一、MD CVI988疫苗的PFU与免疫效果（论文文献综述）
石梦雅[1]（2020）在《2017-2019马立克氏病病毒分子流行病学及分离株GX18NNM4的致病性研究》文中提出马立克氏病（Marek’s diseases,MD）由马立克氏病病毒（Marek’s diseases virus,MDV）引起的一种传染性T淋巴细胞增生性疾病。在过去的六十年,随着MD疫苗的成功研制及广泛应用,有效控制了疾病的发生。但近年来,特超强毒株的出现和野毒株毒力的增强成为疫苗免疫失败的主要原因,给养禽业带来新的威胁以及更大的经济损失。因此,有必要对鸡群中自然流行的MDV进行流行病学监控,对了解病毒的进化趋势以及现有MD疫苗保护力都具有重要意义。广西是我国优质鸡的生产大省,具有品种繁多和饲养周期长等特点,在生产中更容易发生MDV的感染。本课题对2017-2019年广西及其周边地区MDV进行分子流行病学调查,通过细胞培养进行病毒分离、IFA鉴定和致瘤基因meq的序列测定,共分离到23株MDV分离株。序列分析结果显示,23株分离株相似性较高,与中国广西早期分离株GX0101亲缘性较近;根据其氨基酸位点及系统进化树分析,均有中国超强或特超强毒株的特点;对分离株病例背景进行分析发现,均从免疫过MD疫苗的鸡群中所分离,且多以与其他两个肿瘤病病毒（禽白血病病毒和网状内皮组织增殖病病毒）混合感染（73.9%,17/23）。结合本课题所分离的23株MDV的meq基因和Gen Bank数据库里过去55年（1964-2019）已发表的149株MDV meq基因序列,分别构建三个数据集,通过贝叶斯系统动力学方法进行分析。系统发育树显示,全球172株MDV被分为2个clusters,Cluster 1有71株,包括温和型毒株、疫苗毒株和国外强毒株;Cluster 2有101株,主要以中国强毒分离株为主,本课题的23株分离株构成一个相对独立的进化簇;地理系统分析显示,揭示中国早期的MDV源自国外（美国、日本）,并呈现由北方到南方蔓延扩散的趋势;种群动态分析发现,自2005年起,中国分离株meq基因的遗传多样性呈现持续增长趋势,并分别在2007-2012和2015-2019呈现强的上升趋势。本课题对从免疫了MD疫苗的种鸡群中临床暴发MD病鸡中分离到的GX18NNM4分离株进行了致病性研究,内容包括人工感染试验和商品疫苗免疫保护试验,从临床肿瘤发生及其病理组织学观察、MDV病毒载量的动态检测、细胞因子PD-1和PD-L1的m RNA表达水平检测、免疫保护指数（protection index,PI）等方面进行评价,探究分离株的致病性以及现有商品疫苗的保护效果。未免疫攻毒组鸡只出现垂翅、羽毛粗乱、消瘦、精神沉郁等临床症状,最早于攻毒后16天出现死亡,剖检发现在心脏、肝脏、脾脏和胰腺等器官有肿瘤;免疫CVI988和814疫苗攻毒组的鸡只最早出现死亡分别在攻毒后22天和18天,剖检发现部分鸡只心脏、胰腺等器官有肿瘤;未免疫攻毒组外周血淋巴细胞的病毒载量在攻毒后28天达到峰值103.7copies/106个细胞,而两个疫苗免疫攻毒组的病毒载量在各个检测时间点均低于未免疫攻毒组的;对MDV感染鸡的脾脏和盲肠扁桃体进行PD-1和PD-L1 m RNA表达水平检测,发现PD-1或PD-L1 m RNA脾脏的表达明显高于盲扁（P<0.05）,但总体趋势基本相同,值得注意的是,在未免疫攻毒组中表达水平显着高于免疫攻毒组（P<0.05）。未免疫攻毒组肿瘤发生率为70.7%（41/58）,CV1988疫苗攻毒组的肿瘤发生率为42.5%（17/40）,保护指数39.9%。免疫814疫苗攻毒组的肿瘤发生率为27.5%（11/40）,保护指数61.1%。本课题研究揭示了早期中国MDV的来源及其传入我国后的传播扩散方向以及中国分离株meq基因遗传多样性的变化规律,同时证明目前MD在南方优质鸡中仍呈地方性的流行并严重危害养鸡业,出现了目前的商品疫苗已不能提供完全保护的vv或vv+MDV的分离株。
李凯[2]（2018）在《表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组马立克氏病病毒活载体疫苗研究》文中研究说明鸡马立克氏病（Marek’s disease,MD）和鸡传染性法氏囊病（infectious bursal disease,IBD）是危害我国养禽业健康发展的两种重要的免疫抑制病,其广泛流行给我国养禽业带来了巨大的经济损失。疫苗是控制MD和IBD的主要手段。目前MD主要通过血清1型弱毒疫苗预防。用于预防IBD的疫苗主要是传统活疫苗和灭活疫苗,但传统疫苗不仅易于受到母源抗体的干扰,而且IBD中等毒力活疫苗可以造成一定程度的法氏囊损伤和免疫抑制,因此迫切需要研制更加安全有效的新型IBD疫苗。本研究对我国IBDV超强毒（wIBDV）分离株的遗传变异、抗原性和致病性进行了分析。结果发现,我国wIBDV毒株正在发生持续性进化。与我国早期wIBDV分离株相比,我国2000年后分离的vvIBDV毒株的基因组A、B节段均有一定程度的变异发生;我国vvIBDV毒株与欧洲wIBDV参考毒株的抗原性无显着差异;目前wIBDV毒株的致病性有增强趋势。wIBDV HLJ0504毒株是目前我国的wIBDV流行毒株。鸡马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）弱毒疫苗株是构建重组活载体疫苗的理想载体。为了构建表达IBDV VP2基因的重组MDV活载体疫苗,本研究将MDV血清1型弱毒疫苗814株基因组DNA分段插入Fosmid粘粒,构建了 814株基因组粘粒文库;在此基础上,选取粘粒组合,建立了 MDV 814疫苗株多片段粘粒拯救系统。将eGFP基因表达盒分别插入MDV 814 株基因组不同位点,拯救获得5株稳定表达eGFP的重组病毒。经鉴定,5株重组病毒的复制特性与原疫苗株病毒基本一致;eGFP基因在UL区三个位点的表达水平无显着差异,高于US2位点,US10位点的表达水平最低。将wIBDV HLJ0504株的VP2基因分别插入MDV 814株基因组的UL41、US2、US10位点,获得3株表达VP2基因的重组MDV（r814UL41VP2、r814US2VP2 和 r814US10VP2）。其中,r814US2VP2免疫SPF鸡后,能够对wIBDV和wMDV的攻毒提供完全保护。通过r814US2VP2（命名为rMDV-VP2株）最小免疫剂量试验,确定了该疫苗的使用剂量为2000PFU/羽份。rMDV-VP2疫苗对wIBDV的保护效果与商品化Vaxxitek HVT-IBD疫苗相当,优于IBD中毒力活疫苗;rMDV-VP2疫苗对wMDV的保护效果与商品化MDV血清1型弱毒疫苗相当,显着优于Vaxxitek HVT-IBD疫苗。rMDV-VP2疫苗对不同的wIBDV分离株都能提供高效免疫保护,可以用于不同品种的商品蛋鸡和地方品种鸡。rMDV-VP2疫苗的免疫保护可以覆盖IBDV的易感期（3-8周龄）,并具有至少6个月的抗体持续期。rMDV-VP2疫苗对靶动物和非靶动物均是安全的;rMDV-VP2疫苗的水平传播能力极低,无垂直传播现象;疫苗株病毒免疫鸡后的排毒水平极低,在使用环境中不存在该疫苗株病毒及其病毒DNA的残留。综上所述,rMDV-VP2疫苗安全有效,可以作为一种IBD-MD重组二联活疫苗用于IBD和MD的预防。
林璐璐[3]（2018）在《ALV引起的免疫抑制对马立克氏病疫苗免疫保护效果的影响》文中指出目前危害养鸡业的三大病毒性肿瘤病包括禽白血病（avian leukosis,AL）、马立克氏病（Marek’s disease,MD）和禽网状内皮组织增殖病（reticuloendotheliosis,RE）。流行病学调查显示,在J亚群AL病毒（avian leukosis virus subgroup J,ALV-J）未传入广西地方品种鸡之前,MD病毒（Marek’s disease virus,MDV）是临床肿瘤的主要病原,2014年开始ALV逐渐取代MDV成为临床肿瘤的主要病原。最近几年,发现由ALV和MDV混合感染病例在临床上比较常见。因此,研究ALV和MDV的混合感染及其对肿瘤发生的影响对于目前肿瘤病的综合防控具有重要意义。本课题首先进行ALV-J人工胚胎感染,探究阳性鸡对MD疫苗CVI988/Rispens免疫应答效果的影响;随后用ALV阳性的种鸡配种产蛋孵化的后代进行疫苗免疫的攻毒保护试验,确定自然垂直感染ALV对MD疫苗CVI988/Rispens免疫保护效果的影响。首先,本课题采取7天龄鸡胚卵黄囊接种的方式进行人工胚胎感染ALV-J本地分离株GX15MM6-2,然后继续孵化出壳并饲养观察试验鸡至60d龄。观察指标包括生长性能、常规免疫的MD疫苗CVI988/Rispens及ND、AI-H5和AI-H9灭活苗的抗体应答水平、外周血T淋巴细胞的比例、IL-10的mRNA表达水平、临床发病情况以及病理剖检病变等。结果发现,人工胚胎接种感染ALV-J可抑制鸡只的体重增长,导致免疫的CVI988/Rispens疫苗及ND、AI-H5和AI-H9灭活苗的抗体应答水平显着降低（P<0.05）,ALV-J可以降低CD4+T淋巴细胞亚群的比例,升高CD8+T淋巴细胞亚群比例,从而降低CD4+/CD8+。同时IL-10的mRNA表达水平显着提高（P<0.05）。实验证明,胚胎感染ALV-J可抑制孵化鸡只的生长性能以及CVI988/Rispens疫苗和ND、AI-H5和AI-H9灭活苗的免疫的抗体应答水平。然后,本课题分别利用ALV阳性种公鸡×阳性种母鸡以及阴性种公鸡×阴性种母鸡进行配种、产蛋并孵化出的雏鸡,按常规方法分别在1d龄免疫MD疫苗CVI988/Rispens,7 d龄用重组禽流感病毒H5亚型（Re-6株+Re-3株）二价灭活油苗和新城疫-禽流感H9亚型（LaSota株+F株）二联灭活油苗分别免疫,然后在15 d龄分别用vvMDV的本地分离株GXY2和vMDV的参考株GA分别进行攻毒接种。然后观察试验鸡的生长性能、免疫器官指数、灭活疫苗的抗体应答水平、MDV病毒载量、临床症状及病理组织学变化,并对试验鸡的发病率、死亡率、肿瘤发生率和疫苗保护指数进行计算统计。结果发现,ALV阳性种鸡的后代MDV病毒载量显着高于ALV阴性种鸡后代的（P<0.05）,并且ALV阳性种鸡后代的发病率、死亡率、肿瘤发生率均高于ALV阴性种鸡后代的,而疫苗保护指数则低于ALV阴性种鸡后代的,同时ALV和MDV均可显着抑制鸡只体重增长（P<0.05）,影响免疫器官发育。实验证明鸡只垂直感染ALV可引起免疫抑制,导致CVI988/Rispens疫苗的免疫保护效果降低。本课题研究结果证明,种鸡自然垂直感染和胚胎接种ALV,均可导致其孵化出雏鸡的免疫抑制以及MD疫苗免疫保护效果的降低。
