本文主要研究内容
作者万烨（2019）在《创伤弧菌磷脂酶VvPlpA的结构与功能研究》一文中研究指出：创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种嗜温、嗜盐、嗜碱的革兰氏阴性海洋致病菌,广泛分布于河口、海洋,可通过皮肤伤口或肠道感染我国主要的养殖鱼类,致病力强、发病迅速且死亡率高,严重危害水产养殖业的发展。创伤弧菌的强致病性直接与其毒力因子相关,目前研究已发现的毒力因子包括溶细胞素、金属蛋白酶、荚膜多糖等。此外,研究发现创伤弧菌可以通过二型分泌系统分泌一种毒力因子磷脂酶VvPlpA,它以磷脂酰胆碱为特异性底物,在致病性中发挥着重要作用。在感染早期,创伤弧菌通过VvPlpA破坏宿主皮肤或肠道的上皮屏障,入侵组织和血管,催化水解产物还可以作为信号分子引发炎症,进而造成组织坏死和败血症。因此,关于创伤弧菌关键毒力因子VvPlpA的研究,对了解其致病机制和防治策略具有重要意义。通过比对VvPlpA的氨基酸序列发现,它与弧菌属一类胞外磷脂酶序列的相似度都在60%以上,是弧菌共有的热不稳定溶血素(TLH)家族蛋白,而TLH蛋白的分子结构目前均未得到详细的研究和报道;VvPlpA具有SGNH水解酶家族的典型序列特征,根据该序列特征可以确定VvPlpA的活性位点残基包括丝氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、天冬酰胺(Asn)以及组氨酸(His),其中Ser和His是主要的催化残基,通常协同位于His序列前的天冬氨酸(Asp)或谷氨酸(Glu),以催化三联体的形式发挥水解功能。VvPlpA蛋白在此Asp/Glu位点的残基为Gly,显示出非经典三联体模式的序列特征。为深入探究TLH蛋白及非经典模式的催化三联体,更好地了解创伤弧菌致病机制与相应防治手段,本研究以创伤弧菌毒力因子VvPlpA为研究对象,通过结构生物学方法探究并分析其结构和功能的关系。本研究通过大肠杆菌原核表达系统获得硒代甲硫氨酸的VvPlpA重组蛋白,利用单波长反常散射法获取相位信息,解析了目的蛋白VvPlpA的晶体结构。VvPlpA的N端部分包含多个β折叠结构,具体功能目前未知;C端部分具有典型的α/β/α结构特点,属于SGNH水解酶家族的磷脂酶结构域。通过蛋黄平板和血平板定性实验,我们确定了纯化所得VvPlpA重组蛋白的磷脂酶活性和溶血性。为进一步验证VvPlpA中活性位点残基的关键作用,我们设计构建了对应位点的突变体蛋白,其中Ser152Gly,His392Asn及Asn247Asp表现出极低的催化活性,证明了这些活性位点残基在催化功能中十分必要。在VvPlpA活性位点His392与上述非典型残基的Gly389附近,我们发现了一个较弱的反常散射信号,推测该位置结合氯离子(Cl~-)。我们通过分子置换法解析了在溴离子条件下纯化和结晶的VvPlpA晶体结构,收集对应溴离子(Br~-)的反常散射信号,验证Br~-对Cl~-的取代,由此确定了Cl~-确实结合在VvPlpA蛋白的活性位点附近。我们利用突变体Gly389Asp模拟具有经典催化三联体的蛋白,测定VvPlpA与Gly389Asp在添加不同Cl~-浓度体系中的磷脂酶活性,结果发现野生型蛋白的催化活性伴随Cl~-浓度的升高而上升,直至达到饱和状态下的最大催化速率,Gly389Asp蛋白活性则不随Cl~-的浓度发生改变。由此说明Cl~-在VvPlpA催化功能中起到关键的作用,同时证明VvPlpA磷脂酶具有新颖的Ser-His-chloride催化三联体模式。为了解经典催化三联体和二联体在VvPlpA中可能的结构模式,我们解析了突变体Gly389Asp与Gly389Asn的晶体结构,其中氯离子的结合位置均被突变残基的侧链所取代,结构特点与催化活性一致。我们还发现突变体Gly389Asn的活性位点附近结合了一个六乙二醇小分子,显示出狭长的底物结合口袋,为探究催化过程中底物的进入和结合提供了重要的结构基础。
Abstract
chuang shang hu jun (Vibrio vulnificus)shi yi chong shi wen 、shi yan 、shi jian de ge lan shi yin xing hai xiang zhi bing jun ,an fan fen bu yu he kou 、hai xiang ,ke tong guo pi fu shang kou huo chang dao gan ran wo guo zhu yao de yang shi yu lei ,zhi bing li jiang 、fa bing xun su ju si wang lv gao ,yan chong wei hai shui chan yang shi ye de fa zhan 。chuang shang hu jun de jiang zhi bing xing zhi jie yu ji du li yin zi xiang guan ,mu qian yan jiu yi fa xian de du li yin zi bao gua rong xi bao su 、jin shu dan bai mei 、jia mo duo tang deng 。ci wai ,yan jiu fa xian chuang shang hu jun ke yi tong guo er xing fen bi ji tong fen bi yi chong du li yin zi lin zhi mei VvPlpA,ta yi lin zhi xian dan jian wei te yi xing de wu ,zai zhi bing xing zhong fa hui zhao chong yao zuo yong 。zai gan ran zao ji ,chuang shang hu jun tong guo VvPlpApo huai su zhu pi fu huo chang dao de shang pi bing zhang ,ru qin zu zhi he xie guan ,cui hua shui jie chan wu hai ke yi zuo wei xin hao fen zi yin fa yan zheng ,jin er zao cheng zu zhi huai si he bai xie zheng 。yin ci ,guan yu chuang shang hu jun guan jian du li yin zi VvPlpAde yan jiu ,dui le jie ji zhi bing ji zhi he fang zhi ce lve ju you chong yao yi yi 。tong guo bi dui VvPlpAde an ji suan xu lie fa xian ,ta yu hu jun shu yi lei bao wai lin zhi mei xu lie de xiang shi du dou zai 60%yi shang ,shi hu jun gong you de re bu wen ding rong xie su (TLH)jia zu dan bai ,er TLHdan bai de fen zi jie gou mu qian jun wei de dao xiang xi de yan jiu he bao dao ;VvPlpAju you SGNHshui jie mei jia zu de dian xing xu lie te zheng ,gen ju gai xu lie te zheng ke yi que ding VvPlpAde huo xing wei dian can ji bao gua si an suan (Ser)、gan an suan (Gly)、tian dong xian an (Asn)yi ji zu an suan (His),ji zhong Serhe Hisshi zhu yao de cui hua can ji ,tong chang xie tong wei yu Hisxu lie qian de tian dong an suan (Asp)huo gu an suan (Glu),yi cui hua san lian ti de xing shi fa hui shui jie gong neng 。