一、细菌遗传转化与水平基因转移（论文文献综述）
葛文扬[1]（2021）在《长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的图位克隆及功能解析》文中指出小麦是全球种植面积最大,分布最广的重要粮食作物,全球超过三分之一的人口以小麦作为淀粉、蛋白质、矿物质及维生素等人体所需物质的主要来源。小麦赤霉病是一种主要由禾谷镰孢菌等病原菌引起的严重穗部病害,不仅严重危害小麦产量及品质,其病原菌在侵染的同时还会产生多种真菌毒素进一步威胁人畜健康。然而目前赤霉病的有效抗源并不多,因此挖掘新的主效抗赤霉病基因,对于解决这一世界性难题具有重要意义。长穗偃麦草是一种多年生禾本科植物,具有多种优良性状,对包括小麦赤霉病、锈病等在内的多种病害均具有良好抗性。本研究利用图位克隆技术分离到来源于十倍体长穗偃麦草的抗赤霉病QTL Fhb7的候选基因,采用遗传转化等多种方式验证了该基因的功能,并进一步对该基因抗病机制及进化机制进行解析,主要研究结果如下:1.本研究利用普通小麦、大麦与本实验室组装的二倍体长穗偃麦草参考基因中组高可信度基因的蛋白序列进行同源性分析。同时基于直系同源基因利用移动平均模型（MA）计算Ks值,估算E基因组与小麦A、B、D亚基因组的分化时间大约在4.77-4.96百万年前。此外还进一步利用黑麦、异形花草、簇毛麦、旱麦草、新麦草这5个二倍体小麦族物种的转录组测序数据以及小麦参考基因组和大麦参考基因组,筛选出直系同源基因构建系统进化树,结果发现在这几个小麦族物种中E基因组与小麦A、B、D基因组亲缘关系最近。2.根据二倍体长穗偃麦草（E）参考基因组开发分子标记,利用小麦-十倍体长穗偃麦草染色体异代换系K11463[7el1（7D）]、K2620[7el2（7D）]构建了一个BC6F1群体,同时构建了一个含ph1b突变位点的定位群体。筛选自交后代共19200个单株,将Fhb7定位在分子标记Xsdau K79（739708845bp）与Xsdau K80（740852646bp）之间,其物理区间大约为1.2 Mb。通过对7el1（7D）、7el2（7D）和二倍体长穗偃麦草穗部接菌处理转录组数据的分析,发现只有2个候选基因在7el2（7D）基因组和E参考基因组中特异表达。根据关键重组体的表型数据进行分析,最终将基因Fhb7锁定在仅包含单一表达基因的245 Kb区域（该基因功能注释为谷胱甘肽巯基转移酶,Glutathione S-transferase）。利用BMSV-VIGS技术诱导基因沉默并进行离体叶片赤霉病鉴定结果显示,该候选基因沉默后叶片坏死斑面积明显增大。同时,我们采用EMS化学诱变构建了一个TILLING突变群体,通过Sanger测序检测发现有5株非同义突变体及两株提前终止突变体的赤霉病抗性有不同程度的下降。此外,本研究通过遗传转化,获得了两个受体背景的Fhb7候选基因的原始表达转基因株系和一个受体背景的过量表达转基因株系,并对不同的转基因株系进行穗部赤霉病表型鉴定。结果显示,鉴定的3个科农199背景下的原始表达转基因株系均大幅度提高赤霉病抗性;Fielder背景下鉴定的12个原始表达株系中有11个株系抗性大幅度提高,部分转基因株系抗性水平与抗病亲本类似;以上证据充分证明了该候选基因是目标克隆的主效抗赤霉病基因Fhb7。另外,我们鉴定了以小麦品种Fielder为受体3个的过量表达转基因株系,其中22-3赤霉病抗性水平超过抗病亲本,类似于苏麦3号,22-5、22-6转基因株系在不同世代赤霉病抗性表现不稳定;进一步通过高分辨质谱检测显示,在发病过程中22-5株系穗部的解毒效应远低于含有Fhb7的抗病易位系,导致其抗性降低,但DNA、RNA和蛋白层面等分子水平证据尚待进一步研究。3.基因Fhb7表达受到单端孢霉烯族毒素脱氧雪腐镰刀烯醇（DON）的诱导,通过DON毒素胁迫实验,证明基因Fhb7可以提高植物和酵母对DON毒素的耐受能力;通过液相色谱高分辨质谱（LC-HRMS）,我们发现Fhb7编码的蛋白可以打开DON毒素重要毒性来源的C-12,13环氧基团,并催化其形成去环氧化的谷胱甘肽加合物（DON-GSH）,从而产生解毒效应。鉴于该环氧基团在A型和B型单端孢霉烯族毒素中的保守性,进一步研究发现Fhb7可以对3-ADON、15-ADON、NIV、T-2、HT-2、Fus-X、Das等一系列镰孢菌属分泌的毒素进行GSH衍生化,对单端孢霉烯族化合物具有广谱解毒功能。基于此结果我们经过筛选发现Fhb7对假禾谷镰孢菌和亚洲镰孢菌在转基因离体叶片上表现出显着抗性,其转基因植株对茎基腐病也具有良好抗性。4.本研究发现在一种禾本植物内生真菌香柱菌基因组中的单拷贝基因与Fhb7相似性高达97%,进一步的比对分析发现Fhb7的序列在多个Epichlo?属的内生真菌中均有分布。此外,通过筛选发现在鹅观草、纤毛鹅观草等其他小麦族物种中同样含有Fhb7同源基因,该结果暗示,小麦族原始祖先亲本在早期可能与某种Epichlo?属的内生真菌存在共生关系,通过基因水平转移将Epichlo?Fhb7的DNA整合到小麦族宿主植物基因组中,从而使小麦族植物进化出抗镰孢菌属病原菌侵染的功能。
陈冰[2]（2020）在《谷子基因编辑体系的建立及香味基因SiBADH2突变体的获得》文中研究指明谷子（Seteria italica）,是世界上最古老的的农作物之一,拥有大量的有益性状,如抗旱性、耐盐性、耐贫瘠性等,去壳后的谷子俗称小米,由于其含有丰富的营养物质,备受人们的青睐。随着人们生活水平的提高,对谷子的品质的要求也有所提高。然而,谷子遗传转化体系是一个世界性难题,到目前国内外还没有建立一个高效的遗传转化体系。本论文以谷子Ci846为研究材料,利用农杆菌介导的方法,建立了一套高效的谷子转化体系。率先在谷子中建立利用成熟的CRISPR/Cas9技术敲除的体系,以水稻香味基因OsBADH2的同源基因SiBADH2为例,成功地在谷子中实现了对SiBADH2基因的敲除。具体研究内容如下:1.针对谷子遗传转化效率低的问题,本论文对谷子转化体系进行了优化,经多次平行对比试验,筛选最佳的处理时间,采用70%的乙醇灭菌1 min,再用20%的次氯酸钠溶液灭菌5 min,在此条件下的染菌率平均为0.52%,发芽率平均为99.83%;选择MS培养基作为基础培养基;培养基中需要添加CuSO4,ZnSO4与2 mg/L 2,4-D,不需要添加KT、脯氨酸与AgNO3;在选择培养基中加入40 mg/L Hyg可提高抗性愈伤率;分化培养基中,可将激素2,4-D（1 mg/L）与KT（1 mg/L）搭配使用;侵染农杆菌浓度为OD600=0.4～0.6,侵染时间为40 min,共培养4天。2.构建3个敲除SiBADH2基因的CRISPR/Cas9敲除载体,即构建3个敲除载体:pRLG103-BADH2-1、pRLG103-BADH2-2与pRLG103-BADH2-3,每个载体含有2个敲除靶点。3.经过遗传转化,仅pRLG103-BADH2-3载体获得22株再生植株,可能因体细胞变异原因,最终收获3株种子。对其进行测序鉴定,获得一批含有载体骨架和无载体骨架的后代。其中获得了2个无载体骨架纯合敲除株系。#20纯合突变体距离ATG 97 bp的位置后缺失99个碱基;#18纯合突变体距离ATG 196 bp的位置插入了一个碱基C。下一步计划评估这2个株系的农艺性状及代谢物的含量。
赵蕊[3]（2020）在《枯草芽胞杆菌质粒遗传转化的研究》文中指出枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）是一类产芽胞的革兰氏阳性菌,其不含内毒素,是国际上一种公认的安全微生物。枯草芽胞杆菌的用途广泛,常被用于植物生长的促进剂、植物病害的生物防治剂、食用益生菌、工业酶的生产菌株及异源蛋白的表达宿主等。将外源质粒导入枯草芽胞杆菌中来构建合适的基因工程表达系统使得枯草芽胞杆菌的应用前景更加广阔。因此,在枯草芽胞杆菌中发展高效的遗传操作体系就成为了研究的热点。目前,实验室已经在枯草芽胞杆菌中建立了相对完善的质粒遗传转化体系,包括原生质体转化、传统二步法转化和电转化等。虽然这些体系已经被广泛使用和优化,但是这些方法存在操作复杂、转化效率低和难以应用到野生枯草芽胞杆菌中等问题。因此,提高枯草芽胞杆菌中质粒的转化效率和简化实验操作是促进枯草芽胞杆菌在工业上应用的关键。已有相关报道认为相较于甲基化的DNA片段,非甲基化DNA及DNA的多联体形式能够提高DNA片段在枯草芽胞杆菌中的转化效率。本研究探究了DNA去甲基化和多联体形式对枯草芽胞杆菌质粒转化效率的影响和这些处理是否解决野生枯草菌株难以转化的问题。本研究采用Evomic Science公司优化的phi29 DNA聚合酶扩增试剂盒,通过phi29 DNA聚合酶扩增质粒得到连续的、非甲基化的长片段DNA并开展相关转化实验。通过二步法和电转转化,我们发现质粒的等温滚环扩增（Rolling-circle amplification,RCA）产物的的转化效率均是原始质粒的102倍左右,表明质粒经处理后的非甲基化及多联体形式的确能够大幅度提高质粒DNA的转化效率。但是,我们发现即使经去甲基化处理和形成多联体,质粒仍然不能通过二步法和电转法被转化到野生枯草芽胞杆菌中,表明这些操作不能解决野生菌株难以被转化的问题。我们发现表达氯霉素抗性的p GK12质粒及其RCA扩增产物在所测试的质粒中转化效率是最高的。在p GK12质粒的基础上插入长度不同的外源片段来构建一系列长度不同的质粒（4.5 kb-8.5 kb）,发现增加质粒的长度不影响它们及其RCA扩增产物的转化效率。综上所述,我们发现去甲基化和多联体的形式确实有助于增强枯草芽胞杆菌转化的效率,但是这些操作对野生枯草芽胞杆菌的转化没有帮助。在本研究中,我们还基于实验室前期发现的枯草芽胞杆菌细胞间基因水平转移的工作基础开发了一种新型的、发生在固体培养基平板上的枯草芽胞杆菌细胞间的质粒水平转移方法。在我前期研究中,我们发现当两株不同的枯草芽胞杆菌在压力下共培养时,染色体DNA的水平转移可以发生。本研究中我们发现,在同样的处理下也可以发生质粒的转移。本研究以多重氨基酸营养缺陷型的菌株TLPHMCΔamy E作为质粒供体菌株,避免细胞间遗传物质双向转移对实验结果的干扰。在该转化方法中,我们把供体菌和受体菌分别在合适的培养基中培养后,将混合菌液放置于固体平板上的微孔滤膜上,共培养一段时间后,即可实现质粒的转移。我们发现转化子在供受体混合菌液培养3 h左右即开始产生,而且转化子的数目随着共培养时间的增加而增加。我们探究了不同因素对细胞间质粒转化效率的影响。我们发现当受体菌为枯草芽胞杆菌168菌株,选择压力为氯霉素抗性时,质粒转化的最佳抗性压力条件为C50（50μg/ml）;当选择压力为红霉素抗性时,质粒转化的最佳抗性压力条件为E2（2μg/ml）;当选择压力为卡那霉素抗性时,质粒转化的最佳抗性压力条件为K30（30μg/ml）。当质粒框架一致,而抗性基因不同时,采用卡那霉素筛选时,转化子的数目分别是采用氯霉素和红霉素为选择压力时的100倍和10倍。我们还发现细胞间质粒转化的效率随着目的质粒的长度增加而降低:当目的质粒的长度增加1倍时,其转化效率降低3倍左右。此外,我们发现供受体菌的比例对转化效率也有显着的影响,当供受体菌的菌体数量混合比例为1/1时,转化的效率最高。通过该方法,我们不仅在枯草芽胞杆菌模式菌株168中实现了质粒的高效定向转移,还成功的将目的质粒转进了两株野生枯草芽胞杆菌和两株解淀粉芽胞杆菌中。这些结果说明细胞间基因水平转移技术不仅操作简便、而且比目前已有的实验室转化方法具有更广的菌株适用性。枯草芽胞杆菌的应用前景广阔,但是实现野生芽胞杆菌的转化一直是芽胞杆菌研究领域的难点。本研究通过去甲基化和形成多联体DNA的方法大大地提高了实验室常用的二步法和电转法的质粒转化效率,还构建了在固体平板上进行的芽胞杆菌间质粒定向转移的转化体系,解决了质粒不能被转进野生枯草芽胞杆菌的难题。我们研发的细胞间质粒转化的方法不仅实验过程简便易行,而且高效,为建立新的芽胞杆菌表达系统提供了新的方法和途径。