连雪[4]（2018）在《马立克病毒通过DNA损伤应答通路调控病毒复制的研究》文中研究表明马立克病（Marek’s Disease,MD）是由马立克病毒（Marek’s Disease Virus,MDV）引起的鸡恶性T淋巴细胞增生性肿瘤病,是危害世界养禽业的严重传染病之一。目前随着病毒进化,新的超强毒株出现,已造成鸡的免疫失败,因此,新的疫苗和防控策略亟待开发,这离不开对MDV病毒基因功能和致病机理的深入研究。此外,由于MDV与人类疱疹病毒相似的基因组成和生理特性,其可作为研究淋巴瘤发病机制和免疫调控的生物医学模型。综上所述,深入研究MDV致病分子机理,阐明疱疹病毒与细胞信号传导通路的相互作用机理,对MD的防控及人类肿瘤学研究都具有重要意义。本研究基于以上背景,开展了以下5个方面的研究:1.MDV感染引起细胞DNA损伤病原微生物感染可造成机体DNA损伤并激活DNA损伤应答通路（DNA Damage response,DDR）。本研究通过建立 CEF（Chicken embryo fibroblast）细胞的彗星试验,检测细胞内DNA损伤程度。收集Md5和CVI988感染1、2、3和4天的CEF细胞样品,发现MDV感染可引起DNA损伤,并随着感染时间的延长,含有DNA损伤的细胞逐渐增多,损伤程度逐渐加大,说明DNA损伤有可能与病毒复制产生的复制压力有关。通过Western-blot检测DDR的下游标志物p53和p21发现,MDV感染细胞中p53和p21的蛋白表达水平升高,说明MDV感染激活细胞中DDR通路。由此可见,MDV感染造成细胞内DNA损伤并激活DDR通路。2.DNA损伤应答通路对MDV复制的影响病毒感染细胞中DDR通路的激活是机体抵御病原体入侵的机制之一,相反,病毒也可以抑制DDR通路,以消除其对自身繁殖的不利影响。本研究通过使用特异性抑制剂分别阻断ATM、ATR或DNA-PK介导的DDR通路。Western-blot检测发现,当使用VE-821阻断CEF细胞内ATR通路后,MDV的VP22蛋白表达量升高,说明病毒复制增加。相反,使用DNA损伤药物羟基脲（Hydroxyurea,HU）处理细胞,激活细胞内ATR-Chk1通路时,MDV的VP22蛋白表达量下降,说明MDV的复制被显着抑制。进一步的研究发现,MDV感染早期12 h,激活细胞内的ATR-Chk1通路,pChk1水平升高,而感染16至24 h后,病毒感染细胞中pChk1水平低于对照组。当使用DNA损伤药物ETP激活ATR-Chk1通路时,MDV感染可阻断ETP引起的Chk1磷酸化。此外,Western-blot检测STAT3通路发现,MDV感染可激活STAT3磷酸化,且pSTAT3的上升与pChk1的下降存在对应关系。上述研究结果表明,MDV感染通过抑制Chk1的磷酸化,阻碍ATR-Chk1通路下游信号的转导,促进病毒自身的复制,而这一调控机制与STAT3通路的激活存在一定联系。3.MDV激活STAT3调控ATR-Chk1通路STAT3作为一种重要的核转录因子,在多种生理过程中起作用,包括胚胎发育、炎症、免疫、伤口愈合和肿瘤的发生。Western-blot检测Md5和CVI988感染3、6、12、24、48和72 h的CEF细胞样品,发现MDV在感染早期3 h即引起STAT3的705位酪氨酸和727位丝氨酸磷酸化激活,并随着感染时间增加,pSTAT3和STAT3含量逐渐升高。使用抑制剂Stattic阻断细胞内STAT3激活,可导致细胞内pChk1升高,并且在STAT3被抑制的情况下,MDV感染无法抑制Chk1磷酸化。Western-blot和RT-PCR检测Md5和CVI988感染细胞证实,使用抑制剂Stattic预处理CEF细胞后,抑制剂处理组与对照组相比,MDV的病毒蛋白VP22表达量下降、病毒基因VP22和pp38的mRNA水平下降,说明细胞内STAT3通路被抑制,导致MDV无法阻断ATR-Chk1通路,造成病毒复制减少。本研究表明,STAT3是MDV抑制ATR-Chk1通路的关键分子。4.细胞氧化应激反应调控MDV复制活性氧（ROS）会损害脂质,蛋白质和DNA,从而引起各种疾病,如衰老、癌症和退行性神经元疾病等。在致瘤病毒中,氧化应激反应与细胞癌变以及病毒再激活有关。本研究使用活性氧的细胞渗透性指示剂H2DCFDA测定Md5感染细胞中ROS的水平,通过荧光显微镜和流式细胞分析技术,发现Md5感染1 d后,实验组细胞与对照组相比ROS增加,随着感染天数增加,ROS在MDV感染细胞中逐渐积累。已有研究表明ROS作为信号分子,可提高细胞内NADPH氧化酶活性,从而激活JAK/STAT3通路。因此本研究使用NADPH氧化酶抑制剂 Apocynin（APO）和 Diphenyleneiodonium（DPI）处理 CEF 细胞,Western-blot检测Md5的复制发现,使用NADPH氧化酶抑制剂APO和DPI处理细胞,可抑制细胞内STAT3通路,使pChk1水平升高,MDV复制减少。RT-PCR检测也证实,抑制剂APO和DPI处理组中病毒基因VP22和pp38的mRNA水平低于对照组。上述研究结果表明,MDV感染可引起细胞内ROS积累,通过氧化应激反应,提高NADPH氧化酶活性,从而激活STAT3通路,导致ATR-Chk1通路的抑制,促进病毒增殖。而打破细胞氧化还原平衡,抑制NADPH氧化酶活性,病毒复制减少,这一发现证明ROS-STAT3在MDV感染中起到重要作用。5.丹顶鹤马立克病临床病例的分子生物学诊断MDV可以感染鸡形目、鸮形目、雁形目和隼形目。通过对南京红山动物园的丹顶鹤进行剖检和组织病理切片检查发现,发病丹顶鹤全身布满肿瘤结节,心脏和肝脏切片显示组织中存在大、中、小三型多形型淋巴样细胞,为肿瘤细胞典型特征。利用分子生物学诊断技术鉴定丹顶鹤组织样品,分别通过RT-PCR和PCR方法在两只疑似感染MDV鹤的羽毛、肝脏、肾脏,肌肉和脾脏等组织的cDNA和基因组中均检测到MDV基因Meq和gB的基因片段。从鹤的脾脏和肝脏组织中扩增获得Meq、VP22和L-Meq全长基因,测序后对其蛋白质序列进行同源性比对和进化树分析,证实丹顶鹤中发现的MDV为血清1型强毒株,说明MDV可感染鹤形目并导致肿瘤发生。虽然动物园中人工饲养的丹顶鹤可考虑通过疫苗接种,预防MDV感染,但是野生鹤群无法接种疫苗,一旦感染MDV,可能对这一濒危种群产生巨大影响,而其迁徙特性,也会造成MDV扩散的风险。
温良海[5]（2017）在《MDV悬浮培养技术工艺及免疫保护研究》文中研究表明马立克氏病（Marek′s disease,MD）是由马立克氏病病毒（Marek′s disease virus,MDV）血清1型引起的鸡的一种免疫抑制性疾病,以淋巴组织增生为主要特征,具有高度传染性,给养鸡业造成严重的经济损失。目前,主要采用疫苗接种的方式来预防该病的发生。国内马立克氏病毒疫苗通常以鸡胚成纤维细胞作为制苗基质,采用滚瓶的方式进行生产。因使用SPF鸡胚成本高,原代细胞制备费时费力且易污染外源病毒等缺点,传统的疫苗制备方式已与当前利用动物细胞大规模悬浮培养病毒不相适应。为了研究更加高效的马立克氏病毒疫苗制备方法,本研究以DF-1细胞作为制苗基质来代替传统的原代鸡胚成纤维细胞,用微载体悬浮培养代替传统的玻璃滚瓶培养马立克氏病毒,从而为利用生物反应器大规模生产马立克氏病毒疫苗提供参考依据。为了确定DF-1细胞培养的最佳条件,本研究对DF-1细胞在细胞瓶中培养的复苏及冻存、细胞传代、培养基种类等条件进行了优化。结果表明,在37℃、pH7.2,使用含10%新生牛血清但不含HEPES缓冲液的DMEM/F12培养基时生长最好,在细胞传代时,按每平方厘米贴壁面积接种8×104-12×104个DF-1细胞更有利于细胞的培养。悬浮培养时,采用20r/min持续搅拌的起始搅拌方式,微载体浓度为3-7g/L、按每个微载体接种50个DF-1细胞能获得最佳的悬浮培养效果。通过细胞培养瓶中对马立克氏病毒在DF-1细胞中的培养条件进行优化,结果表明,MDV（CVI988/Rispens株）在DF-1细胞上能够良好的增殖。马立克氏病毒在DF-1细胞中最佳接毒方式为同步接毒,最佳MOI为0.02,维持液最佳换液时间为接毒后24h,最佳收毒时间为接毒后72h。微载体悬浮培养MDV（CVI988/Rispens株）的试验表明:采用同步接毒的方式,按每个微载体表面接种150-200个细胞,MOI为0.02时接种CVI988/Rispens病毒株能够取得最好的病毒培养效果。疫苗免疫保护试验表明,以DF-1细胞作为制备MDV（CVI988/Rispens株）疫苗的基质,采用微载体悬浮培养技术制备的MDV（CVI988/Rispens株）疫苗对SPF鸡进行免疫,免疫后5 d对鸡只进行MDV超强毒株Md5株攻毒。结果显示,以DF-1细胞悬浮培养制备的MDV疫苗能够取得与商品疫苗CVI988/Rispens株相当的保护效率,达到90%以上。疫苗免疫不会对鸡的生长状况、体重以及免疫器官造成明显的影响。本研究利用DF-1细胞代替原代鸡胚成纤维细胞,采用细胞搅拌瓶和微载体悬浮培养MDV,为MDV疫苗和其他生物制品的大规模生产开辟了一条新途径,而且更加符合现代生物制品行业发展的趋势,具有较大的理论意义和实用价值。
