本文主要研究内容
作者于凤川（2019）在《奇异变形杆菌醇脱氢酶的克隆表达及酶学性质研究》一文中研究指出：醇脱氢酶（ADHs,EC 1.1.1.1）,是属于氧化还原酶的第一亚类,该酶通常可以使用NAD（P）H作为辅酶将醛或酮转化为相对应的醇。醇脱氢酶由于其各种独特的生理生化性质和酶学性质,因而被广泛的应用于各个方面,主要是医学研究、化工生产、食品研究以及生物工程研究。在本论文中,在大肠杆菌中成功地表达了5个来源于奇异变形杆菌Proteus mirabilis JN458中的醇脱氢酶,优化了表达质粒和诱导条件,并探究了五种醇脱氢酶的酶学性质,为研究奶酪芳香气味的产生奠定了分子生物学基础。主要研究结果如下:（1）成功克隆了5个来源于P.mirabilis JN458的醇脱氢酶基因（adh1、adh2、adh3、adh4、adh5）,将5个基因成功与pColdⅡ质粒相连,构建重组质粒后,将其转入Escherichia coli BL21（DE3）中并对其进行表达。预测得到的5个醇脱氢酶的蛋白分子量分别为40.1kDa、41.3 kDa、42.4 kDa、39.3 kDa和37.3 kDa。酶活验证发现5个醇脱氢酶对苯乙醛均具有一定的酶活。（2）由于pColdⅡ质粒的蛋白表达量和酶活不高,因此对表达质粒和重组菌株诱导条件进行了优化。选择pET28a、pETDuet-1、pRSFDuet-1和pColADuet-1进行表达质粒优化,分别构建了重组质粒pET28a-adh1,pETDuet-1-adh1,pRSFDuet-1-adh1和pColADuet-1-adh1,最终选择pETDuet-1作为表达质粒。最佳的诱导条件:培养基初始pH为6.5,诱导初始细胞的浓度OD600为0.4,诱导剂IPTG的浓度为0.4 mmol·L-1,诱导温度为15℃,诱导后培养时间为18 h,摇床转速为220 r·min-1,在此条件下,酶活比优化前提高了77%。（3）采用镍柱和脱盐柱对ADHs进行蛋白纯化,并研究了5种醇脱氢酶的酶学性质。ADH-1、ADH-2和ADH-3的最适pH为7.0,ADH-4和ADH-5的最适pH为8.0,ADH-1、ADH-3和ADH-5的最适温度为40℃,ADH-2和ADH-4的最适温度为45℃。5种醇脱氢酶都有广泛的底物范围。5个酶关于苯乙醛、2-甲基丁醛和戊醛的动力学参数如下:对于ADH-1,Km分别为34.55、6.44和4.23mmol·L-1;对于ADH-2,Km分别为16.90、3.13和4.93mmol·L-1;对于ADH-3,Km分别为10.01、4.42和5.04mmol·L-1;对于ADH-4,Km分别为4.66、14.81和5.22mmol·L-1,;对于ADH-5,Km分别为19.64、24.62和1.33mmol·L-1。
Abstract
chun tuo qing mei （ADHs,EC 1.1.1.1）,shi shu yu yang hua hai yuan mei de di yi ya lei ,gai mei tong chang ke yi shi yong NAD（P）Hzuo wei fu mei jiang quan huo tong zhuai hua wei xiang dui ying de chun 。chun tuo qing mei you yu ji ge chong du te de sheng li sheng hua xing zhi he mei xue xing zhi ,yin er bei an fan de ying yong yu ge ge fang mian ,zhu yao shi yi xue yan jiu 、hua gong sheng chan 、shi pin yan jiu yi ji sheng wu gong cheng yan jiu 。zai ben lun wen zhong ,zai da chang gan jun zhong cheng gong de biao da le 5ge lai yuan yu ji yi bian xing gan jun Proteus mirabilis JN458zhong de chun tuo qing mei ,you hua le biao da zhi li he you dao tiao jian ,bing tan jiu le wu chong chun tuo qing mei de mei xue xing zhi ,wei yan jiu nai lao fang xiang qi wei de chan sheng dian ding le fen zi sheng wu xue ji chu 。zhu yao yan jiu jie guo ru xia :（1）cheng gong ke long le 5ge lai yuan yu P.mirabilis JN458de chun tuo qing mei ji yin （adh1、adh2、adh3、adh4、adh5）,jiang 5ge ji yin cheng gong yu pColdⅡzhi li xiang lian ,gou jian chong zu zhi li hou ,jiang ji zhuai ru Escherichia coli BL21（DE3）zhong bing dui ji jin hang biao da 。yu ce de dao de 5ge chun tuo qing mei de dan bai fen zi liang fen bie wei 40.1kDa、41.3 kDa、42.4 kDa、39.3 kDahe 37.3 kDa。mei huo yan zheng fa xian 5ge chun tuo qing mei dui ben yi quan jun ju you yi ding de mei huo 。（2）you yu pColdⅡzhi li de dan bai biao da liang he mei huo bu gao ,yin ci dui biao da zhi li he chong zu jun zhu you dao tiao jian jin hang le you hua 。shua ze pET28a、pETDuet-1、pRSFDuet-1he pColADuet-1jin hang biao da zhi li you hua ,fen bie gou jian le chong zu zhi li pET28a-adh1,pETDuet-1-adh1,pRSFDuet-1-adh1he pColADuet-1-adh1,zui zhong shua ze pETDuet-1zuo wei biao da zhi li 。zui jia de you dao tiao jian :pei yang ji chu shi pHwei 6.5,you dao chu shi xi bao de nong du OD600wei 0.4,you dao ji IPTGde nong du wei 0.4 mmol·L-1,you dao wen du wei 15℃,you dao hou pei yang shi jian wei 18 h,yao chuang zhuai su wei 220 r·min-1,zai ci tiao jian xia ,mei huo bi you hua qian di gao le 77%。（3）cai yong nie zhu he tuo yan zhu dui ADHsjin hang dan bai chun hua ,bing yan jiu le 5chong chun tuo qing mei de mei xue xing zhi 。ADH-1、ADH-2he ADH-3de zui kuo pHwei 7.0,ADH-4he ADH-5de zui kuo pHwei 8.0,ADH-1、ADH-3he ADH-5de zui kuo wen du wei 40℃,ADH-2he ADH-4de zui kuo wen du wei 45℃。5chong chun tuo qing mei dou you an fan de de wu fan wei 。5ge mei guan yu ben yi quan 、2-jia ji ding quan he wu quan de dong li xue can shu ru xia :dui yu ADH-1,Kmfen bie wei 34.55、6.44he 4.23mmol·L-1;dui yu ADH-2,Kmfen bie wei 16.90、3.13he 4.93mmol·L-1;dui yu ADH-3,Kmfen bie wei 10.01、4.42he 5.04mmol·L-1;dui yu ADH-4,Kmfen bie wei 4.66、14.81he 5.22mmol·L-1,;dui yu ADH-5,Kmfen bie wei 19.64、24.62he 1.33mmol·L-1。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自江南大学的于凤川，发表于刊物江南大学2019-10-21论文，是一篇关于奇异变形杆菌论文,醇脱氢酶论文,克隆表达论文,酶学性质论文,江南大学2019-10-21论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自江南大学2019-10-21论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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