王义[4]（2019）在《橡胶树白粉菌遗传转化体系的构建及内源启动子筛选与鉴定研究》文中提出橡胶树白粉病是橡胶树最具经济破坏性的病害之一,其病原物—橡胶树白粉菌Oidium heveae Steinm是专性寄生真菌,有性世代尚未被发现,特别是其无法离体培养,遗传转化体系未见报道。本研究通过研究橡胶树白粉菌的专性寄生特性及其生理生化特性,对转化介质、分生孢子悬浮液的配制方法、分生孢子的抗生素敏感性、转化子的筛选与观察方法、报告基因的选择及电击缓冲液等多方面进行了研究。利用电击转化法和农杆菌介导法（ATMT）成功构建了橡胶树白粉菌的遗传转化体系,并在橡胶树白粉菌基因组基础上,筛选和鉴定了来自橡胶树白粉菌的50个内源启动子,为进一步优化橡胶树白粉菌遗传转化体系、开展更深入的分子研究,以及探明白粉菌的致病分子机制和生物进化提供科学依据。具体研究结果如下:测试了8种常用抗生素对O.heveae分生孢子的敏感性。结果表明,潮霉素B、卡那霉素和链霉素浓度为100μg/m L,氯霉素浓度为510μg/m L和头孢霉素浓度为1000μg/m L时,可以有效地抑制O.heveae分生孢子的萌发。氨苄青霉素、利福平和四环素对橡胶树白粉菌分生孢子的萌发和生长没有明显的抑制作用,甚至部分还能促进分生孢子的萌发。8种抗生素中仅潮霉素B对橡胶树古铜期嫩叶具有明显的植物毒性。因此,确定卡那霉素、氯霉素、头孢菌素和链霉素抗性的基因适合于用作橡胶树白粉菌遗传转化的选择标记。测定葡萄糖、甘露醇、山梨醇、HEPES、PEG1000不同浓度的水溶液对橡胶树白粉菌分生孢子萌发的影响。结果表明,只有40 m M的HEPES对橡胶树白粉菌分生孢子的影响最小,与对照组水溶液非常接近。因此确定40 m M的HEPES作为橡胶树白粉菌电击转化的电击缓冲液。选择卡那霉素抗性基因为筛选标记,引入红色荧光蛋白基因m Cherry为报告基因,成功构建表达载体p CAMBIA1302-m Cherry。在常规电击转化和ATMT法的基础上改进和创新,优化各类参数。转化后通过荧光显微镜观察到分生孢子、芽管、附着胞、初生菌丝、次生菌丝和分生孢子梗都具有红色荧光,而对照组野生型无荧光。转化后的橡胶树白粉菌T1到T10代都扩增到m Cherry基因,证明转化体非常稳定。PCR-Southern印迹杂交分析也证实靶基因整合进了橡胶树白粉菌的基因组中。电击转化体系优化条件为:分生孢子悬浮液制备:浓度106个/m L;助剂0.01%吐温80;制备时间:5～10 min;电击转化前混合物（载体DNA和O.heveae）的冰浴时间:1 min;电击转化的电压:2.5 kv;电脉冲,4.0 ms;电穿孔后的冰浴时间:5 min。ATMT体系优化条件为:分生孢子悬浮液制备:浓度106个/m L;助剂0.01%吐温80;制备时间:5～10 min;农杆菌复摇浓度:OD600=0.6～0.8;共培养时间:30 min。该电击转化和ATMT法转化体系的成功建立,对于研究外源基因的功能,相关效应蛋白的功能,橡胶树白粉菌的分子致病机制及其与宿主的互作都是非常有利的,更为其它专性寄生真菌的遗传转化提供了借鉴。以橡胶树白粉菌HO-73基因组数据为基础,利用生物信息学在线软件Promoter Scan进行启动子预测,得到疑似启动子135个。随后利用生物信息学在线预测软件Softberry进行二次筛选,得到50个疑似启动子序列。成功克隆获得50个内源疑似启动子序列并构建了其植物表达载体,利用烟草转基因技术进行瞬时表达验证其启动子功能,验证得到9个内源启动子。通过与阳性对照Ca MV 35S（35S）启动子的比较,初步判断其中4个（WY7、WY51、WY193和WY195）为强启动子,另5个（WY1、WY6、WY12、WY181和WY196）为弱启动子。通过q RT-PCR技术测定4个强启动子（WY7、WY51、WY193和WY195）调控GUS基因的表达量,均明显高于35S。其中WY195调控GUS基因的表达量最高,约为35S的17.54倍;WY7约为35S的11.72倍;WY51约为35S的8.38倍;WY193约为35S的8.34倍。利用橡胶树白粉菌内源强启动子WY7、WY51、WY193和WY195驱动GUS基因在双子叶植物烟草、橡胶和火龙果,以及单子叶植物水稻、玉米和大麦中进行瞬时表达,探索其调控转录范围。结果证明这4个强启动子既可以在单子叶植物中驱动外源基因高效表达,也可以在双子叶植物中驱动外源基因高效表达,具有极大的开发潜力。利用生物信息学在线软件Plant CARE对这4个强启动子的序列进行了顺式作用元件的预测和分析,根据顺式作用元件的类型和作用推测启动子的诱导类型,并通过对该4个启动子转基因烟草T1代实施相应诱导,初步确定了WY7为高温诱导启动子,WY51为低温诱导启动子,WY195是高温干旱盐诱导启动子。WY193的启动子诱导类型尚未确定。利用ATMT法获得了WY195-hpa Xm转基因烟草植株。接种TMV于T1代转基因植株,结果表明,与野生型三生烟和阳性对照35S-hpa Xm转基因烟草相比,WY195-hpa Xm转基因烟草植株的TMV抗性明显提高。WY195-hpa Xm转基因T1代植株与野生型烟草相比平均病斑数减少66.44%,与阳性对照相比平均病斑数减少52.48%。通过在线数据库PROMO和JASPAR数据库进行转录因子及其结合位点的预测和分析,以此为依据确定突变位点,利用渐变缺失突变对WY195的全长序列研究,瞬时表达量的测定结果初步鉴定了WY195的全长序列,这为后续工作中对启动子精确调控能力、进行有效改造及相关转录因子的研究奠定了基础。内源启动子的成功预测、筛选和鉴定,有利于理解橡胶树白粉菌的转录机制,也为构建其遗传转化体系提供了参考,更为植物转基因工程提供了新的工具和选择。
李臻[5]（2017）在《深海来源嗜压、超嗜热古菌Pyrococcus yayanosii基因组岛PYG1的特征及生理功能研究》文中提出深海热液喷口是一个具有陡峭的温度梯度、高静水压和黑暗的极端环境。在此环境中,以微生物的化能合成为基础孕育了独特的生态系统。异养型热球菌目Thermococcales是深海热液生态系统中的优势古菌类群,Pyrococcus yayanosii CH1是此类超嗜热古菌中具有严格嗜压特性的可培养菌株。本文围绕P.yayanosii基因组中整合性基因组岛与其超高温、高静水压适应性的关系展开研究,取得了以下研究结果:1.基因组岛功能预测:通过生物信息学分析发现,在P.yayanosii基因组中预测了15个基因组岛,其中最大的基因组岛PYG1长度约为21.4 kb。推测PYG1可分为5个功能模块,相关基因注释分别是:模块I中的整合酶;模块II中的IV型限制-修饰酶;模块III中参与蛋白质翻译后修饰、氨基酸或核苷酸代谢的酶;模块IV中的转座酶;模块V中假定的毒素-抗毒素系统。2.基因组岛的移动性:PYG1可特异性整合在t RNAGln基因的3’末端,同时PYG1也可自发的从染色体中以很低的频率(1.2×10-8)环出。整合酶PYCH＿15110可以精确介导PYG1在t RNAGln基因中大小为43 bp的正向重复序列（DR）处发生整合和环出。基于此构建了可在P.yayanosii基因组中进行位点特异性整合的质粒p LMO033,成功的用于基因回补实验。3.基因组岛携带的IV型毒素-抗毒素系统:PYG1中毒素PYCH＿15330（Pyg T）可以抑制E.coli的生长,抗毒素PYCH＿15320（Pyg A）可以抵消毒素对细胞的影响,pyg A和pyg T构成了一个Abi E型毒素-抗毒素系统Pyg TA。毒素基因pyg T影响P.yayanosii高静水压适应,表现为高静水压下△Pyg A细胞延滞期显着延长;基因pyg A和pyg T形成了一个共转录操纵子,EMSA和DNase I footprinting实验证实在宿主细胞内抗毒素蛋白Pyg A结合在自身启动子区并阻遏调控毒素基因pyg T的转录。Pyg TA可以促进携带有古菌质粒复制蛋白的穿梭质粒在E.coli中的遗传稳定性。4.基因组岛和环境适应性的关系:敲除完整的PYG1后发现,高温胁迫（100℃）抑制突变株△PYG1生长,而高静水压胁迫（80 MPa）促进突变株△PYG1的生长。基因组岛中编码氨基转移酶的PYCH＿15260基因敲除突变株△1526在高温和高压胁迫条件下具有与△PYG1相似的生理表型。PYCH＿15260具有II型谷氨酰胺氨基转移酶的保守结构域。氨基酸利用分析表明在仅含20种氨基酸的合成培养基中突变株△1526可以大幅消耗色氨酸。次黄嘌呤、黄嘌呤和鸟嘌呤碱基以及腺嘌呤核苷酸AMP可促进突变株△1526生长,推测PYCH＿15260具有腺嘌呤磷酸核糖转移酶活性,参与嘌呤核苷酸补救合成途径。5.△1526突变菌株的定量蛋白质组研究:在80 MPa下可鉴定出来的881个蛋白中,亲本A2菌株和△1526突变菌株中存在有178个显着差异表达蛋白,其中包括80个显着上调、98个显着下调。这些显着差异表达蛋白主要富集在能量代谢及物质运输和代谢过程。推测PYCH＿15260基因缺失后造成嘌呤核苷酸补救合成途径中AMP合成受阻,同时影响嘌呤核苷酸从头合成途径,并使与这些途径相关的氨基酸代谢发生改变。本研究首次对来自深海热液喷口的嗜压、超嗜热古菌P.yayanosii中基因组岛PYG1的可移动性及其生理功能进行了研究。PYG1的模块化结构暗示其形成可能经历了多次水平基因转移事件。确认了PYG1中的整合酶可以介导该基因组岛的自发环出和整合,构建的基于该整合酶的位点特异性整合载体丰富了此类超嗜热古菌的遗传操作工具。证实PYG1携带的IV型毒素-抗毒素（TA）系统中两个编码基因构成了一个共转录的操纵子,抗毒素与操纵子的启动子区域存在相互作用。通过遗传分析发现PYG1及其携带的氨基酸转移酶基因对P.yayanosii在高温、高静水压下的生物量有影响。这些结果为研究此类嗜压、超嗜热古菌的环境适应性机制提供了新的线索。
卢楠[6]（2017）在《转AhDREB1基因杂种毛白杨盐胁迫响应与生物安全性研究》文中进行了进一步梳理培育杨树耐盐新品种对于加强我国盐碱地的综合开发与利用,以及满足我国对杨树用材的需求具有重要意义。利用基因工程技术进行育种,能够克服传统育种方法周期较长、针对性不强的缺点。已有研究表明,异源转化AhDREB1转录因子在一定程度上可提高杨树的耐盐能力,但外源基因是否会造成非预期效应及转基因植株是否具备田间的长期稳定性和安全性尚不确定,能否进一步提高AhDREB1转基因毛白杨的耐盐能力也有待深入研究。为此,本研究以AhDREB1转基因毛白杨组培苗、大田种植苗为材料,通过盆栽盐胁迫试验分析转基因植株和非转基因植株在不同程度盐胁迫下的生理生化指标,并筛选出在非盐胁迫和盐胁迫下的转基因毛白杨和非转基因对照的差异表达基因,分析这些差异基因可能对受体植株的影响以及受外源基因调控的耐盐基因的功能,研究AhDREB1的耐盐机理;为了进一步提高受体植株的耐盐能力,以84K杨为受体植株,在AhDREB1转录因子的基础上,克隆了柽柳TaMnSOD、TaLea、拟南芥AtNHX3个不同耐盐途径的功能基因,构建多基因共表达载体,进行遗传转化;对比分析田间种植10年的AhDREB1转基因毛白杨的外源基因存在情况、表达量及转录组表达差异,评价AhDREB1转基因毛白杨的田间稳定性,同时,通过土壤微生物多样性、花粉可育性、化感作用等的检测,综合评估了AhDREB1转基因毛白杨的安全性。研究旨为杨树耐盐转基因育种提供重要参考,主要研究结果如下:（1）对在盐胁迫下和非盐胁迫下的AhDREB1转基因毛白杨和非转基因对照植株进行了盐胁迫试验和生理生化指标的检测,并且进行了转录组分析。AhDREB1异源转化杂种毛白杨显着的提高了受体植株的耐盐能力,增加了转基因植株在盐胁迫下的POD和SOD的活性以及脯氨酸的含量,同时,减轻了盐胁迫对植株的生长、光合作用等方面的抑制,降低了植物细胞受到的损伤;AhDREB1转录因子可能是通过调控部分耐盐胁迫的转录因子及抗盐胁迫基因增强转基因植株的耐盐能力,在上调的基因中共筛选出51个和胁迫相关的基因,其中包括转录因子10个,相关功能基因41个,包括:胁迫防御相关蛋白,氧化酶或氧合酶,胁迫应激蛋白等。（2）在非盐胁迫条件下,共发现转基因植株和非转基因差异基因52个,没有发现差异基因有明显的代谢通路富集,没有发现显着的非预期效应;而在胁迫条件下,对其中差异表达基因进行分析后发现,部分木质素合成的相关基因以及和发育相关的基因显着上调,外源基因可能会对受体植株的材性和生殖生长产生一定的影响。（3）通过设计特异性引物进行PCR扩增的方法,成功的从柽柳和拟南芥的cDNA中克隆出了TaMnSOD,TaLea,和AtNHX基因,并且从拟南芥的基因组中克隆出来了“胁迫响应型”启动子:拟南芥RD29a启动子,完成了由拟南芥RD29a启动子驱动的TaMnSOD,TaLea,AtNHX和AhDREB1基因的多基因共转化载体的构建并进行了银腺杨84K的遗传转化,目前获得少量卡那霉素抗性植株。（4）转基因毛白杨大田种植多年后,基因仍然稳定的存在于植株中,并且在各个器官中仍然能够表达,但是表达量有所下降。将大田苗重新组培化后与实验室保存相同时间的组培苗相比,发现外源基因的表达量有所降低,并且部分耐盐相关基因的表达量下调,对大田苗进行重新组培后,发现外源基因的表达量要显着低于保存同样时间的组培苗,并且发现33个抗逆相关基因的表达量显着下调。（5）化感作用试验和转基因植株林下土壤微生物多样性检测结果表明,AhDREB1转基因毛白杨与非转基因对照毛白杨相比并没有显着差异,说明目前转基因植株的次生代谢产物对周边的植物和微生物的影响相比于普通的三倍体毛白杨并没有显着差异;转基因毛白杨叶片中的外源基因会在叶片开始降解后的二至三个月完全降解;对转基因毛白杨林下土壤中的卡那霉素抗性微生物的基因组PCR检测结果表明,多年种植后外源基因暂未发生水平转移;对转基因毛白杨和非转基因对照毛白杨的花粉活力和杂交可育性结果表明,转基因毛白杨和非转基因对照毛白杨的花粉活力极低,与毛新杨雌株杂交没有获得种子。目前尚未没有发现潜在的危害。综上所述,本研究以AhDREB1转基因毛白杨为材料,对AhDREB1转录因子的耐盐相关机制进行了初步分析,并尝试进一步的耐盐性改良工作;对AhDREB1的非预期效应及AhDREB1转基因毛白杨的田间安全性及稳定性进行了评估,为杨树转基因育种工作提供了重要的参考。