杨洋[6]（2016）在《含REV-LTR基因的马立克氏病毒活疫苗的生物安全评价及免疫效力研究》文中研究表明鸡马立克氏病（Marek’s disease, MD）是以淋巴组织增生、外周神经麻痹和脏器、肌肉、皮肤肿瘤为特征的肿瘤性传染病,严重危害世界养禽业的发展。马立克氏病病毒（MDV）在流行过程中,已经从温和型病毒株演进化为强毒株,并出现了超强毒株。常规疫苗对强毒的免疫保护效果并不理想,对超强毒株免疫保护更是不尽人意。科学家利用各种方法构建MDV候选疫苗,特别是利用基因工程研发重组疫苗成为当前研究的热点及突破点。目前有已经分离到多株自然整合有禽网状内皮组织增生症病毒（REV）的长末端重复序列（LTR）的马立克氏病病毒。最近研究表明REV的LTR可能赋予这种重组病毒某种选择性优势,LTR较强的启动子和增强子作用不仅能增强亲本病毒复制,而且不改变亲本病毒毒力,从而提高疫苗免疫力,这一优势为利用LTR改良马立克疫苗提供了保障。前期用MDV （JM/102W株）和REV（CSC株）混合感染鸭成纤维细胞（DEF）,随后将细胞悬浮液接种于鸡,在鸡的羽毛囊内分离到一株含有LTR的重组马立克氏病病毒,并将该病毒中的LTR的基因片段连接到含有马立克氏病毒同源臂载体B40中,构建了带有LTR的供体穿梭质粒,并与CVI988/Rispens病毒基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,在细胞中进行同源重组,产生整合有LTR的CVI988/Rispens重组马立克氏病病毒（rMDV-LTR）。本研究对rMDV-LTR进行生物安全评价和免疫效力试验,期望得到免疫保护作用好而又安全的重组马立克氏病毒活疫苗,开发一种能作为表达保护性抗原基因的活疫苗载体。1含REV-LTR基因的重组马立克氏病毒生物学特性及感染与排毒检测将重组MDV分别通过鸡胚成纤维细胞（CEF）和SPF鸡的连续传代增殖,通过PCR法鉴定LTR基因是否插入,以及确定LTR在IRS和TRS的存在,进一步用测序的方法评价重组病毒插入基因的稳定性。在1日龄SPF鸡皮下接种重组MDV,通过非免疫同居鸡的羽囊和血液进行病毒分离、PCR检测等评估重组病毒水平传播能力。对1日龄鸡接种重组MDV后,通过对饲料、饮水、粪便、垫料等的病毒分离、PCR检测评估疫苗毒株在环境中的存活能力,通过对免疫鸡的组织病毒分离、PCR检测等评估重组病毒在免疫鸡体内的分布情况。试验结果表明重组马立克氏病病毒在CEF生长良好,以50.60 PFU/ml的病毒滴度感染CEF细胞,生长曲线结果表明,rMDV-LTR在培养前3 d空斑较少,在4 d空斑开始增加,在第5 d生长速度迅速加快,可持续增长到7 d。相比CVI988/Rispens母本株,在第2 d开始出现空斑,从第3 d开始匀速生长到第6 d生长达到高峰,随着病毒的传代病毒的繁殖能力不会改变。PCR及测序表明,插入片段LTR基因在传代病毒中稳定存在,且没有基因突变和缺失。重组马立克氏病毒经SPF鸡体内传代5代后,剖检没有明显肉眼病变,内脏组织结构清晰,没有明显病理变化。重组MDV接种1日龄SPF鸡,同时以母本株CVI988/Rispens做对照,非免疫同居鸡的组织病毒分离和PCR检测结果表明,重组马立克氏病毒具备向同居非免疫鸡进行水平传播的能力。排毒检测试验未从饲料、粪便、饮水及棉拭子中分离到病毒,因此重组病毒和CVI988/Rispens具有同样的安全性。2含REV-LTR基因的重组马立克氏病毒免疫效力研究将1日龄SPF鸡分成8组,每组20只,皮下免疫0.2 mL的重组MDV,剂量分别为500 PFU/只、750 PFU/只、1000 PFU/只、2000 PFU/只和3000PFU/只,同时CVI988/Rispens母本株2000 PFU/只和3000 PFU/只（0.2 mL）作为阳性对照,PBS 0.2 mL作为阴性对照。接种10天后,各组分别以500 PFU/只（0.2 mL）的剂量接种vv MDV rMd5.攻毒后的每天跟踪记录各组有无临床症状或死亡情况。饲养60天后,全部扑杀并剖检观察其病变。采集疑似MDV病变的组织、脏器,然后每组随机选取5只分别取其组织、脏器做石蜡切片,HE染色,进行病理组织学观察,最后疫苗免疫效力由保护指数来评价。试验结果表明攻毒对照各组死亡率为85%,其余各组精神、采食和饮水正常,内脏组织器官和组织切片的检查均未发现病理变化。因此,重组MDV与母本毒株具有相同的免疫保护效力。3含REV-LTR基因的重组马立克氏病毒对靶动物、非靶动物的安全性评价将含REV-LTR基因的重组MDV、母本病毒CVI988/Rispens与PBS作对照,分别通过皮下注射途径对1日龄敏感雏鸡进行一次单剂量、单剂量重复和一次大剂量免疫的安全性试验,对1日龄雏鸭和1日龄雏鹅最大剂量免疫试验,通过腿部肌肉注射途径对4周龄小鼠进行最大剂量免疫试验。疫苗免疫后,通过对试验动物的临床观察、生产性能测定、内脏组织器官变化和组织切片检查,评估重组MDV的安全性。试验结果表明,试验鸡、鸭、鹅和小鼠疫苗接种后,各组精神、采食、饮水正常,内脏组织器官和组织切片的检查均未发现病理变化。综上所述,重组MDV对靶动物、非靶动物具有良好的安全性。
陈瑞爱,罗琼,郭凯,刘正伟,李慧敏,王建丽[7]（2014）在《整合REV LTR序列的MDV弱毒株的分离鉴定与生物学特性》文中研究表明【目的】从非免疫健康三黄鸡中分离到一株马立克氏病病毒（MDV）,命名为MDV GD06株,本工作系统研究了其生物学特性。【方法】PCR扩增GD06株Meq基因及短末端重复区（RS）序列,进行序列分析,并用间接免疫荧光试验进行血清型特异性鉴定;通过接种SPF鸡和鸡胚成纤维细胞（CEF）来判定GD06株体内外的增殖能力;为确定GD06株的致病性,用1日龄SPF鸡进行攻毒试验。【结果】GD06株为MDV血清I型病毒,其基因组中自然整合禽网状内皮增殖症病毒（REV）的长末端重复序列（LTR）,Meq基因富含脯氨酸的结构域比参考强毒株Md5多59个氨基酸,与MD商品化疫苗CVI988/Rispens和814株相符,具有弱毒株的特征。在接种CEF细胞96、120、144、168、192 h,GD06株病毒滴度分别为1.9×105、3.9×105、6.1×105、6.5×105、5.8×105PFU,明显比CVI988/Rispens（病毒滴度分别为1.3×105、3.5×105、5.0×105、5.7×105、4.7×105PFU）高（P<0.05）;接种SPF鸡21、28天,GD06株在鸡体内的病毒滴度分别为740和350 PFU,明显比CVI988/Rispens株（病毒滴度分别为460、216 PFU）高（P<0.05）,结果表明,GD06株在CEF细胞和鸡体内具有比CVI988/Rispens更快的增殖能力。人工接种攻毒实验表明,GD06株对SPF鸡没有致病性,不引免疫抑制。【结论】研究结果表明,MDV GD06株为国内首次分离的自然整合有REV LTR序列的重组MDV弱毒株。
段伦涛[8]（2014）在《敲除Meq基因的重组鸡马立克氏病毒与CV1988/Rispens疫苗株免疫保护效力的比较研究》文中认为马立克氏病是世界上唯一可以使用疫苗预防的肿瘤性疾病，它的预防给人类肿瘤疾病的研究建立了很好的模型。但是，随着MDV疫苗的不断使用，在免疫选择下马立克氏病病毒的毒力也在不断的增强，早期的HVT疫苗很难控制目前一些超强毒株的MDV，即使是在世界各国广发使用的CVI988/Rispens疫苗株免疫的鸡场，依然常见有MD的爆发，为了更好的控制MDV给养禽业带来的损失，世界各国科研工作者正在不断的研发MDV疫苗，如美国禽病肿瘤研究所构建的Md5△Meq能够提供针对Md5超强毒株的免疫保护作用，在此基础上，本实验室构建完成了bac-GX0101△M eq△K ana毒株并筛选到了一备用疫苗株，命名为SC9-1，本试验对SC9-1毒株的免疫保护作用进行了比较性研究。在敲除抗卡那霉素基因之前，苏帅等人已经比较了SC9-1毒株前身bac-GX0101△M eq株与CVI988/Rispens标准疫苗株之间针对Md5超强毒的免疫保护作用，结果bac-GX0101△M eq能够提供100%的保护力，而相同的条件下，CVI988/Rispens在SPF鸡上对超强毒Md5的保护力只有89%。而作为疫苗带有抗卡那霉素抗性的基因是不符合生物安全要求的，在敲除抗卡那霉素基因以后，bac-GX0101△M eq基因组序列发生改变后，它针对外源MDV感染的防治是否还是有效呢？本研究再次系统的的比较了SC9-1与商品化CVI988/Rispens疫苗间的免疫保护作用。苏帅等人使用的攻毒毒株为Md5毒株，但是本研究为了更全面的评价SC9-1毒株的免疫保护作用，选用了另一毒力稍弱的超强毒株GX0101。然后，本研究系统的比较了SC9-1毒株与标准疫苗株CVI988/Rispens对MDV超强毒GX0101攻毒的免疫保护作用。在实验设计方面选择了不含母源抗体的SFP鸡和含有母源抗体的海兰褐鸡作为实验动物，本实验将1日龄SPF鸡120只随机分成4组，每组30只，分别饲养在正压过滤空气的SPF动物饲养隔离罩内。1日龄时，第1组鸡以2000PFU/只的剂量颈部皮下接种SC9-1；第2组鸡以2000PFU/只的剂量颈部皮下接种CVI988/Rispens；第3、4组为不免疫攻毒对照组。免疫接种5天后，第1、2、3组分别以2000PFU/只的剂量腹腔接种MDV GX0101。饲养至90日龄，记录死亡情况，对死亡鸡只剖检，并取疑似马立克特有病变脏器做病理切片。期间，检测不同免疫状态下病毒GX0101的增殖动态以及禽流感、新城疫灭活苗在鸡体诱导产生抗体的水平。对含有MDV母源抗体的海蓝褐鸡的试验方案与SPF鸡一致。经试验比较，SC9-1株对感染MDV GX0101的SPF鸡、海兰褐鸡均提供100%的免疫保护作用；CVI988/Rispens对SPF鸡、海兰褐鸡分别提供86.7%、93%的免疫保护作用。未免疫SPF鸡攻毒组死亡率为53.3%，肿瘤率为16.7%；未免疫海兰褐鸡攻毒组死亡率为36.7%，肿瘤率为6.67%；相比，空白对照组鸡只没有任何病变及死亡。荧光定量结果显示，淋巴细胞和羽毛囊DNA中，SC9-1免疫组鸡体内GX0101的病毒拷贝数显着低于CVI988/Rispens免疫组。血凝抑制试验结果显示，SC9-1免疫攻毒组鸡的产生的AIV、NDV抗体水平高于CVI988/Rispens免疫攻毒组。所以，SC9-1株免疫无论在SPF鸡还是含有MDV母源抗体的海兰褐鸡均能提供比CVI988/Rispens更好的免疫保护效果。
