huo WGwei dian jun jian qing zheng zhuang ,xian zhe jiang di bing du ji lei shui ping ;tu bian G211wei dian dui bing du zheng zhuang he ji lei shui ping mo ming xian ying xiang 。RNAchen mo shi yan fen xi fa xian ,tu bian W207wei dian dui HCproyi zhi RNAchen mo neng li mo ming xian ying xiang ,dan tu bian G211wei dian neng gou xian zhe jiang di ZYMV HCproyi zhi RNAchen mo neng li 。（5）40ge hu lu ke pin chong dui ZYMVde kang xing jian ding 。jie guo fa xian ,jing shua tang shan qiu gua he qing feng chang hu zi gua wei gao kang pin chong ;xue feng xiao yu wu hao he jin fu wei kang bing pin chong ;jin yan si hao 、zhong nong 28hao 、nai re wang zhong wang 、tai guo zhong lu si gua 、xi shuai pai rou duo duo 、gao kang ju long 、ying ke er hao 、zhe pu 6hao he jia li pu gua 9ge wei zhong kang pin chong 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自山东农业大学的王健，发表于刊物山东农业大学2019-07-08论文，是一篇关于小西葫芦黄花叶病毒论文,抗血清制备论文,遗传多样性论文,抗病鉴定论文,山东农业大学2019-07-08论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自山东农业大学2019-07-08论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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