郭萌月[7]（2015）在《大肠杆菌碳源代谢及氧化应答与自然遗传转化的相关性研究》文中提出自然遗传转化现象是细胞自发建立感受态,摄取外源DNA整合到基因组或以质粒形式存在于染色体外,从而获得新的遗传性状的过程。自然遗传转化对于细菌获得新的遗传性状、适应复杂多变的自然环境和物种进化有着重要的意义。大肠杆菌作为模式生物材料被广泛应用于基础研究和应用中,而对于其自然转化能力的研究报道较少,且大多停留在现象层面,缺乏系统的相关调控机制研究。本课题组在前期的研究中发现,大肠杆菌培养至稳定期后经过开放静置培养可以建立自然感受态,并在琼脂平板上发生质粒DNA转化。对其机理的初步研究发现,大肠杆菌与其他细菌DNA摄取相关同源基因并不参与此转化过程,而普遍压力应答因子RpoS （σs）介导了自然遗传转化。这表明大肠杆菌自然遗传转化可能采取了一种新的感受态建立和DNA摄取机制。本研究以感受态诱导和平板压力因素作为出发点,探究了营养供给和氧化压力胁迫对自然遗传转化的作用,并对其机制做了深入研究。1.丰富营养条件有利于自然遗传转化进行。额外添加碳源可通过抑制cAMP-CRP,进而解抑制rpoS促进自然遗传转化。通过比较不同营养条件下转化频率发现,丰富营养条件比寡营养条件更利于大肠杆菌感受态的建立。在丰富培养基中额外添加0.2%可利用碳源（葡萄糖,果糖,海藻糖,甘露糖,甘露醇,N-乙酰葡萄糖胺,半乳糖,岩藻糖,麦芽糖,甘油,N-乙酰神经氨酸）,转化频率提高了2.6倍至15.3倍,而额外添加氮源则无明显影响。通过比较不同时期添加碳源对转化的影响,确定了碳源作用时期为液体振荡培养阶段而非平板转化阶段。通过比较磷酸转移酶系统（PTS）相关基因缺失菌株自然遗传转化频率发现,其转化频率与野生型菌株相比有所提高。另外,在添加碳源的同时添加cAMP,自然遗传转化频率即可回复到对照水平。由于碳源代谢与PTS活性及胞内cAMP含量有着密切关系,因此碳源对转化的促进作用可能是转运和代谢过程中通过影响PTS活性,造成胞内cAMP含量下降导致的。通过研究crp和cyaA缺失菌株自然转化频率发现,两者均比野生型提高了近1个数量级,这表明转录调控子cAMP-CRP对自然遗传转化有显着抑制作用。因此,碳源对自然转化的促进作用是通过抑制cAMP-CRP实现的。cAMP-CRP对rpoS的调控作用存在争议,为了探究cAMP-CRP对自然遗传转化的作用是否与rpoS相关,本研究对其调控方式做了初步研究。首先,检测crp和cyaA缺失菌株中rpoS启动子活性和蛋白含量,结果证实cAMP-CRP对rpoS的调控具有双向性,即cAMP-CRP在对数早期对rpoS起负调控作用,对数中后期及稳定期起正调控作用。其次,对rpoS启动子附近的两个预测CRP位点进行突变,检测启动子活性和蛋白含量的变化,结果表明两个位点对rpoS的表达均为正调控作用,这暗示了cAMP-CRP在对数前期对rpoS的抑制作用是间接的。通过检测双敲除菌株ΔcrpΔrpoS和ΔcyaAΔrpoS自然遗传转化频率发现,敲除rpoS基因后crp和cyaA突变株对转化的促进作用消失,这表明rpoS在自然转化中起关键作用,crp和cyaA突变株对转化的促进作用是通过对数早期解抑制rpoS实现的。另外,研究发现在rpoS突变株中添加碳源,自然转化频率并没有显着影响。检测碳源对RpoS蛋白含量的影响,结果发现在添加各种碳源后,对数早期RpoS的含量均有明显提高,随后其含量相较于空白对照组又有所降低,这与cAMP-CRP对rpoS的双向性调控相一致。以上结果说明rpoS在对数早期的积累是碳源促进自然转化的重要原因。综合以上结论证实,碳源可以通过降低cAMP-CRP,进而在对数早期解抑制rpoS促进感受态的建立和自然遗传转化。2.氧化压力对自然遗传转化具有促进作用。活性氧分子协同胞内游离铁离子共同参与了对自然转化的促进作用。本研究对rpoS上下游相关基因、固体平板胁迫应答相关基因和其他相关基因进行了筛选。结果发现,氧化压力应答相关基因缺失导致自然遗传转化频率提高。其中,过氧化氢应答调控基因oxyR及其调控的过氧化氢酶Ⅰ基因katG缺失导致自然转化频率分别提高了6.6倍和3.6倍,rpoS调控的过氧化氢酶Ⅱ基因katE的缺失菌株也显示出高于野生型的自然转化频率。而超氧化物应答调控基因soxRS及其调控的超氧化物歧化酶基因sodA、sodB缺失则对转化没有明显影响。另外,在液体培养时期添加过氧化氢和超氧化物诱导剂,自然遗传转化频率提高了1个数量级左右,这说明活性氧分子特别是过氧化氢引起的胞内氧化压力对自然遗传转化有促进作用。进一步研究发现,在过氧化氢和超氧化物诱导之前添加铁离子螯合剂降低胞内游离铁离子,可以降低活性氧分子对转化的促进作用,说明活性氧分子和铁离子协同参与了对转化的促进作用。而活性氧分子与亚铁离子发生芬顿反应产生羟基自由基造成DNA损伤,可能是氧化压力诱导转化发生的原因。据报道,oxyR和soxRs基因参与了细胞从液体环境转移到平板的过程中受到的氧化压力胁迫应答。平板上添加过氧化氢酶可以回补oxyR突变株在平板上的生存缺陷现象,也证实了过氧化氢清除系统对于细胞对固体平板胁迫应答的重要性。然而在平板上添加过氧化氢或过氧化氢酶对自然遗传转化没有显着影响,这暗示了早期细胞产生的内源氧压力是诱导转化的主要原因。因此细胞内源氧和平板外源氧压力可能同时参与了对转化的促进过程。综上所述,本研究通过对感受态诱导和平板转化因素的研究,发现丰富营养条件和氧化压力对大肠杆菌自然遗传转化具有促进作用,并揭示了其相关作用机制。这对于深入了解营养状态和固相基质等环境因素与细菌自然遗传转化的关系有重要意义。碳源通过抑制cAMP-CRP对自然转化的促进作用机制与已报道的其它细菌转化机制不同,且氧化压力对自然转化的影响在其他菌种中未见报道,这暗示了大肠杆菌自然遗传转化采取了一种新的机制。综合目前得到的结论和线索推断,大肠杆菌自然遗传转化受到多种因素的共同调控。研究其调控机理有助于丰富人们对水平基因转移和物种进化的认识,为细菌耐药性和毒力基因的传播提供理论依据,为工程菌的生物安全性提供了指导。
晋婷婷[8]（2013）在《枯草芽胞杆菌的细胞间遗传重组现象及芽胞杆菌中的缺陷性原噬菌体》文中研究说明自然转化、接合和转导是目前已知的三种经典的细菌基因水平转移途径,可以通过对供受体细胞间直接接触的依赖性以及DNase敏感性验证来对这三种过程进行区分。而在这三种细菌水平基因转移方式中,只有自然转化被认为是名副其实的细菌基因转移过程,它的进行涉及到细菌染色体上数十个基因的功能,而接合和转导则分别只与质粒和噬菌体相关。说明在微生物进化的历程中,转化很可能扮演着重要的角色。从研究历史看,自然转化长期以来一直主要被用作对细菌进行遗传分析和基因重组的实验手段。由于DNA易于人工提取,因此在传统上对转化的研究历来都是以受体为主体,很少考虑DNA的来源及给体细胞的作用。但在自然界中,胞外游离的DNA片段是有限的,受体细胞花费巨大的基因资源建立的复杂体系如果只是为了吸收细胞周围随机存在的游离DNA是难以令人想象的。对细菌自然转化过程而言,势必还存在其他形式的供体DNA来源。因此,对细菌在生长阶段向胞外“主动”释放DNA现象及DNA给体细胞功能的研究被认为是彻底揭示自然遗传转化过程生物学意义的关键。本实验室早期对枯草芽胞杆菌的研究发现,该菌可在不添加外源DNA的情况进行细胞间遗传重组,该过程对DNase敏感,因此曾被认为是自然转化的一种形式。本文在前期工作的基础上,对B. subtilis细胞间的该遗传重组过程进行了进一步深入分析。研究结果显示,B. subtilis细胞间遗传重组过程主要通过染色体DNA片段在供受体细胞间的转移而发生,该过程在B. subtilis中具有一定的普遍性。由于该过程对DNase敏感,类似于转化,所以我们首先对转化DNA的来源进行了探索,结果发现供体菌培养液上清中含有13kb DNA片段,因而推测该DNA片段可能为细胞间遗传重组过程中的供体DNA来源。经过进一步分析发现,该DNA片段是由存在于供体菌当中的缺陷性原噬菌体PBSX的活动而产生的。许多B. subtilis菌株中都含有PBSX,在正常情况下,PBSX的编码基因整合在宿主基因组上,该噬菌体颗粒可通过对宿主菌进行丝裂霉素C （MMC）诱导而大量产生。PBSX颗粒为头尾状,其头部包裹的并非自身编码基因,而是一段来自于宿主细胞染色体上,大小为13kb的随机DNA序列。该特性类似于可以介导水平基因转移过程的基因转移因子GTA。因此我们通过PBSX的过表达以及相关基因的敲除对PBSX和B. subtilis细胞间遗传重组过程的相关性进行了研究。研究结果显示,PBSX并不介导B. subtilis细胞间的遗传重组过程。Bsubtilis细胞间遗传重组过程的正常发生依赖于供受体细胞间的直接接触,该特点和接合过程非常类似。与此同时,B. subtilis细胞间遗传重组过程的高效发生依赖于供体菌的活菌数,而且细胞间遗传重组的频率也远高于相同条件下游离DNA和受体细胞间的转化频率。因此,B. subtilis细胞间的遗传重组过程是一种介于转化与接合之间,依赖于活的供体细胞的类似于转化的过程。前期工作发现B. subtilis细胞间的遗传重组过程主要发生在固态基质表面且严重依赖于细胞密度,因此在琼脂平板上形成的重组子往往无法计数,供受体菌混合液经梯度稀释后得到的重组子数目与稀释梯度完全不成比例,因此为我们的后续研究带来了诸多不便。为了更深层次地了解B. subtilis细胞间遗传重组过程的发生机制,本研究建立了微孔滤膜上的B. subtilis细胞间遗传重组体系。在该体系中,供受体菌混合后滴加在置于固体选择平板上的微孔滤膜上,并培养一段时间,待细胞间的遗传重组过程发生后,再将滤膜上的菌苔洗下并进行梯度稀释,从而根据重组子数和受体菌数进行遗传重组频率的计算,该体系有利于更加科学的评估B. subtilis细胞间的遗传重组过程。对供受体细胞混合后在培养过程中的动态变化进行定点监测后发现,供受体菌混合液滴定至位于选择平板上的微孔滤膜上之后,大约从第10h之后,开始检测到重组子的产生,并且随着培养时间的延长,重组子的产生数量以及重组频率逐渐上升,20h之后,遗传重组频率趋于稳定。尽管缺陷性原噬菌体PBSX并不直接参与B. subtilis细胞间的遗传重组过程,但该噬菌体的存在对宿主菌遗传信息的保留依然起到了极为重要的作用。为了进一步验证缺陷性原噬菌体在B. subtilis中的普遍性,我们对中国典型培养物保藏中心保藏的39株具有不同来源的B. subtilis菌株进行了缺陷性原噬菌体普遍性调查。研究结果显示,60%以上的调查菌株都含有类似于PBSX的缺陷性原噬菌体,而工业菌株和自然界中分离到的野生株所携带的缺陷性原噬菌体具有丰富的多样性。在缺陷性原噬菌体普查过程中,我们意外地从一株短小芽胞杆菌（B.pumilus） AB94180中诱导出了一株只包裹了8kb DNA片段的缺陷性原噬菌体PBP180并对其进行了一系列特性分析。结果表明,PBP180在形态上类似于PBSX, SDS-PAGE分离到的结构蛋白带型类似但有别于PBSX,在敏感菌攻击范围上,PBP180和PBSX间存在较大差异。此外,对PBP180、PBSX编码基因以及另外两株B. pumilus （AB94044和SAFR-032）菌株中所携带的PBSX类原噬菌体编码基因进行比较分析后发现,这四株噬菌体的调控基因和大部分结构蛋白非常保守,而负责敏感菌识别和攻击的尾部蛋白在基因排布和同源性上都存在较大差异。综上所述,对B. subtilis细胞间遗传重组过程的特性研究,显示了DNA给体细胞在水平基因转移过程中扮演着以往为人们所忽视的重要作用,对该过程机理的揭示将有助于更深层次地理解水平基因转移过程的生物学意义。此外,Bpumilus AB94180中缺陷性原噬菌体PBP180的特性研究为该类噬菌体的进化研究和存在意义提供了更多的理论依据和实验证据。