许秋阳[9]（2014）在《表达鸡白细胞介素2的重组马立克病毒的免疫保护效力及免疫增强作用》文中研究说明疫苗的使用在马立克氏病（MD）的预防和控制中起到重要作用。但随着马立克氏病毒（MDV）毒力不断的进化,现有疫苗已不能提供较好的保护。鸡白细胞介素2（ChIL-2）是具有广泛生物活性的细胞因子,作为免疫增强剂在疫苗的研制中得到广泛研究。本研究利用MDV血清Ⅰ型毒株CVI988/Rispens为载体,构建表达ChIL-2基因的重组病毒（rMDV-IL2）,评价其免疫保护效力及免疫增强作用,为MD及其他疾病的防制提供疫苗储备。将ChIL-2基因定向克隆至pEASY-M1表达载体中,通过PCR方法扩增出ChIL-2基因的表达盒,并与实验室先前构建的含有CVI988/Rispens基因组同源臂的pU/D载体相连,构建转移载体pU/IL2/D。将pU/IL2/D与含有GFP报告基因的CVI988/Rispens基因组共转染CEF细胞,通过筛选、纯化获得重组病毒rMDV-IL2。PCR、Western-Blot和MTT试验及复制特性检测结果显示,ChIL-2基因正确插入到MDV基因组中并能成功表达具有生物活性的ChIL-2,且对病毒在体外的复制特性无显着影响。对1日龄雏鸡分别免疫rMDV-IL2和CVI988/Rispens后的免疫器官指数进行测定,结果显示rMDV-IL2组的免疫器官指数均高于CVI988/Rispens组,免疫后21d和28d胸腺指数存在显着性差异；免疫后21d、28d和35d脾脏指数和法氏囊指数均存在显着性差异。在外周血T淋巴细胞亚群检测试验中,rMDV-IL2组与CVI988/Rispens组的CD4+T淋巴细胞变化规律类似,但前者要高于后者,其中21d和28d存在显着性差异；rMDV-IL2组CD8+T淋巴细胞在免疫后第7d就显着高于CVI988/Rispens组,第28d达到最高值并维持在较高水平。这表明rMDV-IL2能促进免疫系统发育和成熟,提高细胞免疫应答水平。在对rMDV-IL2的免疫保护效力测定试验中,对1日龄雏鸡分别免疫rMDV-IL2和CVI988/Rispens,7日龄用1000PFU的MDVRB1B株进行攻毒,连续观察90天。通过体重称量、淋巴细胞转化水平检测、免疫器官指数测定以及保护指数计算等方法来评价rMDV-IL2的免疫保护效果。结果显示, rMDV-IL2能有效地控制强毒攻击后引起的体重下降,且淋巴细胞转化水平显着高于CVI988/Rispens组。免疫器官指数测定结果显示,rMDV-IL2组高于GVI988/Rispens组。胸腺指数在攻毒后28d差异显着（p<0.05）；脾脏指数和法氏囊指数在攻毒后21d、28d和35d差异显着（p<0.05）。rMDV-IL2组的PI为81.6%, CVI988/Rispens组的PI为78.9%。为了验证rMDV-IL2表达的ChIL-2对其他疫苗是否具有免疫增强作用,将rMDV-H2和CVI988/Rispens分别免疫1日龄雏鸡,10日龄免疫新城疫La Sota疫苗,每周进行NDV抗体检测,持续三周。NDV抗体的HI试验和ELISA检测结果显示,rMDV-IL2组在免疫后一周,抗体滴度大于4log2,免疫后3周内抗体水平持续升高,且抗体滴度在前两周内显着高于CVI988/Rispens组和对照组。这说明rMDV-IL2能促进新城疫La Sota疫苗免疫后抗体的生成,具有免疫增强作用。
汪洁[10]（2014）在《四个厂家MD商品活疫苗病毒含量的评价及其免疫雏鸡后抗体水平的比较研究》文中提出近年来发现MDV的变异毒株，其毒力和致病力有所增强。尽管对鸡群进行接种免疫，MD仍会暴发，并且由于MDV毒株的变异，容易引起MD疫苗免疫失败，导致家禽养殖出现重大损失。我国CVI988/Rispens毒株国家标准含量为2000蚀斑每毫升（PFU/mL），通常种鸡场在防控MD时选用此疫苗。对多种商业化MD疫苗质量进行评估是很有必要的。同时对活疫苗不同滴度免疫鸡群诱导产生的抗体是否存在差异进行比较，进而可以为验证商品活疫苗诱导产生抗体差异对当前MDV毒力及致病力研究做铺垫，提供临床指导意义。1.本研究通过对宁夏某种鸡场所用CVI988/Rispens株液氮活疫苗进行病毒蚀斑测定，对疫苗质量进行评价，对四个厂家（A、B、C、D）MD液氮活疫苗4个批次16个留样进行32次病毒蚀斑测定，得到厂家疫苗PFU平均值：厂家A是4088PFU/mL、厂家B是3975PFU/mL、厂家C是9475PFU/mL和厂家D是6338PFU/mL；四个厂家疫苗均达到了国家标准的要求。2.根据四个厂家提供的内参标准，A和B厂家提供的内参标准是4000PFU/mL，C厂家提供的内参标准是10000PFU/mL，D厂家提供的标准是6000PFU/mL，这些数据表明各个厂家之间的内参标准是有差异的。通过对疫苗PFU的测定结果表明，测定结果与厂家提供的标准内参差异小；根据厂家标准内参得出疫苗出厂合格率，A厂家为75%，B厂家为50%，C厂家虽然已达到了国家标准，但几乎未达到厂家内参标准，而D厂家均达到了厂家内参标准，合格率为100%；计算PFU与内参标准之比得出疫苗A、B、C、D厂家实际有效病毒含量的百分比，分别为100%、99%、95%和100%的比率，实际含活毒与厂家内参值差异不显着。3.通过对1日龄雏鸡进行不同疫苗PFU接种免疫，用ELISA方法对免疫鸡群1d、7d、14d、21d、28d血清结果进行分析，从而得出不同疫苗PFU诱导的抗体变化规律，得出鸡群抗体水平依次C>D>A降低，说明活疫苗大剂量病毒含量免疫时，诱导机体产生抗体迅速升高，提高早期预防MD发生的效力。
二、MD CVI988疫苗的PFU与免疫效果（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、MD CVI988疫苗的PFU与免疫效果（论文提纲范文）
（1）2017-2019马立克氏病病毒分子流行病学及分离株GX18NNM4的致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本论文所用缩写符号说明表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 MDV的分子生物学特性 |
| 1.1.1 病毒的形态、结构和分类 |
| 1.1.2 病毒的基因组特征 |
| 1.1.3 病毒的主要致瘤基因概述 |
| 1.2 MD的致病机制 |
| 1.2.1 病毒早期的溶细胞感染 |
| 1.2.2 病毒的潜伏感染 |
| 1.2.3 病毒的第二次溶细胞感染 |
| 1.2.4 病毒转化T细胞形成肿瘤阶段 |
| 1.3 MD的流行病学 |
| 1.3.1 病毒的流行情况 |
| 1.3.2 病毒的毒力进化特征及毒株致病型的界定 |
| 1.3.3 病毒的自然感染宿主 |
| 1.3.4 病毒感染的发病日龄 |
| 1.3.5 病毒的传播方式 |
| 1.3.6 病毒与其他肿瘤性疾病病毒的共感染 |
| 1.4 MDV的诊断 |
| 1.4.1 临床诊断 |
| 1.4.2 病毒分离 |
| 1.4.3 病毒抗原检测 |
| 1.4.4 聚合酶链反应(PCR)扩增技术 |
| 1.4.5 DNA探针技术 |
| 1.5 针对MDV的防控措施 |
| 1.5.1 疫苗接种方案 |
| 1.5.2 生物安全 |
| 1.6 开展本课题研究的目的及意义 |
| 第二章 2017-2019广西及其周边地区马立克氏病病毒分子流行病学调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验所需的主要材料 |
| 2.1.2 试验中所用到的主要仪器设备 |
| 2.1.3 临床样本信息及来源 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备与培养 |
| 2.2.2 病鸡外周血淋巴细胞(PBL)的分离 |
| 2.2.3 组织病料的处理 |
| 2.2.4 病毒的接种与分离 |
| 2.2.5 病毒的间接免疫荧光抗体试验(IFA)检测 |
| 2.2.6 病料组织或细胞培养物基因组总DNA的抽提 |
| 2.2.7 肿瘤病病原PCR鉴定 |
| 2.2.8 MDV meq基因克隆及序列分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 送检病鸡的临床症状及剖检病变 |
| 2.3.2 肿瘤病病原鉴定及MDV病毒分离结果 |
| 2.3.3 间接免疫荧光抗体试验(IFA)检测结果 |
| 2.3.4 MDV分离株meq基因序列的分析结果 |
| 2.3.5 基于meq基因的系统进化树分析 |
| 2.3.6 广西地区MDV毒力变化趋势 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 基于meq基因系统动力学分析揭示MDV在中国的起源和演变 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样本序列及信息来源 |
| 3.1.2 处理数据所用的软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 MDV meq基因序列数据集 |
| 3.2.2 最佳核苷酸替代模型分析 |
| 3.2.3 贝叶斯系统发育分析 |
| 3.2.3.1 构建全球最大似然树 |
| 3.2.3.2 构建全球MDV早期地理系统动力学分析 |
| 3.2.3.3 构建中国MDV强毒分离株地理系统动力学分析 |
| 3.2.3.4 中国MDV强毒分离株种群动态分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 MDV meq基因序列最佳核苷酸替代模型的选择 |
| 3.3.2 MDV系统发育分析 |
| 3.3.3 MDV地理系统分析结果 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 分离株GX18NNM4的致病性及疫苗免疫保护试验 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 相关试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 毒株 |
| 4.1.4 实验动物和疫苗 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备及培养 |
| 4.2.2 GX18NNM4分离株的复苏和病毒增殖 |
| 4.2.3 GX18NNM4分离株纯化 |
| 4.2.4 GX18NNM4 分离株PFU测定 |
| 4.2.5 对试验鸡分组及疫苗免疫方案 |
| 4.2.6 对各试验组鸡生长增重情况的检测 |
| 4.2.7 对试验鸡免疫器官发育情况的检测 |
| 4.2.8 对试验鸡PBLs中病毒载量表达水平的动态检测 |
| 4.2.9 对鸡细胞因子PD-1、PD-L1的标准曲线的构建 |
| 4.2.9.1 PD-1和PD-L1引物合成及标准样品质粒的获得 |
