张爱霞1,2姚琼凤1赵书策1
（1嘉应学院生命科学学院广东梅州514015）
（2中山大学中山医学院干细胞与组织工程中心广东广州510080）
【摘要】目的：建立pOct4-Neo转基因的小鼠胚胎干细胞（ESC）株，为进一步研究ESC分化提供有力的保障。方法：设置G418不同浓度进行小鼠ESC培养，确定ESC致死G418浓度；电穿孔法转染小鼠ESC，通过G418筛选并挑取阳性克隆，检测所得细胞胚胎干细胞特异性标志物Oct4及SSEA-1的表达，通过拟胚体诱导体外分化。结果：ESC的致死浓度为350μg/mL，在含400μg/mlG418的培养条件下，所得阳性细胞呈克隆样鸟巢状生长，Oct4、SSEA-1表达阳性，体外可以形成拟胚体和自发分化。结论：成功对小鼠ESC进行了pOct4-Neo的转基因，为进一步的小鼠ESC体外分化研究奠定了基础。
【关键词】胚胎干细胞；新霉素抗性基因；转基因
【中图分类号】R392【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）04-0012-02EmbryonicstemcellsinmiceOCT4startneomycinresistancegeneresearchZhangAixia,ZhaoShuce.JiayingcollegeoflifesciencecollegeofGuangdongProvince,Meizhou514015,China;YaoQiongfeng.Zhongshancollegeofmedicine,SunYat-senuniversity,Guangzhou510080,China
【Abstract】ObjectiveEstablishpOct4Neo-geneticallymodifiedmiceembryonicstemcells(ESC)strains,ESCdifferentiationprovidestrongguaranteeforfurtherstudy.MethodsMiceESCtrainingsetdifferentconcentrationofG418,determinetheESClethalconcentrationofG418;TransfectionmiceESCelectroporationmethod,byG418screeningandtakepositiveclones,cells,embryonicstemcellsmeasuredOct4tumor-specificmarkersandtheexpressionofSSEA1,throughtheembryoidbodiesinducingdifferentiationinvitro.ResultsESClethalconcentrationis350mug/mL,inthelandof400mug/mLG418cultivationcondition,thepositivecellswereclonedsamplenest,Oct4,SSEA1expresspositive,canformembryoidbodiesandthespontaneousdifferentiationinvitro.ConclusionsSuccessonthemiceESCpOct4Neo-geneticallymodified(gm),inordertofurtherthemiceESCdifferentiationinvitroresearchlaidthefoundation.
【Keywords】Embryonicstemcells；Neomycinresistancegene；Geneticallymodified(gm)
胚胎干细胞（embryonicstemcells,ESC）一般分离自哺乳动物早期胚胎内细胞团，在体外具有无限增殖的能力和分化为各种类型组织细胞的潜能[1]。ESC具有发育的全能性，是研究发育和疾病发生的重要的模型。目前体外培养ESC的方法主要有二大类:有饲养层培养法和无饲养层培养法[2]。但无饲养层培养体系面临的主要问题是ESC容易发生自发分化，这会对ESC的体外诱导分化研究产生干扰。Oct4是ESC的多潜能性维持所必需的内源性因子之一，对干细胞特性的维持起关键作用[3-4]。本实验将Oct4启动子驱动表达的新霉素抗性基因（neo）转入小鼠的ESC，通过G418筛选以及干细胞特性的观察，建立在无饲养层培养体系中无自发终末分化细胞的ESC，为ESC的体外分化研究提供保障。
1.材料与方法
1.1材料与试剂
小鼠ESC与pOct4-Neo载体由中山大学中山医学院干细胞与组织工程中心提供。H-DMEM培养基购于美国Invitrogen公司；胎牛血清（fetalbovineserum，FBS）购于美国Hyclone公司；白血病抑制因子（LIF）购于Chemicon公司；明胶购于美国Sigma公司;免疫组化用Oct-4抗体购于美国Millipore公司，UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒购于Maixin-Bio公司；AEC显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。