张研[9]（2013）在《RpoS在大肠杆菌自然遗传转化中的功能研究》文中研究说明大肠杆菌人工转化是分子生物学研究中的常规操作,但大肠杆菌自然遗传转化,是近年新发现的一种细菌转化模式,包括自然感受态的建立、外源DNA摄取以及外源基因表达等步骤。它的发现打破了传统上认为大肠杆菌不具备在自然状态下建立感受态并摄取外源DNA能力的观点,在遗传学上具有相当重要的意义。同时,作为基因工程最常用的实验材料之一,大肠杆菌通过自然遗传转化发生基因转移会严重影响其生物安全性。因此,研究大肠杆菌自然遗传转化的调控机理对于深入了解细菌遗传转化机理及评估大肠杆菌的生物安全性具有重要的理论及应用意义。普遍压力应答因子σs,又称RpoS,是一种可激活大量RpoS依赖基因转录的选择性σ因子,它在压力环境下可以一定程度上替代管家6因子RpoD （σ70）启动特定压力抗逆基因的表达,使细菌应对不利环境。RpoS蛋白自身的表达具有“在快速生长的对数期很低,面对压力环境迅速升高”的特点。同时RpoS也被报道可能参与了大肠杆菌自然遗传转化调控过程。本研究采用了开放系统下的大肠杆菌自然遗传转化体系,研究了RpoS在大肠杆菌自然遗传转化中的功能。要研究RpoS在大肠杆菌自然遗传转化中的作用首先需要进一步确定RpoS在大肠杆菌自然遗传转化中是否发挥功能。本研究采用基因缺失及回补的方法,比较发现,在RpoS缺失的情况下,大肠杆菌自然遗传转化频率下降至野生型的10%以下,回补RpoS后转化频率得到恢复；通过比较RpoS缺陷株在不同筛选条件下的成活率可以发现,RpoS缺失不影响转化子的生存能力。因此,RpoS在大肠杆菌自然遗传转化中发挥作用。那么,RpoS是否参与大肠杆菌其他遗传转化过程?通过比较研究发现,RpoS缺失,大肠杆菌人工转化能力没有明显变化,此结果表明,RpoS对转化的作用为大肠杆菌自然遗传转化独有。因此,RpoS对大肠杆菌自然遗传转化确实存在影响,研究RpoS参与大肠杆菌自然遗传转化调控机理探究有助于对细菌转化机制的认识。大肠杆菌自然遗传转化的过程包括：液体振荡培养和静置培养建立感受态以及固体培养完成DNA摄取两个阶段,明确RpoS在哪一个环节发挥功能,有助于了解其对自然遗传转化的调控机理。发生在固相基质表面（培养平板）的DNA摄取过程是开放系统下的大肠杆菌自然遗传转化的特点之一。首先,通过DNA酶实验中断外源DNA供给的方法检测了自然遗传转化中DNA摄取发生的具体时间,结果表明,大肠杆菌细胞接触固相基质表面的瞬间即可完成DNA摄取,而且RpoS缺失不影响DNA摄取时期。随后,为检测在固相基质表面RpoS的转录水平,采用了PrpoS融合lacZ标记PrpoS的方法,结果示PrpoS活性在感受态细胞与固相基质接触瞬间并未明显上调;采用Western Blotting测量蛋白质水平的变化,发现RpoS在感受态与固相基质接触瞬间非但没有上升还有所下降。最后,通过诱导表达改变胞内RpoS含量发现RpoS表达量的高低不能显着影响转化频率。综合上述结果可以得出,RpoS是大肠杆菌发生高水平自然转化的必要因素,依旧不是充分条件；大肠杆菌完成自然遗传转化过程,需含有RpoS的的细胞与固相基质的接触,但RpoS的调控作用对固体培养以及DNA摄取过程无明显影响。‘开放系统”大肠杆菌自然遗传转化不同于其他细菌自然转化的另一个特征是“自然感受态的建立经过了液体振荡培养和开放静置培养两个培养阶段”。本研究通过诱导表达调节胞内RpoS含量分别检测了不同培养时期诱导RpoS表达对自然转化能力的影响。结果显示,振荡培养期诱导RpoS表达能使转化频率上升约70%,静置培养期诱导RpoS表达可使转化频率上升约20%,而在两个培养时期均诱导RpoS表达使转化频率上升了140%,由此可见,通过诱导表达RpoS可以显着提高大肠杆菌自然遗传转化能力,胞内RpoS的含量可能与大肠杆菌自然遗传转化能力高低有关。而且,振荡培养期诱导作用明显表明大肠杆菌自然遗传感受态建立在振荡培养期。经过一步比较分析发现,在振荡培养对数前期诱导RpoS表达对自然遗传转化影响显着,对数中后期至稳定期诱导RpoS表达对于转化的影响不显着,结果显示,在振荡培养过程中对数前期细胞内RpoS含量决定转化能力的强弱。在静置培养过程中,通过对比不同胞内RpoS含量的大肠杆菌的转化频率变化规律发现,静置培养可以在一定程度上提升转化能力,该提升过程需要时间的积累（约8h完成）,而在该培养阶段提高胞内RpoS的水平,可缩短积累所耗的时间（约4～6h即可完成）,结合转化频率总体上升20%的结果,证明了静置培养阶段的胞内RpoS表达量对自然转化具有促进作用,但并不起决定作用。综上所述,胞内RpoS的含量对于大肠杆菌自然遗传感受态的建立很重要；对数前期的RpoS含量决定自然转化频率的高低；静置培养期的RpoS含量对转化能力具有促进作用。核苷酸及其衍生物可作为营养物质被处于营养饥饿的大肠杆菌细胞所吸收,有报道单核苷酸参与流感嗜血杆菌等细菌自然转化的调控。那么,大肠杆菌自然遗传转化过程是否受到单核苷酸的影响呢?单磷酸腺苷（AMP）在流感嗜血杆菌的自然转化中,通过抑制一些转化基因的转录而抑制遗传转化的发生,但在大肠杆菌的遗传转化中,是否也有类似的作用未见报道。鉴于人工转化的机制研究较为系统,本工作首先研究了AMP对大肠杆菌人工转化的作用。本研究比较研究了外源单核苷酸衍生物对大肠杆菌人工转化能力的影响,结果显示,外源AMP可能通过能量流动改变了胞内的能量状态,从而抑制了人工转化的发生。而在大肠杆菌的自然遗传转化中,外源AMP却有促进作用,是否也是通过能量流动引起的改变有待进一步验证。综上所述,本研究工作借助分子生物学和遗传学的手段,揭示了普遍压力应答因子RpoS与大肠杆菌自然遗传转化能力相关性,并对参与大肠杆菌自然转化的AMP等因素进行了探讨,为更好的理解大肠杆菌自然遗传转化的调控机理以及RpoS在大肠杆菌中的功能提供了实验依据；另外,对单核苷酸AMP在大肠杆菌自然遗传转化中作用的研究,为进一步认识大肠杆菌自然转化的调控机理提供了依据。本工作为探讨细菌自然遗传转化的普遍规律提供了新的线索。
崔翠菊[10]（2010）在《叶绿体基因工程与植物细胞器基因组进化研究》文中进行了进一步梳理植物细胞中,除了细胞核中具有遗传物质DNA之外,叶绿体和线粒体也拥有半自主性的能自我复制和遗传的基因组。随着基因组测序技术的发展,越来越多的植物核基因组、叶绿体基因组和线粒体基因组相继完成了测序。研究发现叶绿体基因组和线粒体基因组结构和序列信息在揭示物种起源、进化演变及其不同物种之间的亲缘关系等方面具有重要价值;与此同时,比核转化具有明显优势的叶绿体转化技术在遗传改良、生物制剂的生产等方面显示出巨大潜力,使得叶绿体基因工程成为植物基因工程中发展的新领域。叶绿体基因组结构和序列分析则是叶绿体基因工程的基础,而叶绿体基因工程研究又为细胞器与核基因组之间的基因转移、基因表达的协调作用机制等研究提供实践证明,对研究植物的进化起源有重要的意义。叶绿体基因工程技术也随着叶绿体测序的完成逐渐成为转基因定点整合、多拷贝高效表达外源基因,培育优良性状农作物品种和作为生物反应器合成目的蛋白的热门选择。本研究以小麦叶绿体基因组中的atpB和rbcL作为同源重组片段,用nptII和gfp分别作为筛选基因和标记基因,构建小麦叶绿体定点整合表达载体,用基因枪轰击法分别转化小麦的幼胚盾片和幼穗段。对T0代再生植株进行分子生物学验证,PCR和Southern blot结果证实标记基因gfp已经成功整合到叶绿体基因组中,并得到了同质化的再生植株。用T1代植株的叶片检测到GFP绿色荧光在叶绿体中表达,证明已经成功建立了小麦叶绿体稳定遗传转化体系。应用植物细胞作为生物反应器生产药用蛋白或疫苗等也成为现今研究的热点,本研究用农杆菌浸染烟草叶片的方法将人干扰素α-2b基因转入烟草核基因组,在再生烟草植株的叶片蛋白中检测到具有活性的人干扰素α-2b蛋白;构建了烟草叶绿体定点整合载体,为以烟草叶绿体表达人干扰素α-2b蛋白做好了前期准备。本文全面统计分析研究了已完成测序的藻类,苔藓,蕨类,裸子,被子植物的各物种的核基因组和细胞器基因组的相关信息。分别比较了不同物种的基因组大小,基因编码区和非编码区的大小变化趋势。在174种叶绿体基因组已测序的物种中,有26种核基因组也完成了测序,分别比对各物种的叶绿体基因组和它的核基因组,结果发现随着物种越来越高等,其叶绿体基因在核基因组中的同源性也越来越高,有5种被子植物的同源性高达100%。对15种线粒体基因组和核基因组都已测序的物种进行同样的全序列比对,也发现了随物种进化逐渐增高的趋势,但与叶绿体相比,不是太明显,最高的同源比例仅为82.6%。本文还对藻类、双子叶植物和单子叶植物的叶绿体的保守基因进行了统计。将单子叶植物保守基因中没有的藻类的保守基因分别与拟南芥和水稻的核基因组比对分析,其中绝大多数遗传系统基因都成功转移,而光合系统和生物合成系统则都丢失了相当一部分基因。还对拟南芥和水稻的叶绿体基因和线粒体基因在核基因组中的同源比例和拷贝数进行了统计。综合分析这些序列的信息后,我们提出以下假设,在植物进化过程中,细胞器基因到核基因组的转移,大致经过了先以拷贝的形式转移到核基因组的非编码区,而后获得表达功能,细胞器中相应基因的消失进而使细胞中的遗传物质逐步转移到核基因组中,最终实现核基因组对植物遗传物质表达的总体调控功能。
二、细菌遗传转化与水平基因转移（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细菌遗传转化与水平基因转移（论文提纲范文）
（1）长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的图位克隆及功能解析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 小麦赤霉病的生物学特征及其防治 |
| 1.1.1 小麦赤霉病发生、流行及危害 |
| 1.1.1.1 小麦赤霉病的病原菌 |
| 1.1.1.2 小麦赤霉病的病害循环及发病特征 |
| 1.1.1.3 小麦赤霉病病原菌的侵染模式 |
| 1.1.1.4 小麦赤霉病发病区域及危害 |
| 1.1.2 小麦赤霉病的防治 |
| 1.1.2.1 化学防治 |
| 1.1.2.2 生物防治 |
| 1.1.2.3 小麦赤霉病综合绿色防控 |
| 1.2 小麦赤霉毒素研究 |
| 1.2.1 小麦中常见镰孢菌毒素及毒性分析 |
| 1.2.2 单端孢霉烯族毒素的生物合成途径研究进展 |
| 1.2.3 单端孢霉烯族毒素的治理方法 |
| 1.2.3.1 物理脱毒 |
| 1.2.3.2 化学脱毒 |
| 1.2.3.3 生物脱毒 |
| 1.2.4 单端孢霉烯族毒素检测方法 |
| 1.3 小麦抗赤霉病遗传研究进展 |
| 1.3.1 小麦赤霉病抗性种质挖掘 |
| 1.3.1.1 我国小麦品种抗赤霉病鉴定 |
| 1.3.1.2 小麦近缘种的赤霉病抗源鉴定 |
| 1.3.1.3 偃麦草在小麦抗赤霉病育种中的作用 |
| 1.3.2 小麦抗赤霉病QTL定位研究现状 |
| 1.3.3 小麦赤霉病抗性机制研究 |
| 1.4 小麦基因图位克隆技术 |
| 1.4.1 图位克隆技术在小麦中的应用 |
| 1.4.2 作图群体的构建 |
| 1.4.3 DNA分子标记类型 |
| 1.4.4 物理图谱的构建 |
| 1.4.5 候选基因的功能验证 |
| 1.5 水平基因转移研究现状 |
| 1.6 本研究的目的意义 |
| 1.7 本研究的主要内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株和载体 |
| 2.2 实验地点 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 植物材料的种植与处理 |
| 2.3.2 高通量植物基因组DNA提取 |
| 2.3.2.1 基因组DNA提取相关试剂 |
| 2.3.2.2 提取DNA操作步骤 |
| 2.3.3 植物总RNA提取 |
| 2.3.3.1 相关试剂配置与耗材处理 |
| 2.3.3.2 操作步骤 |
| 2.3.4 反转录及实时荧光定量PCR |
| 2.3.4.1 反转录 |
| 2.3.4.2 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) |