| 4.2.9.2 PD-1、PD-L1 q-PCR标准曲线的建立 |
| 4.2.9.3 敏感性和重复性试验 |
| 4.2.10 对试验鸡组织中细胞因子PD-1和PD-L1的m RNA表达水平的检测 |
| 4.2.11 对试验鸡临床症状、鸡只剖检和病理组织学观察 |
| 4.2.12 对试验鸡发病情况及疫苗保护指数和毒力等级的测定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 GX18NNM4 分离株PFU的测定结果 |
| 4.3.2 试验鸡生长性能的测定结果 |
| 4.3.3 试验鸡免疫器官指数的测定结果 |
| 4.3.4 MDV感染后PBLs中病毒载量动态检测结果 |
| 4.3.5 鸡细胞因子PD-1和PD-L1的标准曲线 |
| 4.3.5.1 鸡细胞因子PD-1、PD-L1 基因的RT-PCR扩增及克隆结果 |
| 4.3.5.2 质粒浓度及拷贝数结果 |
| 4.3.5.3 实时荧光定量RT-PCR标准曲线的获得 |
| 4.3.5.4 灵敏度和重复性试验 |
| 4.3.6 MDV感染后试验鸡组织中PD-1、PD-L1 m RNA表达水平的影响 |
| 4.3.7 试验鸡的临床症状、剖检病变及组织学观察结果 |
| 4.3.8 试验鸡发病情况及疫苗保护指数结果 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（2）表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组马立克氏病病毒活载体疫苗研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 鸡传染性法氏囊病 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 我国vvIBDV的流行趋势 |
| 1.1.3 IBDV的基因组和编码蛋白 |
| 1.1.4 我国IBD防控情况 |
| 1.2 马立克氏病 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 MDV的毒力进化及流行情况 |
| 1.2.3 MDV的基因组结构 |
| 1.2.4 我国MD防控情况 |
| 1.3 重组MDV活载体疫苗研究进展 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 第二章 我国vvIBDV流行毒株的遗传变异、抗原性和致病性分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 病毒及细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 IBDV分离株的遗传进化分析 |
| 2.1.4 IBDV分离株的抗原性分析 |
| 2.1.5 IBDV分离株的鸡胚半数感染量测定 |
| 2.1.6 IBDV分离株的致病性分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 我国vvIBDV分离株的遗传进化分析 |
| 2.2.2 我国vvIBDV分离株的抗原性分析 |
| 2.2.3 我国vvIBDV分离株的致病性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 MDV多片段Fosmid粘粒拯救系统的建立 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 病毒及细胞 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 |
| 3.1.3 MDV培养及病毒基因组的提取 |
| 3.1.4 MDV基因组DNA的末端修饰 |
| 3.1.5 连接和包装 |
| 3.1.6 重组粘粒的鉴定和测序 |
| 3.1.7 亲本疫苗株病毒的拯救 |
| 3.1.8 拯救病毒的鉴定 |
| 3.1.9 拯救毒rMDV和原MDV疫苗株病毒生长曲线的测定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 MDV病毒基因组Fosmid文库的构建 |
| 3.2.2 用于病毒拯救的重组粘粒的选择 |
| 3.2.3 拯救毒rMDV的鉴定 |
| 3.2.4 拯救毒rMDV与原MDV疫苗株病毒生长曲线的比较 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 MDV基因组外源基因插入位点的筛选 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 病毒及细胞 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 |
| 4.1.3 带有Kan-ccdB抗性基因表达框架的重组突变粘粒的构建 |
| 4.1.4 pENTR1-eGFP的构建 |
| 4.1.5 含有eGFP表达框架的重组突变粘粒的构建 |
| 4.1.6 重组病毒的拯救 |
| 4.1.7 重组病毒的鉴定 |
| 4.1.8 重组病毒的eGFP表达情况 |
| 4.1.9 重组病毒的生长曲线滴定 |
| 4.1.10 重组病毒的遗传稳定性检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 重组病毒的拯救 |
| 4.2.2 重组病毒的鉴定 |
| 4.2.3 重组病毒的eGFP表达水平的比较 |
| 4.2.4 重组病毒体外复制特性 |
| 4.2.5 重组病毒的遗传稳定性 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 表达IBDV VP2基因的重组MDV的构建及鉴定 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 病毒及细胞 |
| 5.1.2 主要试剂和仪器 |
| 5.1.3 pCAGGS-VP2表达质粒的构建 |
| 5.1.4 VP2入门质粒pENT1-VP2的构建 |
| 5.1.5 含有VP2表达框架的重组突变粘粒的构建 |
| 5.1.6 重组病毒的拯救 |
| 5.1.7 重组病毒的鉴定 |
| 5.1.8 重组病毒目的基因VP2表达情况 |
| 5.1.9 重组病毒的遗传稳定性 |
| 5.1.10 重组病毒的复制特性 |
| 5.1.11 重组病毒对vvIBDV的免疫保护试验 |
| 5.1.12 重组病毒对vvMDV的免疫保护试验 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 插入VP2基因的重组粘粒的构建 |
| 5.2.2 重组病毒的鉴定 |
| 5.2.3 目的基因VP2表达情况 |
| 5.2.4 重组病毒的遗传稳定性 |
| 5.2.5 重组病毒的复制特性 |
| 5.2.6 重组病毒免疫SPF鸡后IBDV抗体滴度的检测 |
| 5.2.7 重组病毒对vvIBDV攻毒的免疫保护效果 |
| 5.2.8 重组病毒对vvMDV攻毒的免疫保护效果 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 表达IBDV VP2基因的重组MDV活载体疫苗的免疫效力评价 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 病毒及细胞 |
| 6.1.2 主要试剂及试验用鸡 |
| 6.1.3 rMDV-VP2疫苗最小免疫剂量的确定 |
| 6.1.4 rMDV-VP2疫苗的效力试验及与商品化疫苗的比较 |
| 6.1.5 rMDV-VP2疫苗对不同vvIBDV分离株的交叉保护试验 |
| 6.1.6 母源抗体对rMDV-VP2疫苗免疫效果的影响 |
| 6.1.7 rMDV-VP2疫苗免疫持续期试验 |
| 6.1.8 rMDV-VP2疫苗对不同品种商品蛋鸡的免疫效力试验 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 rMDV-VP2疫苗最小免疫剂量的确定 |
| 6.2.2 rMDV-VP2疫苗效力试验及与IBD商品化疫苗的比较 |
| 6.2.3 rMDV-VP2疫苗对不同vvIBDV分离株的交叉保护试验 |
| 6.2.4 rMDV-VP2疫苗的母源抗体干扰试验 |
| 6.2.5 rMDV-VP2疫苗免疫持续期试验 |
| 6.2.6 rMDV-VP2疫苗对不同品种商品蛋鸡的免疫效力试验 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 表达IBDV VP2基因的重组MDV活载体疫苗的安全性评价 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 病毒及细胞 |
| 7.1.2 实验动物 |
| 7.1.3 主要试剂 |
| 7.1.4 主要检测方法 |
| 7.1.5 rMDV-VP2疫苗单剂量接种的安全性试验 |
| 7.1.6 rMDV-VP2疫苗单剂量重复接种的安全性试验 |
| 7.1.7 rMDV-VP2疫苗大剂量接种的安全性试验 |
| 7.1.8 rMDV-VP2疫苗用于非靶动物后的临床反应 |
| 7.1.9 rMDV-VP2疫苗在黑龙江省的环境释放试验 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 rMDV-VP2疫苗单剂量接种的安全性试验 |
| 7.2.2 rMDV-VP2疫苗单剂量重复接种对鸡的安全性分析 |
| 7.2.3 rMDV-VP2疫苗大剂量接种对鸡的安全性分析 |
| 7.2.4 rMDV-VP2疫苗接种非靶动物小鼠后的临床反应 |
| 7.2.5 rMDV-VP2疫苗的水平传播能力 |
| 7.2.6 rMDV-VP2疫苗的垂直传播能力 |
| 7.2.7 rMDV-VP2疫苗在鸡体内的存留情况 |
| 7.2.8 rMDV-VP2疫苗免疫鸡后的排毒情况 |
| 7.2.9 rMDV-VP2疫苗在应用环境中的存活能力 |