VvPlpAdan bai zai ci Asp/Gluwei dian de can ji wei Gly,xian shi chu fei jing dian san lian ti mo shi de xu lie te zheng 。wei shen ru tan jiu TLHdan bai ji fei jing dian mo shi de cui hua san lian ti ,geng hao de le jie chuang shang hu jun zhi bing ji zhi yu xiang ying fang zhi shou duan ,ben yan jiu yi chuang shang hu jun du li yin zi VvPlpAwei yan jiu dui xiang ,tong guo jie gou sheng wu xue fang fa tan jiu bing fen xi ji jie gou he gong neng de guan ji 。ben yan jiu tong guo da chang gan jun yuan he biao da ji tong huo de xi dai jia liu an suan de VvPlpAchong zu dan bai ,li yong chan bo chang fan chang san she fa huo qu xiang wei xin xi ,jie xi le mu de dan bai VvPlpAde jing ti jie gou 。VvPlpAde Nduan bu fen bao han duo ge βshe die jie gou ,ju ti gong neng mu qian wei zhi ;Cduan bu fen ju you dian xing de α/β/αjie gou te dian ,shu yu SGNHshui jie mei jia zu de lin zhi mei jie gou yu 。tong guo dan huang ping ban he xie ping ban ding xing shi yan ,wo men que ding le chun hua suo de VvPlpAchong zu dan bai de lin zhi mei huo xing he rong xie xing 。wei jin yi bu yan zheng VvPlpAzhong huo xing wei dian can ji de guan jian zuo yong ,wo men she ji gou jian le dui ying wei dian de tu bian ti dan bai ,ji zhong Ser152Gly,His392Asnji Asn247Aspbiao xian chu ji di de cui hua huo xing ,zheng ming le zhe xie huo xing wei dian can ji zai cui hua gong neng zhong shi fen bi yao 。zai VvPlpAhuo xing wei dian His392yu shang shu fei dian xing can ji de Gly389fu jin ,wo men fa xian le yi ge jiao ruo de fan chang san she xin hao ,tui ce gai wei zhi jie ge lv li zi (Cl~-)。wo men tong guo fen zi zhi huan fa jie xi le zai xiu li zi tiao jian xia chun hua he jie jing de VvPlpAjing ti jie gou ,shou ji dui ying xiu li zi (Br~-)de fan chang san she xin hao ,yan zheng Br~-dui Cl~-de qu dai ,you ci que ding le Cl~-que shi jie ge zai VvPlpAdan bai de huo xing wei dian fu jin 。wo men li yong tu bian ti Gly389Aspmo ni ju you jing dian cui hua san lian ti de dan bai ,ce ding VvPlpAyu Gly389Aspzai tian jia bu tong Cl~-nong du ti ji zhong de lin zhi mei huo xing ,jie guo fa xian ye sheng xing dan bai de cui hua huo xing ban sui Cl~-nong du de sheng gao er shang sheng ,zhi zhi da dao bao he zhuang tai xia de zui da cui hua su lv ,Gly389Aspdan bai huo xing ze bu sui Cl~-de nong du fa sheng gai bian 。you ci shui ming Cl~-zai VvPlpAcui hua gong neng zhong qi dao guan jian de zuo yong ,tong shi zheng ming VvPlpAlin zhi mei ju you xin ying de Ser-His-chloridecui hua san lian ti mo shi 。wei le jie jing dian cui hua san lian ti he er lian ti zai VvPlpAzhong ke neng de jie gou mo shi ,wo men jie xi le tu bian ti Gly389Aspyu Gly389Asnde jing ti jie gou ,ji zhong lv li zi de jie ge wei zhi jun bei tu bian can ji de ce lian suo qu dai ,jie gou te dian yu cui hua huo xing yi zhi 。wo men hai fa xian tu bian ti Gly389Asnde huo xing wei dian fu jin jie ge le yi ge liu yi er chun xiao fen zi ,xian shi chu xia chang de de wu jie ge kou dai ,wei tan jiu cui hua guo cheng zhong de wu de jin ru he jie ge di gong le chong yao de jie gou ji chu 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)的万烨，发表于刊物中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)2019-07-24论文，是一篇关于创伤弧菌论文,溶血素论文,催化三联体论文,氯离子论文,水解酶超家族论文,中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)2019-07-24论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)2019-07-24论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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