| 2.3.5 聚合酶链式反应(PCR) |
| 2.3.5.1 扩增体系 |
| 2.3.5.2 PCR反应程序 |
| 2.3.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 2.3.6.1 相关试剂及配置方法 |
| 2.3.6.2 聚丙烯酰胺凝胶制备及电泳 |
| 2.3.7 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.3.7.1 相关试剂 |
| 2.3.7.2 操作流程 |
| 2.3.8 DNA目的片段纯化回收 |
| 2.3.9 TA连接 |
| 2.3.10 大肠杆菌转化 |
| 2.3.11 质粒提取 |
| 2.3.12 农杆菌感受态的制备 |
| 2.3.13 农杆菌转化 |
| 2.3.14 T4 连接及同源重组 |
| 2.3.15 LR反应 |
| 2.3.16 小麦族基因组进化分析 |
| 2.3.16.1 小麦族二倍体物种的转录组测序与组装 |
| 2.3.16.2 基因家族及同源基因分析 |
| 2.3.17 目标基因的精细定位 |
| 2.3.17.1 定位群体的构建 |
| 2.3.17.2 分子标记的开发 |
| 2.3.17.3 物理图谱的构建 |
| 2.3.18 转录组数据分析基因表达 |
| 2.3.19 突变群体构建及突变体筛选 |
| 2.3.19.1 突变群体构建 |
| 2.3.19.2 突变体的筛选 |
| 2.3.20 BSMV-VIGS技术的应用 |
| 2.3.21 小麦遗传转化 |
| 2.3.22 镰孢菌培养及赤霉病抗性鉴定 |
| 2.3.22.1 相关试剂及培养基配方 |
| 2.3.22.2 穗部接种实验流程 |
| 2.3.22.3 离体叶片鉴定实验 |
| 2.3.22.4 苗期茎基腐抗性鉴定 |
| 2.3.23 真核表达 |
| 2.3.23.1 相关试剂及培养基 |
| 2.3.23.2 真核表达质粒p PICZαA-Fhb7的构建 |
| 2.3.23.3 感受态制备 |
| 2.3.23.4 毕赤酵母转化 |
| 2.3.23.5 酵母诱导表达Fhb7与DON毒素处理 |
| 2.3.24 液相-高分辨率质谱分析 |
| 2.3.24.1 样品预处理 |
| 2.3.24.2 上机及分析流程 |
| 2.3.25 基因Fhb7的进化分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 二倍体长穗偃麦草基因组比较基因组学分析 |
| 3.2 抗赤霉病基因Fhb7精细定位及候选基因筛选 |
| 3.2.1 目标区段重组体的筛选 |
| 3.2.2 目标区段分子标记开发 |
| 3.2.3 候选基因筛选 |
| 3.3 突变体群体构建及突变体筛选 |
| 3.4 候选基因的BSMV-VIGS功能验证 |
| 3.5 候选基因转基因小麦功能验证 |
| 3.6 抗小麦赤霉病基因Fhb7的进化分析 |
| 3.7 Fhb7抗病机制研究 |
| 3.7.1 Fhb7基因的响应表达模式 |
| 3.7.2 DON毒素外源处理及LC-HRMS分析 |
| 3.7.3 液相色谱高分辨率质谱分析 |
| 3.7.4 Fhb7基因对单端孢霉烯族毒素的解毒机制研究 |
| 3.7.5 Fhb7基因对镰孢菌属抗性研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 小麦近缘物种抗病基因的克隆 |
| 4.2 Fhb7去环氧化介导单端孢霉烯族毒素脱毒 |
| 4.3 水平基因转移在植物进化中的作用 |
| 4.4 小麦近缘植物的育种应用潜力 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）谷子基因编辑体系的建立及香味基因SiBADH2突变体的获得（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 谷子简介 |
| 1.2 农杆菌介导的谷子遗传转化研究进展 |
| 1.2.1 利用谷子不同的外植体进行再生 |
| 1.2.2 多种因素对谷子再生的影响 |
| 1.2.3 谷子农杆菌转化法的研究进展 |
| 1.3 基因编辑技术的发展及应用 |
| 1.3.1 巨核酶 |
| 1.3.2 锌指核酸酶 |
| 1.3.3 转录激活因子样效应物核酸酶 |
| 1.3.4 CRISPR/Cas9系统 |
| 1.4 BADH基因在植物中的重要多功能作用 |
| 1.4.1 BADH作为一种不含抗生素的转化子选择标记 |
| 1.4.2 非生物胁迫中的BADH |
| 1.4.3 植物香气中的BADH2 |
| 1.5 本课题的研究的目的与意义 |
| 第二章 农杆菌介导的谷子遗传转化 |
| 2.1 实验材料、仪器与试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 主要实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 农杆菌介导谷子的遗传转化方法 |
| 2.2.2 谷子灭菌时间的梯度实验 |
| 2.2.3 基础培养基的选择 |
| 2.2.4 CuSO_4与ZnSO_4 的添加 |
| 2.2.5 脯氨酸的添加 |
| 2.2.6 硝酸银的添加 |
| 2.2.7 2,4-D含量的确定 |
| 2.2.8 KT的添加含量 |
| 2.2.9 选择培养基中Hyg的含量的确定 |
| 2.2.10 分化培养基中激素的选择 |
| 2.2.11 农杆菌浓度的确定 |
| 2.2.12 农杆菌液浸泡侵染愈伤时间的确定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 最佳灭菌时间改变发芽率与染菌率 |
| 2.3.2 适当的基础培养基提高愈伤质量 |
| 2.3.3 CuSO_4与ZnSO_4提高愈伤数量与质量 |
| 2.3.4 脯氨酸的负作用 |
| 2.3.5 硝酸银对愈伤无影响 |
| 2.3.6 2,4-D最优浓度提高愈伤诱导率 |
| 2.3.7 KT降低胚性愈伤诱导率 |
| 2.3.8 40 mg/LHyg用于选择培养基 |
| 2.3.9 2,4-D与KT诱导谷子分化 |
| 2.3.10 农杆菌的OD_(600)值 |
| 2.3.11 浸染愈伤最佳时间 |
| 2.3.12 谷子基本培养基的确定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 植物表达载体的构建与转化 |
| 3.1 实验材料、仪器与试剂 |
| 3.1.1 菌株和质粒载体 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 主要实验试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 SiBADH2敲除载体的构建 |
| 3.2.2 琼脂糖凝胶电泳 |
| 3.2.3 琼脂糖凝胶DNA回收 |
| 3.2.4 大肠杆菌的转化 |
| 3.2.5 菌落PCR |
| 3.2.6 质粒的提取 |
| 3.2.7 农杆菌感受态的制备 |
| 3.2.8 表达载体转化农杆菌 |
| 3.2.9 农杆菌介导谷子的遗传转化方法 |
| 3.2.10 谷子基因组总DNA的提取(CTAB法) |
| 3.2.11 转基因阳性植株检测 |
| 3.2.12 T_1代植株纯合转基因植株检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Ci846 野生型植株的BADH2 基因检测 |
| 3.3.2 靶点引物的设计 |
| 3.3.3 pJG310 载体与p JG338 载体的构建 |
| 3.3.4 阳性菌落检测 |
| 3.3.5 pRLG103-BADH2 载体的检测 |
| 3.3.6 农杆菌介导Ci846成熟胚的遗传转化 |
| 3.3.7 再生植株的PCR鉴定结果 |
| 3.3.8 T_0代转基因植株的靶位点突变分析 |
| 3.3.9 T_1代转基因植株的鉴定结果 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）枯草芽胞杆菌质粒遗传转化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.1 枯草芽胞杆菌简介 |
| 1.2 枯草芽胞杆菌的应用 |
| 1.2.1 枯草芽胞杆菌在农业中的应用 |
| 1.2.2 枯草芽胞杆菌作为益生菌 |
| 1.2.3 枯草芽胞杆菌作为蛋白异源表达宿主 |
| 1.2.4 枯草芽胞杆菌在污水处理方面的作用 |
| 1.3 枯草芽胞杆菌的水平基因转移及质粒转化 |
| 1.3.1 细菌的水平基因转移现象简介 |
| 1.3.2 细菌的水平基因转移及其机制阐述 |
| 接合(conjugation): |
| 转导(transduction): |
| 转化(transformation): |
| 1.3.3 影响枯草芽胞杆菌转化效率的因素 |
| 1.3.4 枯草芽胞杆菌的质粒转化及水平转移方法 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 引物及用途 |
| 2.1.3 实验所用仪器 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.1.5 培养基和相关溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细菌质粒提取与phi29 DNA聚合酶扩增质粒 |
| 2.2.2 提取枯草芽胞杆菌中的基因组 |
| 2.2.3 聚合酶链式扩增反应(PCR) |
| 2.2.4 酶切、回收、连接等相关操作 |
| 2.2.5 制备大肠杆菌感受态的及转化的方法 |
| 2.2.6 制备枯草芽胞杆菌二步法感受态及转化的方法 |
| 2.2.7 制备枯草芽胞杆菌的电转化感受态及电转的方法 |
| 2.2.8 构建克隆和敲除载体 |
| 2.2.9 枯草芽胞杆菌细胞间质粒水平转移实验 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 用phi29 DNA聚合酶扩增质粒的产物转化枯草芽胞杆菌 |
| 3.1.1 不同质粒与其RCA产物的二步法转化尝试 |
| 3.1.2 长度不同的质粒及其RCA产物二步法转化比较 |
| 3.1.3 质粒及其RCA产物二步法转化野生枯草芽胞杆菌 |
| 3.1.4 来源不同的phi29 DNA聚合酶扩增产物转化效果的比较 |
| 3.1.5 原始质粒及其RCA产物的电转与二步法比较 |
| 3.1.6 质粒及其RCA产物电转法转化野生枯草芽胞杆菌 |
| 3.1.7 小结与讨论 |
| 3.2 枯草芽胞杆菌细胞间质粒水平转移的研究 |
| 3.2.1 探究不同质粒的最佳转化抗性压力 |
| 3.2.2 探究同一个质粒框架、不同的转化压力对转化效果的影响 |
| 3.2.3 探究供体中目的质粒大小对转化的影响 |
| 3.2.4 探究供受体混合最佳菌体比范围 |
| 3.2.5 探究共培养不同时间下转化子数目变化趋势 |
| 3.2.6 细胞间质粒水平转移优化体系的普遍性验证 |
| 3.2.7 小结与讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 硕士研究生期间所发表论文 |
| 致谢 |
（4）橡胶树白粉菌遗传转化体系的构建及内源启动子筛选与鉴定研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 橡胶树白粉菌 |
| 1.1.1 橡胶树及天然橡胶 |
| 1.1.2 橡胶树白粉病 |
| 1.1.3 橡胶树白粉菌(Oidium heveae Steinm) |
| 1.2 丝状真菌的遗传转化 |
| 1.2.1 基因工程的选择标记 |
| 1.2.2 丝状真菌的遗传转化方法 |
| 1.2.3 专性寄生真菌的遗传转化 |
| 1.2.4 橡胶树白粉菌的遗传转化 |
| 1.3 启动子 |
| 1.3.1 启动子的概念 |
| 1.3.2 真核生物的启动子 |
| 1.3.3 组成型启动子 |
| 1.3.4 诱导型启动子 |
| 1.3.5 丝状真菌的启动子 |