| 7.3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 博士后期间其他工作内容 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 博士后期间论文发表情况 |
（3）ALV引起的免疫抑制对马立克氏病疫苗免疫保护效果的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽肿瘤病的流行病学概述 |
| 1.2 禽类免疫系统和免疫抑制 |
| 1.3 禽白血病病毒的研究进展 |
| 1.3.1 病原学 |
| 1.3.2 ALV的致病机理 |
| 1.3.3 ALV的流行病学 |
| 1.3.4 临床症状及病理变化 |
| 1.3.5 ALV的检测与诊断 |
| 1.3.6 ALV的防控 |
| 1.4 马立克氏病病毒的研究进展 |
| 1.4.1 MDV的病原学 |
| 1.4.2 MDV的基因组结构 |
| 1.4.3 MDV致病机制 |
| 1.4.4 MDV流行病学 |
| 1.4.5 临床症状与病理变化 |
| 1.4.6 MDV的诊断 |
| 1.4.7 MDV的防控 |
| 1.5 开展本课题研究的目的和意义 |
| 第二章 人工感染ALV-J对鸡MD疫苗免疫应答效果的影响 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 相关试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 毒株与细胞 |
| 2.1.4 实验动物及疫苗 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 ALV-J (GX15MM6-2)的增殖与鉴定 |
| 2.2.2 ALV-J (GX15MM6-2) TCID_(50)的测定 |
| 2.2.3 试验鸡分组及疫苗的免疫 |
| 2.2.4 试验鸡的生长性能 |
| 2.2.5 试验鸡MD疫苗免疫的抗体水平 |
| 2.2.6 试验鸡ND、AI-H5和AI-H9灭活疫苗免疫的抗体应答 |
| 2.2.7 试验鸡外周血T淋巴细胞亚群的检测 |
| 2.2.8 试验鸡细胞因子IL-10的mRNA表达水平的检测 |
| 2.2.9 试验鸡外周血中ALV病毒载量的检测 |
| 2.2.10 试验鸡ALV的病毒血症及排毒的检测 |
| 2.2.11 ALV感染的试验鸡病理剖检变化及病理组织学检查 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 ALV感染对鸡生长性能的影响 |
| 2.3.2 ALV感染对MD疫苗免疫抗体水平的影响 |
| 2.3.3 ALV感染对AI-H5、AI-H9和ND灭活疫苗免疫抗体水平的抑制作用 |
| 2.3.4 ALV感染对试验鸡外周血T淋巴细胞亚群的影响 |
| 2.3.5 ALV感染对试验鸡细胞因子IL-10的mRNA表达水平的影响 |
| 2.3.6 试验鸡外周血中ALV病毒载量的动态变化 |
| 2.3.7 试验鸡感染ALV的病毒血症和排毒情况的影响 |
| 2.3.8 试验鸡的病理剖检变化及病理组织学变化 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 自然垂直感染ALV对鸡MD疫苗免疫保护效果的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 相关试剂 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 毒株与细胞 |
| 3.1.4 试验动物及疫苗 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 MDV毒株GXY2和GA的复苏与增殖 |
| 3.2.2 MDV毒株GXY2和GA的PFU测定 |
| 3.2.3 试验动物分组及疫苗免疫 |
| 3.2.4 试验鸡生长性能的检测 |
| 3.2.5 试验鸡免疫器官指数的检测 |
| 3.2.6 试验鸡ND、AI-H5和AI-H9灭活疫苗免疫抗体水平的检测 |
| 3.2.7 试验鸡外周血中Ik4DV病毒载量的动态检测 |
| 3.2.8 试验鸡ALV的病毒血症和排毒情况的动态检测 |
| 3.2.9 试验鸡临床症状、病理解剖和病理组织学观察 |
| 3.2.10 试验鸡发病率、死亡率、肿瘤发生率和疫苗保护指数的统计 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 GXY2和GA毒株的PFU测定结果 |
| 3.3.2 试验鸡生长性能的测定结果 |
| 3.3.3 试验鸡免疫器官指数的测定结果 |
| 3.3.4 试验鸡AI-H5、AI-H9和ND灭活疫苗免疫抗体水平的检测结果 |
| 3.3.5 试验鸡外周血中MDV病毒载量动态检测结果 |
| 3.3.6 试验鸡ALV的病毒血症和排毒情况动态检测结果 |
| 3.3.7 试验鸡临床症状、病理解剖和病理组织学观察结果 |
| 3.3.8 试验鸡发病率、死亡率、肿瘤发生率和疫苗保护指数的统计结果 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（4）马立克病毒通过DNA损伤应答通路调控病毒复制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词(Abbreviations) |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 马立克病毒的研究进展 |
| 1 马立克病毒的基本特征 |
| 1.1 马立克病毒的形态特征 |
| 1.2 马立克病毒基因组结构 |
| 1.3 马立克病毒与α-疱疹病毒同源的基因 |
| 1.4 马立克病毒特有基因 |
| 2. 马立克病毒的发病机理与宿主的免疫应答 |
| 2.1 早期溶细胞感染 |
| 2.2 潜伏感染 |
| 2.3 再次溶细胞感染 |
| 2.4 转化期 |
| 2.5 宿主的免疫应答 |
| 3. 病毒的流行病学研究进展 |
| 4. 马立克病的诊断 |
| 4.1 临床诊断 |
| 4.2 病毒抗原诊断 |
| 4.3 聚合酶链式反应诊断 |
| 5. 马立克病的防控 |
| 第二章 DNA损伤应答通路与病毒相互作用的研究进展 |
| 1. DNA损伤应答通路的基本特征 |
| 1.1 DNA损伤类型 |
| 1.2 DNA损伤应答通路 |
| 1.3 DNA损伤修复 |
| 2. DNA损伤应答通路与病毒的相互作用 |
| 2.1 病毒激活DNA损伤应答通路 |
| 2.2 病毒抑制DNA损伤应答通路 |
| 3. STAT3信号通路 |
| 3.1 STAT3信号通路的特征 |
| 3.2 STAT3信号通路与肿瘤发生 |
| 3.3 STAT3信号通路与病毒感染 |
| 4. 研究的目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二篇 研究部分 |
| 第三章 MDV感染引起细胞DNA损伤 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 细胞株和菌株 |
| 1.2 质粒载体 |
| 1.3 病毒 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 溶液的配制 |
| 1.7 MDV病毒滴度的测定 |
| 1.8 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 1.9 彗星试验方法的建立 |
| 1.10 检测鸡p53和p21多克隆抗体的特异性 |
| 1.11 检测细胞内p53和p21水平 |
| 2. 结果 |
| 2.1 彗星试验检测细胞DNA损伤方法的建立 |
| 2.2 MDV感染引起CEF细胞DNA损伤 |
| 2.3 MDV感染引起细胞中p53和p21水平的变化 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 DNA损伤应答通路对MDV复制的影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 细胞株和菌株 |
| 1.2 质粒载体 |
| 1.3 病毒 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 溶液的配制 |
| 1.7 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 1.8 pcDNA3-2×Flag-Chk1和pcDNA3-Chk1真核表达载体的构建 |
| 1.9 检测DDR通路抑制剂对MDV感染的影响 |
| 1.10 检测ATR-Chk1信号通路对MDV复制的影响 |
| 1.11 检测MDV感染对细胞内Chk1磷酸化的影响 |
| 2. 结果 |
| 2.1 DDR通路调控MDV感染 |
| 2.2 ATR-Chk1通路对病毒感染的影响 |
| 2.3 MDV感染调控Chk1的磷酸化 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 MDV激活STAT3调控ATR-Chk1通路 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 细胞株和菌株 |
| 1.2 病毒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 溶液的配制 |
| 1.6 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 1.7 检测MDV感染细胞中STAT3磷酸化水平变化 |
| 1.8 检测STAT3通路在MDV感染抑制Chk1磷酸化中的作用 |
| 1.9 检测抑制STAT3通路对MDV复制的影响 |
| 2. 结果 |
| 2.1 MDV感染激活细胞内STAT3通路 |
| 2.2 MDV感染通过激活STAT3通路调控Chk1的磷酸化 |