1.2ESC的体外培养及G418致死浓度的选择
ESC培养在2％明胶包被的培养皿中，ESC的培养液为含10%胎牛血清、1mmol/LL-谷氨酰胺、0.1mmol/L非必需氨基酸、0.1mmol/Lβ-巯基乙醇、1000U/mlLIF的H-DMEM完全培养液。ESC培养时加入G418，浓度设置为100μg/ml,150μg/ml，200μg/ml，250μg/ml，300μg/ml，350μg/ml，400μg/ml，450μg/ml，500μg/ml。37℃，5%CO2培养箱中培养。
1.3电穿孔转染及pOct4-Neo阳性细胞克隆的筛选
取1×106细胞于400μlPBS中，加入10μg的DNA质粒混匀，转移至电穿孔杯中进行转染。转染后将细胞接种到2％明胶覆盖的培养皿上，培养48h后用含400μg/mlG418的ESC培养液换液，10d后挑取阳性克隆，胰酶消化后再次接种到2％明胶覆盖的培养皿中，并用含400μg/mlG418的ESC培养液培养，培养72h后再次挑取阳性克隆。
1.4pOct4-Neo胚胎干细胞的形态学观察
pOct4-NeoESC接种在2％明胶覆盖的培养皿中，用含400μg/mlG418的ESC培养液培养，显微镜下观察细胞集落的形态特征。
1.5免疫组化检测特异分子标记
吸去培养液，PBS清洗，4%PFA/PBS固定20min，0.02%TritonX100室温穿透细胞20min，二抗宿主血清封闭30min，弃血清，加入一抗抗体Oct-4（1∶200稀释）、SSEA-1（1∶100稀释），室温孵育1h。PBS洗涤后用UltraSensitiveTMSP超敏试剂盒和AEC显色试剂盒进行检测。
1.6拟胚体的诱导和体外分化
胰酶消化pOct4-NeoESC，接种在低粘附性的培养皿中，以不含LIF的ESC培养液悬浮培养，2～3d换液1次，悬浮培养6d后，显微镜下观察拟胚体的形成，将形成的拟胚体进行贴壁培养，显微镜下观察细胞形态变化。
2.结果
2.1G418致死浓度的选择
未转染的ESC培养时加入G418，当浓度达到350μg/mL时，培养的ESC全部死亡，表明350μg/mL是所培养的ESC的致死浓度。
2.2pOct4-Neo胚胎干细胞的形态特征
图1所示是在2％明胶覆盖的培养皿中，用含400μg/mlG418的ESC培养液培养的pOct4-Neo胚胎干细胞，如图所示，细胞呈克隆生长，结构致密，边缘清楚。
图1Oct4-Neo细胞克隆形态(×200)图3小鼠pOct4-Neo胚胎干细胞的拟胚体(×100)
2.3Oct-4与SSEA-1的免疫组化检测
显微镜下观察可见Oct-4和SSEA-1的染色结果，表明用含G418的ESC培养液培养存活的细胞Oct-4（图2）和SSEA-1（图2）的表达为阳性。
图2小鼠pOct4-Neo胚胎干细胞特异标志的免疫化学染色(×100)
2.4pOct4-Neo胚胎干细胞的体外分化
用不含LIF和G418的培养液体外悬浮培养后，pOct4-NeoESC能形成拟胚体，见图3拟胚体贴壁培养后,周围有形态多样性的分化细胞生长。
3.讨论
胚胎干细胞在无饲养层的体外培养中，有时发生自发的分化，转染pOct4-Neo载体后，在明胶铺板的培养皿中，经G418筛选，细胞呈克隆样生长，克隆周边未见终末分化的细胞，且表达ESC特异的表面标志，具有形成拟胚体和体外分化的能力，可以在体外长期传代培养。
细胞转染的方法较多，如有病毒载体法、电穿孔法、磷酸钙沉淀法和脂质体法等［5］，病毒载体常用的有腺病毒载体、慢病毒载体、反转录病毒载体［6］。细胞转染的方法中，电穿孔法是其中较为常用的方法之一。细胞电穿孔法研究始于上世纪70年代，电穿孔法操作简单、参数容易控制、重复性好［7］。本实验采用电穿孔法进行基因转染，获得了3株转基因细胞株，其转基因细胞均生长良好，具有典型的干细胞特性，表明电穿孔法是ESC转基因研究中的理想转染方法。
【参考文献】
[1]王庆忠，刘以训，韩春生.胚胎干细胞多潜能性维持的分子机制[J].科学通报，2005，50（15）：1556-1566.
[2]沈岳飞，罗杰峰，莫雪安等.小鼠胚胎干细胞的分离培养与鉴定[J].广西医科大学学报，2006，23(1)：43-45.
[3]饶家辉，周虚.干细胞中两个关键细胞因子Oct4和Sox2[J].动物医学进展，2012，33（3）：114-119.
[4]伍丽静，韦曦.Oct4调节成体干细胞多能性的研究进展[J].中华口腔医学研究杂志，2013，7（6）：501-503.
[5]覃兆鲜，潘天彪，谢炳坤．猪成纤维细胞转染方法的比较[J].江苏农业科学，2011，39(3):250-251．