| 1.3.6 启动子的克隆方法 |
| 1.3.7 启动子的研究方法及策略 |
| 1.3.8 启动子研究中存在的问题和不足 |
| 1.4 hrp基因hpa Xm |
| 1.4.1 Harpin蛋白及hrp基因 |
| 1.4.2 hpa Xm基因及Hpa Xm蛋白 |
| 1.5 本研究的目的意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 微生物材料 |
| 2.1.3 化学药品和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 1%琼脂糖平板上橡胶树白粉菌分生孢子萌发率的测定 |
| 2.2.2 抗生素的植物毒性(phytotoxicity)评估 |
| 2.2.3 确定合适的抗生素抗性基因用作筛选标记 |
| 2.2.4 重组载体的构建 |
| 2.2.5 适合橡胶树白粉菌电击转化的电击缓冲液的确定 |
| 2.2.6 O.heveae的电击转化 |
| 2.2.7 O.heveae的 ATMT |
| 2.2.8 转化子的显微分析 |
| 2.2.9 转化子的分子分析 |
| 2.2.10 橡胶树白粉菌内源启动子的预测 |
| 2.2.11 橡胶树白粉菌内源启动子的功能验证 |
| 2.2.12 橡胶树白粉菌内源启动子调控外源基因GUS瞬时表达量测定 |
| 2.2.13 橡胶树白粉菌内源启动子调控外源基因表达范围的探索 |
| 2.2.14 橡胶树白粉菌内源启动子的类型分析 |
| 2.2.15 橡胶树白粉菌内源启动子WY195 驱动hpa Xm基因在烟草中的表达 |
| 2.2.16 橡胶树白粉菌内源强启动子序列全长分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 橡胶树白粉菌分生孢子萌发最佳测定时间的确定 |
| 3.2 橡胶树白粉菌分生孢子常用抗生素敏感性测定 |
| 3.3 抗生素的植物毒性评估 |
| 3.4 确定合适的筛选抗性基因 |
| 3.5 重组载体的构建 |
| 3.6 确定合适的电击缓冲液 |
| 3.7 橡胶树白粉菌电击转化 |
| 3.8 ATMT法转化橡胶树白粉菌 |
| 3.9 转化子的荧光观察 |
| 3.10 转化子的分子分析 |
| 3.10.1 T3代转化子的PCR验证 |
| 3.10.2 Southern blot analysis |
| 3.11 橡胶树白粉菌内源启动子的预测 |
| 3.12 橡胶树白粉菌内源启动子的功能验证 |
| 3.12.1 橡胶树白粉菌内源启动子克隆及植物表达载体的构建 |
| 3.12.2 三亲杂交 |
| 3.12.3 橡胶树白粉菌内源疑似启动子驱动GUS基因在烟草叶片中的瞬时表达 |
| 3.13 橡胶树白粉菌内源强启动子调控外源基因GUS瞬时表达效率测定 |
| 3.14 橡胶树白粉菌内源强启动子调控外源基因表达的范围探索 |
| 3.14.1 橡胶树白粉菌内源启动子驱动报告基因GUS在双子叶植物中的瞬时表达 |
| 3.14.2 橡胶树白粉菌内源启动子驱动报告基因GUS在单子叶植物中的瞬时表达 |
| 3.15 橡胶树白粉菌内源强启动子的类型分析 |
| 3.15.1 转基因烟草的组培 |
| 3.15.2 T1代转基因烟草的分子检测 |
| 3.15.3 橡胶树白粉菌内源启动子的类型及序列分析 |
| 3.16 橡胶树白粉菌内源启动子WY195 驱动hpa Xm基因在烟草中的表达 |
| 3.16.1 植物表达载体构建 |
| 3.16.2 WY195 驱动hpa Xm基因在烟草中的稳定表达 |
| 3.16.3 稳定表达及分子检测 |
| 3.16.4 WY195-hpa Xm转基因烟草T1 代的TMV检测 |
| 3.17 橡胶树白粉菌内源强启动子WY195序列全长分析 |
| 3.17.1 橡胶树白粉菌内源启动子WY195序列的生物信息学分析 |
| 3.17.2 渐变缺失分析WY195启动子的有效全长 |
| 4 讨论 |
| 4.1 橡胶树白粉菌遗传转化体系的构建 |
| 4.1.1 橡胶树白粉菌遗传转化体系开发中的关键创新 |
| 4.1.2 其它技术限制 |
| 4.1.3 总结与展望 |
| 4.2 橡胶树白粉菌内源启动子的预测及功能鉴定 |
| 4.2.1 丝状真菌的内源启动子具有很大的开发潜力 |
| 4.2.2 橡胶树白粉菌内源强启动子具有很强的驱动外源基因表达能力 |
| 4.2.3 橡胶树白粉菌内源强启动子具有广泛的调控表达谱 |
| 4.2.4 后续工作及展望 |
| 5 结论 |
| 5.1 橡胶树白粉菌遗传转化的建立 |
| 5.1.1 橡胶树白粉菌抗生素敏感性评价 |
| 5.1.2 橡胶树白粉菌电击缓冲液的确定 |
| 5.1.3 橡胶树白粉菌的电击转化 |
| 5.1.4 橡胶树白粉菌的ATMT转化 |
| 5.2 橡胶树白粉菌内源启动子资源初探 |
| 5.2.1 橡胶树白粉菌内源启动子的预测 |
| 5.2.2 橡胶树白粉菌内源疑似启动子的功能验证 |
| 5.2.3 橡胶树白粉菌内源强启动子调控外源基因表达的能力测定 |
| 5.2.4 橡胶树白粉菌内源启动子调控外源基因转录范围研究 |
| 5.2.5 橡胶树白粉菌内源启动子的类型分析 |
| 5.2.6 橡胶树白粉菌内源启动子WY195 调控外源基因hpa Xm在烟草中的表达 |
| 5.2.7 橡胶树白粉菌内源启动子WY195的全长分析 |
| 6 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 博士期间科研成果 |
| 致谢 |
（5）深海来源嗜压、超嗜热古菌Pyrococcus yayanosii基因组岛PYG1的特征及生理功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 深海热液微生物环境适应性研究概况 |
| 1.1.1 深海热液生态系统 |
| 1.1.1.1 深海热液喷口的分布 |
| 1.1.1.2 深海热液微生物 |
| 1.1.2 深海热液微生物高温高静水压适应 |
| 1.1.2.1 生理性状与高温高静水压适应性 |
| 1.1.2.2 生物大分子与高温高静水压适应性 |
| 1.1.2.3 基因组层面的高温高静水压适应 |
| 1.2 超嗜热古菌整合性遗传元件研究进展 |
| 1.2.1 超嗜热古菌整合遗传元件的类型 |
| 1.2.1.1 超嗜热古菌整合性病毒 |
| 1.2.1.2 超嗜热古菌整合性质粒 |
| 1.2.1.3 基因组岛 |
| 1.2.1.4 超嗜热古菌IS与转座元件 |
| 1.2.2 超嗜热古菌整合性遗传元件的整合及维持 |
| 1.2.2.1 整合元件的整合 |
| 1.2.2.2 整合元件的维持 |
| 1.2.3 超嗜热古菌整合性遗传元件与环境适应性 |
| 1.2.4 结语 |
| 1.3 .本研究的主要内容 |
| 1.3.1 目的和意义 |
| 1.3.2 技术路线 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 引物 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.3.1 LB培养基 |
| 2.1.3.2 TRM培养基 |
| 2.1.3.3 合成培养基(TSM1和TSM2) |
| 2.1.4 主要试剂 |
| 2.1.4.1 常规试剂 |
| 2.1.4.2 古菌DNA抽提试剂 |
| 2.1.4.3 单质硫 |
| 2.1.4.41 0%Na2S溶液 |
| 2.1.4.5 多硫化物溶液 |
| 2.1.4.6 蛋白提取纯化缓冲液 |
| 2.1.4.7 SDS-PAGE电泳 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 嗜压超嗜热古菌P.yayanosii培养 |
| 2.2.1.1 培养基处理 |
| 2.2.1.2 菌株活化与保藏 |
| 2.2.1.3 P.yayanosii高温常压培养 |
| 2.2.1.4 P.yayanosii高温高静水压培养 |
| 2.2.1.5 P.yayanosii滚管培养 |
| 2.2.2 古菌P.yayanosii遗传转化 |
| 2.2.3 P.yayanosii基因突变与互补菌株构建 |
| 2.2.4 P.yayanosii DNA提取 |
| 2.2.5 P.yayanosii RNA相关操作 |
| 2.2.5.1 总RNA提取 |
| 2.2.5.2 RNA纯化与质量检测 |
| 2.2.5.3 cDNA的合成 |
| 2.2.5.4 实时荧光定量PCR |
| 2.2.6 基因组岛整合环出(频率)检测 |
| 2.2.7 P.yayanosii生理实验 |
| 2.2.7.1 显微镜细胞计数 |
| 2.2.7.2 生长曲线测定 |
| 2.2.7.3 电子透射显微镜观察细胞形态 |
| 2.2.7.4 氨基酸利用分析 |
| 2.2.7.5 不同碱基组成培养基培养 |
| 2.2.8 构建携带模拟基因组岛的重组质粒 |
| 2.2.9 整合载体的构建与验证 |
| 2.2.10 基因敲除与表达载体构建 |
| 2.2.11 E.coli转化 |
| 2.2.12 毒素-抗毒素系统功能验证 |
| 2.2.13 毒素-抗毒素系统促进质粒稳定实验 |
| 2.2.14 蛋白表达与纯化 |
| 2.2.15 Braford法测定重组蛋白浓度 |
| 2.2.16 EMSA实验 |
| 2.2.17 DNase I footprinting实验 |
| 2.2.18 一般的生物信息学分析 |
| 2.2.19 蛋白质组学研究样品制备 |
| 2.2.19.1 样品制备 |
| 2.2.19.2 古菌总蛋白提取与检测 |
| 2.2.20 蛋白组学数据分析 |
| 2.2.20.1 COG注释 |
| 2.2.20.2 GO富集分析 |
| 2.2.20.3 差异蛋白的Pathway分析 |
| 第三章 Pyrococcus yayanosii中基因组岛PYG1 的特征及其整合环出能力分析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 P.yayanosii中基因组岛的预测 |
| 3.2.2 基因组岛PYG1序列分析 |
| 3.2.2.1 PYG1中移动相关基因分析 |
| 3.2.2.2 PYG1 中假定基因簇(模块III)序列分析 |
| 3.2.2.3 PYG1中假定毒素-抗毒素系统(模块V)序列分析 |
| 3.2.3 基因组岛PYG1可以自发的从染色体中发生环出 |
| 3.2.4 整合酶PYCH_15110和att P位点在PYG1 整合和环出过程中的作用 |
| 3.2.4.1 携带模拟基因组岛重组质粒的构建 |
| 3.2.4.2 整合酶基因(PYCH_15110)缺失突变株△int的构建 |
| 3.2.4.3 模拟基因组岛Z1402可以环出并整合到染色体 |
| 3.2.4.4 模拟基因组岛Z1404和Z1405不能环出并整合到染色体 |
| 3.2.5 基因组岛PYG1整合位点特异性及应用 |
| 3.2.5.1 基因组岛PYG1整合具有位点特异性 |
| 3.2.5.2 基于基因组岛PYG1 整合酶及att P位点的整合型载体的构建及应用 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 PYG1中携带的IV型毒素-抗毒素系统的生理功能 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 P.yayanosii基因组岛PYG1 中携带一个假定TA系统 |
| 4.2.2 pyg A和 pyg T是一对共转录的操纵子 |
| 4.2.3 pyg A和 pyg T组成了一个功能性的TA系统PygTA |
| 4.2.4 毒素pyg T对 P.yayanosii高静水压适应性的影响 |
| 4.2.4.1 毒素-抗毒素系统PygTA基因突变株的构建 |
| 4.2.4.2 毒素pyg T影响P.yayanosii高静水压适应 |
| 4.2.5 抗毒素PygA特异性结合PygTA启动子区 |