| 2.3 抑制STAT3通路对MDV复制的影响 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 细胞氧化应激反应调控MDV复制 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 细胞株和菌株 |
| 1.2 病毒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 溶液的配制 |
| 1.6 鸡胚成纤维细胞的制备 |
| 1.7 细胞内ROS的检测 |
| 1.8 检测APO抑制剂对Md5复制的影响 |
| 1.9 检测DPI抑制剂对Md5复制的影响 |
| 2. 结果 |
| 2.1 MDV感染引起CEF细胞内产生ROS |
| 2.2 细胞内氧化应激反应调控MDV复制 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 丹顶鹤马立克病临床病例的分子生物学诊断 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 细胞株和菌株 |
| 1.2 病毒 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 溶液的配制 |
| 1.6 临床丹顶鹤病例 |
| 1.7 临床组织切片HE染色 |
| 1.8 组织样本基因组的提取和病毒基因PCR检测 |
| 1.9 组织样本RNA的提取和病毒基因RT-PCR检测 |
| 2. 结果 |
| 2.1 丹顶鹤的临床剖检和组织学染色 |
| 2.2 丹顶鹤组织样本中MDV病毒基因的的检测 |
| 2.3 丹顶鹤组织样本中MDV病毒基因序列分析 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本论文创新点 |
| 科研成果 |
| 致谢 |
（5）MDV悬浮培养技术工艺及免疫保护研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词 |
| 1 前言 |
| 1.1 鸡马立克氏病概述 |
| 1.2 马立克氏病毒的流行病学 |
| 1.3 马立克氏病疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 常规致弱疫苗 |
| 1.3.2 新型基因工程疫苗 |
| 1.4 动物细胞及微载体悬浮培养技术 |
| 1.4.1 动物细胞培养常用细胞系 |
| 1.4.2 微载体悬浮培养技术的发展 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要仪器和材料 |
| 2.1.1 主要仪器设备 |
| 2.1.2 主要材料 |
| 2.1.3 细胞、种毒与疫苗 |
| 2.1.4 SPF鸡胚和实验动物 |
| 2.2 DF-1 细胞的常规培养 |
| 2.2.1 细胞的复苏与冻存 |
| 2.2.2 DF-1 细胞的传代 |
| 2.2.3 培养条件的优化 |
| 2.3 DF-1 细胞的微载体培养 |
| 2.3.1 微载体及其处理 |
| 2.3.2 搅拌方式对细胞贴壁的影响 |
| 2.3.3 细胞接种密度对悬浮培养的影响 |
| 2.3.4 微载体浓度对悬浮培养的影响 |
| 2.3.5 细胞计数及生长曲线的确定 |
| 2.3.6 细胞代谢的测定 |
| 2.4 MDV在DF-1 细胞上的常规培养 |
| 2.4.1 MDV种毒的繁殖 |
| 2.4.2 MDV在DF-1 细胞上的适应 |
| 2.4.3 MDV在DF-1 细胞中的传代 |
| 2.4.4 维持液换液时间对MDV在DF-1 细胞中增殖的影响 |
| 2.4.5 细胞瓶中最佳接毒量及最佳收毒时间的优化 |
| 2.5 MDV在DF-1 细胞上的微载体悬浮培养 |
| 2.5.1 不同接毒方式对微载体悬浮培养马立克氏病毒的研究 |
| 2.5.2 不同细胞接种量对微载体悬浮培养马立克氏病毒的研究 |
| 2.5.3 spinner flask搅拌瓶中最佳接毒量及最佳收毒时间的优化 |
| 2.5.4 不同微载体浓度对微载体悬浮培养马立克氏病毒的研究 |
| 2.5.5 不同培养系统培养马立克氏病毒的比较 |
| 2.6 MDV的蚀斑检测 |
| 2.7 悬浮培养马立克氏病毒的免疫效果评价 |
| 2.7.1 悬浮培养MDV安全性试验 |
| 2.7.2 悬浮培养MDV对SPF鸡的免疫保护试验 |
| 2.7.3 动物试验各组存活率曲线 |
| 2.7.4 疫苗免疫后感染Md5各组鸡的临床病变与剖检观察 |
| 2.7.5 疫苗免疫后感染Md5各组鸡的病理变化 |
| 2.7.6 动物实验各组鸡只体重的影响 |
| 2.7.7 免疫器官指数的测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 DF-1 细胞的常规培养 |
| 3.1.1 不同复苏方法对DF-1 细胞生长的研究 |
| 3.1.2 DF-1 细胞的传代 |
| 3.1.3 不同培养基对DF-1 细胞生长的比较 |
| 3.1.4 不同pH对DF-1 细胞生长的比较 |
| 3.1.5 DF-1 的细胞生长曲线 |
| 3.2 DF-1 细胞的微载体培养 |
| 3.2.1 搅拌方式对细胞贴壁的影响 |
| 3.2.2 细胞接种密度对悬浮培养的影响 |
| 3.2.3 微载体浓度对悬浮培养的影响 |
| 3.3 MDV在DF-1 细胞上的常规培养 |
| 3.3.1 MDV在DF-1 细胞中的适应及传代 |
| 3.3.2 维持液换液时间对MDV在DF-1 细胞中增殖的影响 |
| 3.3.3 细胞瓶中最佳接毒量及最佳收毒时间的优化 |
| 3.4 MDV在DF-1 细胞上的微载体悬浮培养 |
| 3.4.1 不同接毒方式对微载体悬浮培养马立克氏病毒的研究 |
| 3.4.2 不同细胞接种量对微载体悬浮培养马立克氏病毒的研究 |
| 3.4.3 spinner flask搅拌瓶中最佳接毒量及最佳收毒时间的优化 |
| 3.4.4 不同微载体浓度对微载体悬浮培养马立克氏病毒的研究 |
| 3.4.5 不同培养系统培养马立克氏病毒的比较 |
| 3.5 悬浮培养马立克氏病毒的免疫效果评价 |
| 3.5.1 悬浮培养MDV的安全性 |
| 3.5.2 存活率曲线 |
| 3.5.3 疫苗免疫后感染Md5各组鸡的临床病变与剖检观察 |
| 3.5.4 疫苗免疫后感染Md5各组鸡的病理变化 |
| 3.5.5 疫苗的免疫保护指数（PI） |
| 3.5.6 动物试验各组鸡只体重比较 |
| 3.5.7 免疫器官指数的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DF-1 细胞的培养特性 |
| 4.1.1 DF-1 细胞的常规培养及条件优化 |
| 4.1.2 DF-1 细胞的微载体悬浮培养 |
| 4.2 MDV在DF-1 细胞中的增殖特性 |
| 4.2.1 MDV在DF-1 细胞上的常规培养 |
| 4.2.2 MDV在DF-1 细胞上的微载体悬浮培养 |
| 4.3 微载体悬浮培养MDV的免疫保护效果 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（6）含REV-LTR基因的马立克氏病毒活疫苗的生物安全评价及免疫效力研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 综述 |
| 第一章 重组马立克氏病毒生物学特性及感染与排毒检测 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 重组马立克氏病毒免疫效力研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 重组马立克氏病毒对靶、非靶动物的安全性评价 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（7）整合REV LTR序列的MDV弱毒株的分离鉴定与生物学特性（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1. 1 材料 |
| 1. 2 MDV GD06 株分离 |
| 1. 3 MDV GD06 株鉴定 |
| 1. 4 MDV GD06 株的Meq基因和LTR整合区域的序列扩增 |
| 1. 5 MDV GD06 株的体内外增殖 |
| 1. 6 MDV GD06 株对SPF鸡的致病性实验 |
| 2 结果 |
| 2. 1 间接免疫荧光试验( IFA) |
| 2. 2 MDV GD06 株基因序列分析 |
| 2. 3 体内外增殖实验 |
| 2. 4 对SPF鸡的致病性 |
| 3 讨论 |
（8）敲除Meq基因的重组鸡马立克氏病毒与CV1988/Rispens疫苗株免疫保护效力的比较研究（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 马立克式病毒（MDV）的研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 流行病学 |
| 1.1.3 发病机理及病理变化 |
| 1.1.3.1 早期增殖性-限制性感染 |
| 1.1.3.2 病毒的潜伏感染阶段 |
| 1.1.3.3 溶细胞感染的第二阶段 |
| 1.1.3.4 淋巴瘤的形成 |
| 1.1.4 MDV的诊断技术 |
| 1.1.4.1 观察临床资料和机体病变 |
| 1.1.4.2 肿瘤组织学、细胞学以及组织化学诊断 |
| 1.1.4.3 病毒学检测 |
| 1.2 马立克式病毒（MDV）分子生物学研究进展 |
| 1.2.1 MDV 的基因组结构 |
| 1.2.2 MDV 的基因及相关蛋白 |
| 1.2.2.1 即时早期基因（IE 基因） |
| 1.2.2.2 早期基因 |
| 1.2.2.3 晚期基因 |
| 1.2.2.4 Meq 基因 |
| 1.2.2.5 v-IL8 |
| 1.2.2.6 1.8kb 基因家族 |
| 1.2.2.7 pp38/pp24 |
| 1.3 禽反转录病毒与 MDV 之间基因重组的研究进展 |