| 4.2.6 PygTA系统提高带有古菌质粒复制蛋白的穿梭质粒在大肠杆菌中的稳定性 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 基因组岛PYG1 影响Pyrococcus yayanosii高温、高静水压的适应性 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 基因组岛PYG1生理性状分析 |
| 5.2.1.1 基因组岛PYG1 缺失突变株(△PYG1)的构建 |
| 5.2.1.2 △PYG1不同条件下的生理特性研究 |
| 5.2.1.3 △PYG1压力和温度耐受曲线 |
| 5.2.2 基因组岛PYG1中基因的转录水平分析 |
| 5.2.3 PYG1中III区 PYCH_15260 基因突变株的构建及生理分析 |
| 5.2.3.1 基因组岛PYCH_15260基因突变株(△1526)的构建 |
| 5.2.3.2 基因突变株△1526生理性状测定 |
| 5.2.3.3 基因突变株△1526细胞形态电镜分析 |
| 5.2.4 PYCH_15260序列及功能分析 |
| 5.2.4.1 PYCH_15260序列分析 |
| 5.2.4.2 PYCH_15260蛋白结构模拟 |
| 5.2.4.3 PYCH_15260功能网络分析 |
| 5.2.5 PYCH_15260功能网络相关基因转录水平分析 |
| 5.2.6 △1526氨基酸利用分析 |
| 5.2.7 △1526不同碱基组成培养实验 |
| 5.2.8 PYCH_15260参与假定的嘌呤核苷酸补救合成途径 |
| 5.2.9 80 MPa下△1526 iTRAQ定量蛋白质组分析 |
| 5.2.10 △1526在高静水压(80MPa)下的代谢路径 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 结论、创新点与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1 .本研究相关质粒图谱 |
| 附录2 .Thermococcales t RNAGln序列比对 |
| 附录3 .iTRAQ鉴定蛋白分子量分布图 |
| 附录4 .iTRAQ鉴定特异性肽段数目分布图 |
| 附录5 .△1526VSA2显着上调蛋白 |
| 附录6 .△1526VSA2显着下调蛋白 |
| 附录7 .蛋白表达纯化 |
| 附录8 .△pygTA细胞形态电镜分析 |
| 附录9 .PygTA提高带有古菌质粒复制蛋白质粒稳定性平板照片 |
| 附录10 .△PYG1不同条件下比生长速率 |
| 附录11 .主要仪器设备 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
（6）转AhDREB1基因杂种毛白杨盐胁迫响应与生物安全性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本文缩略词(Abbreviation) |
| 引言 |
| 1. 国内外耐盐转基因育种相关研究进展 |
| 1.1 植物的耐盐机理研究 |
| 1.1.1 植物的耐盐机制 |
| 1.1.2 不同耐盐机制的相关基因 |
| 1.2 杨树耐盐碱相关转基因育种研究 |
| 1.2.1 Na~+/H~+逆向蛋白运转基因 |
| 1.2.2 活性氧清除的酶类基因 |
| 1.2.3 胚胎发育晚期丰富蛋白 |
| 1.2.4 DREB转录因子 |
| 1.2.5 多基因转化育种 |
| 1.3 外源基因的非预期效应 |
| 1.3.1 外源基因非预期效应的类型 |
| 1.3.2 外源基因非预期效应的评估内容及检测方法 |
| 1.4 转基因植株田间稳定性及安全性 |
| 1.4.1 转基因林木田间外源基因表达稳定性 |
| 1.4.2 转基因植株的安全性监测 |
| 1.5 研究内容、技术路线与拟解决的主要问题 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 技术路线图 |
| 1.5.3 拟解决问题 |
| 2. AhDREB1转基因毛白杨耐盐机理及非预期效应的分析 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 盆栽盐胁迫试验设计 |
| 2.1.3 基质盐分的测定 |
| 2.1.4 植株增长量的测定 |
| 2.1.5 叶绿素含量和光合参数测定 |
| 2.1.6 电解质渗透率(RCE)和丙二醛(MDA)的测定 |
| 2.1.7 脯氨酸、超氧物歧化酶、过氧化物酶活性的测定 |
| 2.1.8 AhDREB1转基因毛白杨cDNA文库建立和转录组测序 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同盐胁迫处理下的转基因和非转基因毛白杨生长量 |
| 2.2.2 不同盐胁迫处理下的转基因和非转基因毛白杨REC和MDA的含量 |
| 2.2.3 不同盐胁迫处理下的转基因和非转基因毛白杨叶片的Pro含量,SOD活性,POD活性、叶绿素含量变化的测定结果 |
| 2.2.4 不同盐胁迫处理下的转基因和非转基因光合参数测定 |
| 2.2.5 转录组测序结果 |
| 2.2.6 差异基因的筛选及注释 |
| 2.3 小结 |
| 3 多耐盐碱基因共转化载体构建及遗传转化银腺杨84K |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 菌种与载体 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 溶液、培养基配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 柽柳TaMnSOD等耐盐碱基因及拟南芥RD29A基因启动子克隆 |
| 3.2.2 多基因共转化载体构建 |
| 3.2.3 多基因共表达载体遗传转化银腺杨84K |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 TaMnSOD,TaLEA,AtNHX基因及RD29A启动子片段的克隆 |
| 3.3.2 克隆片段测序结果与公布序列结果对比 |
| 3.3.3 多基因共转化载体3452A-SDLN的PCR验证 |
| 3.3.4 多基因共转化载体3452A-SDLN的测序验证 |
| 3.3.5 多耐盐碱基因遗传共转化银腺杨84K |
| 3.4 小结 |
| 4. AhDREB1转基因植株多年田间稳定性及安全性监测试验 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料与试验地信息 |
| 4.1.2 转基因毛白杨外源基因稳定性的检测 |
| 4.1.3 转基因毛白杨化感作用分析 |
| 4.1.4 转基因毛白杨林下土壤微生物多样性检测 |
| 4.1.5 外源基因水平转移监测 |
| 4.1.6 外源基因在叶片中的降解速度检测 |
| 4.1.7 转基因毛白杨花粉可育性分析 |
| 4.1.8 数据分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 田间多年种植后外源基因稳定性检测结果 |
| 4.2.2 转基因杨树叶片化感作用检测结果 |
| 4.2.3 对转基因杨树外源基因水平转移情况分析 |
| 4.2.4 转基因杨树林下土壤微生物多样性检测 |
| 4.2.5 转基因杨树叶片降解叶片中外源基因残留情况监测 |
| 4.2.6 对成熟转基因毛白杨花粉可育性分析 |
| 4.3 小结 |
| 5 讨论 |
| 5.1 AhDREB1转基因毛白杨的耐盐机制及非预期效应分析 |
| 5.2 多耐盐基因共转化对受体植株耐盐能力的改良的效果 |
| 5.3 田间多年种植的转基因毛白杨外源基因表达量下降 |
| 5.4 田间多年种植的AhDREB1转基因毛白杨没有发现潜在危害 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ |
| 附录Ⅱ |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录 |
| 致谢 |
（7）大肠杆菌碳源代谢及氧化应答与自然遗传转化的相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 前言 |
| 1 水平基因转移的意义 |
| 2 细菌转化 |
| 3 自然遗传转化 |
| 3.1 自然转化的起源与目的学说 |
| 3.2 感受态的建立机制 |
| 3.3 DNA摄取机制 |
| 4 大肠杆菌自然遗传转化 |
| 4.1 低浓度钙离子条件下的转化 |
| 4.2 平板条件下的自然转化 |
| 4.3 大肠杆菌感受态同源基因的研究 |
| 4.4 本研究组建立的自然遗传转化体系 |
| 5 固相基质表面应答及与自然遗传转化的关系 |
| 6 本研究的目的和意义 |
| 第二章 营养条件对自然遗传转化的影响 |
| 1 引言 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 培养基和溶液 |
| 1.3 实验仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 质粒提取 |
| 2.2 转化体系 |
| 2.3 碳氮源对自然遗传转化的影响实验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 碳源对自然遗传转化的影响 |
| 3.2 氮源对自然遗传转化的影响 |
| 3.3 碳氮比对自然遗传转化的影响 |
| 3.4 丰富营养及寡营养与自然遗传转化的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 cAMP-CRP对自然遗传转化的影响 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 菌株、质粒和引物 |
| 2.2 培养基和溶液 |
| 2.3 实验仪器和试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 总蛋白含量测定 |
| 3.2 cAMP含量测定 |
| 3.3 大肠杆菌人工转化方法 |
| 3.4 crp回补质粒及回补菌株的构建 |
| 3.5 β-半乳糖苷酶活性测定 |
| 3.6 pRPZ质粒浓度检测 |
| 3.7 Western Blotting方法检测RpoS蛋白含量 |
| 3.8 构建CRP结合位点突变的rpoS表达载体 |
| 3.9 一步法基因敲除 |
| 3.10 诱导型表达质粒pARA构建 |
| 3.11 单基因敲除菌株鉴定 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 碳源转运代谢协同PTS对自然遗传转化的作用 |
| 4.2 碳源与cAMP的关系以及对自然遗传转化的影响 |
| 4.3 cAMP-CRP对自然遗传转化具有抑制作用 |
| 4.4 cAMP-CRP对rpoS的调控方式研究 |
| 4.5 cAMP-CRP对自然遗传转化的抑制作用与rpoS的关系 |
| 4.6 碳源对rpoS表达的影响 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 围绕rpoS调控通路和其他通路的探索 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 菌株、质粒和引物 |
| 2.2 实验仪器和试剂 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 rpoS上下游相关基因的筛选 |
| 4.2 氧化压力相关基因的筛选 |
| 4.3 其他相关通路基因的筛选 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第五章 氧化压力对自然遗传转化的作用 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 菌株、质粒和引物 |
| 2.2 实验仪器和试剂 |
| 3 实验方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 氧化压力相关基因缺失对自然遗传转化的影响 |
| 4.2 过氧化氢及超氧化物对自然遗传转化的作用 |
| 4.3 胞内铁离子与ROS的协同效应与自然遗传转化的关系 |
| 4.4 过氧化氢对人工转化的影响 |
| 4.5 rpoS、oxyR及与自然遗传转化之间的关系 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间科研成果 |
| 致谢 |
（8）枯草芽胞杆菌的细胞间遗传重组现象及芽胞杆菌中的缺陷性原噬菌体（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 自然界中的水平基因转移现象 |
| 1.1 水平基因转移的概念 |
| 1.2 水平基因转移的途径 |
| 1.2.1 转化及其发生机制 |
| 1.2.2 接合及其发生机制 |
| 1.2.3 转导及其发生机制 |
| 1.2.4 基因转移因子(GTAs)介导的水平基因转移过程 |
| 1.2.5 其它水平基因转移方式 |
| 1.3 环境中供体DNA的贮存方式之一—缺陷性原噬菌体 |
| 1.4 枯草芽胞杆菌简介 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 2 枯草芽胞杆菌(B.subtilis)细胞间的遗传重组过程特性研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 药品和试剂 |
| 2.1.3 培养基和溶液配制 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.1.5 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 E.coli质粒提取 |
| 2.2.2 B.subtilis质粒提取 |
| 2.2.3 B.subtilis基因组提取 |
| 2.2.4 E.coli感受态制备及转化 |
| 2.2.5 B.subtilis转化方法 |
| 2.2.6 B.subtilis细胞间遗传重组实验 |
| 2.2.7 B.subtilis相关基因敲除突变株的构建 |
| 2.2.8 B.subtilis培养液上清中DNA提取 |
| 2.2.9 缺陷性原噬菌体的诱导及浓度检测 |
| 2.2.10 B.subtilis细胞破碎方法 |
| 2.2.11 相关酶使用方法 |
| 2.2.12 U型管中进行的B.subtilis细胞间遗传重组实验 |
| 2.2.13 微孔滤膜上进行的B.subtilis细胞间遗传重组实验 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 B.subtilis细胞间的遗传重组现象 |
| 2.3.2 B.subtilis细胞间的遗传重组现象具有普遍性 |
| 2.3.3 DNase对B.subtilis细胞间遗传重组过程的影响 |
| 2.3.4 GTA类似因子—缺陷性原噬菌体PBSX对B.subtilis细胞间遗传重组过程的影响 |
| 2.3.5 供体菌活菌数对B.subtilis细胞间遗传重组过程的影响 |
| 2.3.6 人工提取DNA与供体细胞中DNA转移效率比较 |
| 2.3.7 细胞间的直接接触对B.subtilis细胞间遗传重组过程的重要性 |
| 2.3.8 B.subtilis胞间遗传重组过程不同于接合 |
| 2.3.9 微孔滤膜上进行的B.subtilis细胞间遗传重组过程 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 3 B.subtilis中PBSX类缺陷性原噬菌体的普遍性调查 |
| 3.1 实验材料和方法 |
| 3.1.1 实验菌株 |
| 3.1.2 实验材料及溶液配制 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.1.4 PBSX类缺陷性原噬菌体的检测 |
| 3.1.5 裂解液上清电镜观察 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 4 短小芽胞杆菌(B.pumilus)CCTCC AB94180中的缺陷性原噬菌体PBP180 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 药品和试剂 |
| 4.1.3 培养基和溶液配制 |
| 4.1.4 引物 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 淀粉水解实验 |
| 4.2.2 硝酸盐还原实验 |
| 4.2.3 马尿酸盐水解实验 |
| 4.2.4 Phusion聚合酶高保真扩增长片段DNA PCR体系 |
| 4.2.5 噬菌体样品诱导及纯化 |
| 4.2.6 SDS-PAGE |
| 4.2.7 氨基酸序列同源性比对方法 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 B.pumilus AB94180菌种鉴定 |
| 4.3.2 B.pumilus AB94180中缺陷性原噬菌体PBP180的诱导及形态观察 |
| 4.3.3 缺陷性原噬菌体PBP180包裹的DNA检测 |
| 4.3.4 缺陷性原噬菌体PBP180杀菌谱 |
| 4.3.5 缺陷性原噬菌体PBP180的结构蛋白及质谱分析 |
| 4.3.6 缺陷性原噬菌体PBP180编码基因预测及分析 |
| 4.3.7 缺陷性原噬菌体PBP180与PBSX及B.pumilis AB94044和SAFR-032缺陷噬菌体编码原件比较分析 |
| 4.4 小结及讨论 |
| 研究总结与展望 |
| 参考文献 |
| 博士研究生期间科研成果 |
| 致谢 |
（9）RpoS在大肠杆菌自然遗传转化中的功能研究（论文提纲范文）
| 本研究工作的主要创新点 |
| 目录 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1 概述 |
| 2 大肠杆菌自然遗传转化 |
| 2.1 细菌自然遗传转化 |
| 2.2 大肠杆菌遗传转化 |
| 2.3 大肠杆菌自然遗传转化 |
| 3 普遍压力应答因子σ~S |
| 3.1 RpoS概述 |
| 3.2 RpoS的调控 |
| 3.3 RpoS在自然转化中的研究 |
| 4 固相基质对自然遗传转化的影响 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第2章 RpoS在大肠杆菌自然遗传转化中的作用 |
| 1 导言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株、培养基和质粒 |
| 2.2 实验器材和试剂 |
| 2.3 质粒提取方法和DNA凝胶回收方法 |
| 2.4 大肠杆菌转化 |
| 2.5 转化子生存能力的检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 自然遗传转化能力的评价 |
| 3.2 RpoS对大肠杆菌自然遗传转化的影响 |
| 3.3 RpoS对大肠杆菌其他转化形式的影响 |
| 3.4 RpoS对转化子在压力环境下生存能力的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第3章 固体平板培养时期RpoS对大肠杆菌自然遗传转化的影响 |
| 1 导言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株、培养基和质粒 |
| 2.2 实验器材和试剂 |
| 2.3 DNA酶终止转化实验 |
| 2.4 rpoS启动子活性分析 |
| 2.5 Western Blotting方法 |
| 2.6 不同时期改变RpoS表达量的实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 RpoS抗原制备 |
| 3.2 DNA摄取时与RpoS存在与否无关 |
| 3.3 DNA摄取时的RpoS表达量不影响转化能力的改变 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第4章 RpoS在液体培养时期对大肠杆菌建立自然感受态的影响 |
| 1 导言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株、培养基和质粒 |
| 2.2 实验器材和试剂 |
| 2.3 Western Blotting方法 |
| 2.4 不同时期改变RpoS表达量的实验 |
| 3 结果 |
| 3.1 振荡培养时期RpoS对自然感受态形成的影响 |
| 3.2 不同振荡培养时间对大肠杆菌自然感受态形成的影响 |
| 3.3 RpoS在静置培养时期对大肠杆菌自然感受态形成的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第5章 单核苷酸衍生物对大肠杆菌遗传转化的作用研究 |
| 1 导言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 菌株、培养基和质粒 |
| 2.2 实验器材和试剂 |
| 2.3 转化方法 |
| 2.4 β-内酰胺酶活性的测定 |
| 2.5 胞内AMP含量的测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 单核苷酸衍生物AMP对大肠杆菌人工转化的影响 |
| 3.2 AMP影响人工转化与RpoS影响自然转化的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 读研期间取得的科研成果 |
| 科研论文 |
| 会议论文 |
| 致谢 |
（10）叶绿体基因工程与植物细胞器基因组进化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 细胞器基因组的发现和起源 |
| 1.2 叶绿体基因工程研究 |
| 1.3 本课题主要研究内容 |
| 2 小麦叶绿体遗传转化体系的建立 |
| 2.1 绪言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 人干扰素α-2b 基因在烟草中的表达研究 |
| 3.1 绪言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 4 植物核基因组与细胞器基因组在进化中的基因转移研究 |
| 4.1 绪言 |
| 4.2 实验数据和方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 全文总结 |
| 5.1 主要研究成果 |
| 5.2 本文的特色与创新之处 |
| 5.3 有待继续开展的工作 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录1 攻读学位期间发表的论文目录 |
| 附录2 主要符号与缩略词表 |
| 附录3 培养基母液的配方 |
| 附录4 已测序植物物种数据信息 |
四、细菌遗传转化与水平基因转移（论文参考文献）
- [1]长穗偃麦草抗赤霉病基因Fhb7的图位克隆及功能解析[D]. 葛文扬. 山东农业大学, 2021(01)
- [2]谷子基因编辑体系的建立及香味基因SiBADH2突变体的获得[D]. 陈冰. 中国农业科学院, 2020
- [3]枯草芽胞杆菌质粒遗传转化的研究[D]. 赵蕊. 武汉大学, 2020(03)
- [4]橡胶树白粉菌遗传转化体系的构建及内源启动子筛选与鉴定研究[D]. 王义. 海南大学, 2019(06)
- [5]深海来源嗜压、超嗜热古菌Pyrococcus yayanosii基因组岛PYG1的特征及生理功能研究[D]. 李臻. 上海交通大学, 2017(05)
- [6]转AhDREB1基因杂种毛白杨盐胁迫响应与生物安全性研究[D]. 卢楠. 北京林业大学, 2017(04)
- [7]大肠杆菌碳源代谢及氧化应答与自然遗传转化的相关性研究[D]. 郭萌月. 武汉大学, 2015(03)
- [8]枯草芽胞杆菌的细胞间遗传重组现象及芽胞杆菌中的缺陷性原噬菌体[D]. 晋婷婷. 武汉大学, 2013(07)
- [9]RpoS在大肠杆菌自然遗传转化中的功能研究[D]. 张研. 武汉大学, 2013(09)
- [10]叶绿体基因工程与植物细胞器基因组进化研究[D]. 崔翠菊. 华中科技大学, 2010(07)