| 1.3.1 MDV 与 REV 之间的基因重组 |
| 1.3.2 MDV 与 ALV 之间的基因重组 |
| 1.4 重组 MDV 研究中克隆载体系统介绍 |
| 1.4.1 质粒(plasmid) |
| 1.4.2 粘粒 |
| 1.4.3 细菌人工染色体技术(bacterial artificial chromsomeo ,BAC) |
| 1.5 重组 MDV 病毒 SC9-1 的构建 |
| 1.6 MDV 疫苗的研究进展 |
| 1.6.1 疫苗免疫机制 |
| 1.6.2 疫苗的种类 |
| 1.6.2.1 常规使用的疫苗 |
| 1.6.2.2 新型 MDV 疫苗 |
| 1.7 本研究的意义 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验动物与 SPF 饲养设施 |
| 2.1.2 疫苗 |
| 2.1.3 病毒 |
| 2.1.4 主要试剂和仪器 |
| 2.1.5 其他试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸡胚成纤维细胞（CEF）的制备 |
| 2.2.2 MDV 病毒的增殖与定量 |
| 2.2.3 AIV 与 NDV 病毒的鸡胚扩增 |
| 2.2.4 重组毒株 SC9-1 的人工接种 |
| 2.2.5 NDV 和 AIV 疫苗免疫鸡 |
| 2.2.6 红细胞凝集试验与血凝抑制试验 |
| 2.2.6.1 红细胞凝集试验步骤 |
| 2.2.6.2 血凝抑制试验步骤 |
| 2.2.7 接种 GX0101 后鸡的死亡率及肿瘤发生率 |
| 2.2.8 病理学检测 |
| 2.2.9 淋巴细胞 DNA 与羽毛囊上皮细胞 DNA 的提取 |
| 2.2.10 检测 SPF 鸡免疫 SC9-1 后 GX0101 接种病毒的增殖动态 |
| 2.2.11 检测 MDV GX0101 的荧光定量 PCR 方法的建立 |
| 2.2.11.1 荧光定量 PCR 检测 GX0101 的可行性 |
| 2.2.11.2 荧光定量 PCR 引物的设计 |
| 2.2.11.3 荧光定量 PCR 反应体系及反应条件 |
| 2.2.12 检测 MDV GX0101 的荧光定量 PCR 标准曲线的制备 |
| 2.2.12.1 PCR 扩增 Meq、LTR |
| 2.2.12.2 质粒 pMD-meq、pMD-LTR 的构建 |
| 2.2.12.3 Meq 和 LTR 基因的荧光定量标准曲线绘制 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 重组 MD 病毒 SC9-1 与毒株 GX0101 的细胞定量结果 |
| 2.3.2 各组 SPF 鸡免疫后攻毒 GX0101 的死亡率及肿瘤发生率 |
| 2.3.3 各组海兰褐鸡免疫后攻毒 GX0101 的死亡率及肿瘤发生率 |
| 2.3.4 GX0101 在免疫鸡体内的增殖动态 |
| 2.3.4.1 检测 MDV GX0101 的荧光定量 PCR 标准曲线 |
| 2.3.4.2 SC9-1、CVI988/Rispens 免疫 SPF 鸡后 GX0101 的增殖动态 |
| 2.3.4.3 SC9-1、CVI988/Rispens 免疫海兰褐鸡后 GX0101 的增殖动态 |
| 2.3.5 SPF 鸡免疫 SC9-1、CVI988/Rispens 后灭活油苗诱导抗体水平比较 |
| 2.3.6 海兰褐鸡免疫 SC9-1、CVI988/Rispens 后灭活油苗诱导抗体水平比较 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 已发表的论文 |
（9）表达鸡白细胞介素2的重组马立克病毒的免疫保护效力及免疫增强作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 马立克氏病疫苗的研究进展 |
| 1.1 MDV的发现和分型 |
| 1.2 MDV毒力的进化 |
| 1.3 MD疫苗的免疫保护机制 |
| 1.4 MD疫苗 |
| 2 鸡白细胞介素-2(ChIL-2)的研究进展 |
| 2.1 ChIL-2的免疫增强作用 |
| 2.2 ChIL-2的免疫治疗作用 |
| 第二章 表达鸡白细胞介素2的重组马立克病毒的免疫保护效力及免疫增强作用 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒、细菌、病毒和细胞 |
| 1.2 鸡胚和实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 转移载体的构建 |
| 2.2 重组病毒的构建 |
| 2.3 rMDV-IL2对鸡免疫系统的影响 |
| 2.4 rMDV-IL2的免疫效力试验 |
| 2.5 rMDV-IL2对新城疫La Sota疫苗的免疫增强作用 |
| 2.6 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 转移载体的构建 |
| 3.2 重组病毒的挑选与纯化 |
| 3.3 rMDV-IL2的鉴定 |
| 3.4 rMDV-IL2对鸡外周血中CD4~+、CD8~+T淋巴细胞比例的影响 |
| 3.5 rMDV-IL2免疫后对鸡免疫器官指数的影响 |
| 3.6 MDV超强毒株RBIB感染鸡后的病理学观察 |
| 3.7 rMDV-IL2的免疫保护效力 |
| 3.8 rMDV-IL2对新城疫La Sota疫苗免疫后抗体滴度的影响 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录 |
（10）四个厂家MD商品活疫苗病毒含量的评价及其免疫雏鸡后抗体水平的比较研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 马立克病毒的生物学特性研究进展 |
| 1.1 MD 的发展历史 |
| 1.2 MDV 形态学 |
| 1.3 MDV 的分类和特征性质 |
| 1.4 马立克病毒 |
| 1.4.1 DNA 结构组成 |
| 1.4.2 感染细胞中的 DNA 结构 |
| 1.4.3 病毒复制 |
| 1.5 MD 的临床症状 |
| 1.6 MD 肿瘤的发生 |
| 1.7 MD 疫苗研究进展 |
| 1.8 本研究的目的及意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 四个厂家 MD 商品活疫苗病毒含量的评价 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 疫苗 |
| 2.1.2 SPF 鸡胚 |
| 2.1.3 细胞 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 试剂的配制 |
| 2.1.6 准备材料 |
| 2.1.7 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 CEF 的制备 |
| 2.2.2 CEF 传代 |
| 2.2.3 商品 MD 活疫苗接种细胞测定病毒滴度 |
| 2.2.4 结果判定 |
| 2.2.5 滴度计算 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 MDV 疫苗病毒在细胞上形成的蚀斑 |
| 2.3.2 疫苗的滴度 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 不同厂家 MD 商品活疫苗免疫雏鸡后抗体水平的比较 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 疫苗 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 稀释液 |
| 3.1.4 试剂 |
| 3.1.5 准备材料 |
| 3.1.6 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 分组 |
| 3.2.2 疫苗的稀释 |
| 3.2.3 免疫剂量及接种方式 |
| 3.2.4 免疫前后鸡群抗体的测定 |
| 3.2.5 数据处理 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 抗体的测定 |
| 3.3.2 抗体的比较 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、MD CVI988疫苗的PFU与免疫效果（论文参考文献）
- [1]2017-2019马立克氏病病毒分子流行病学及分离株GX18NNM4的致病性研究[D]. 石梦雅. 广西大学, 2020(02)
- [2]表达鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因的重组马立克氏病病毒活载体疫苗研究[D]. 李凯. 中国农业科学院, 2018(05)
- [3]ALV引起的免疫抑制对马立克氏病疫苗免疫保护效果的影响[D]. 林璐璐. 广西大学, 2018(12)
- [4]马立克病毒通过DNA损伤应答通路调控病毒复制的研究[D]. 连雪. 南京农业大学, 2018
- [5]MDV悬浮培养技术工艺及免疫保护研究[D]. 温良海. 华南农业大学, 2017(08)
- [6]含REV-LTR基因的马立克氏病毒活疫苗的生物安全评价及免疫效力研究[D]. 杨洋. 扬州大学, 2016(02)
- [7]整合REV LTR序列的MDV弱毒株的分离鉴定与生物学特性[J]. 陈瑞爱,罗琼,郭凯,刘正伟,李慧敏,王建丽. 微生物学报, 2014(06)
- [8]敲除Meq基因的重组鸡马立克氏病毒与CV1988/Rispens疫苗株免疫保护效力的比较研究[D]. 段伦涛. 山东农业大学, 2014(12)
- [9]表达鸡白细胞介素2的重组马立克病毒的免疫保护效力及免疫增强作用[D]. 许秋阳. 扬州大学, 2014(01)
- [10]四个厂家MD商品活疫苗病毒含量的评价及其免疫雏鸡后抗体水平的比较研究[D]. 汪洁. 西北农林科技大学, 2014(02)